DE2616939A1 - Verfahren zur herstellung loeslichen kollagens - Google Patents
Verfahren zur herstellung loeslichen kollagensInfo
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Description
- Verfahren zur Herstellung löslichen Kollagens
- Lösliches Kollagen, das eine biologische Vorstufe des reifen Kollagens darstellt, wird seit einigen Jahren in zunehi.ndem Maße als Wirkstoffkomponente in kosmetischen Präparaten verarbeitet. Derartige Präparate sollen durch percutane Zufuhr biologischer Wirkstoffe den Stoffwechsel der Haut- und Bindegewebszellen beleben und welke, faltige Haut durch Erhöhung des Hautturgors wieder straffen. Kollagen ist ein faserförmiges Scleroprotein, das in Knochen und im Bindegewebe der Tiere enthalten ist. Entsprechend wird Kollagen durch Extraktion aus dem Bindegewebe meist embryonaler oder junger Säugetiere gtronnen. Die Beschaffung des Rohmaterials ist jedoch wegen der benötigten Menge teuer und zudem meist mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, da es möglichst frisch und frei von nicht verwertbaren Abfällen und anderen Verunreinigungen sein muß.
- Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, die bei der iiierstellung von Placentaextrakten anfallenden Rückstände für die Gewinnung des löslichen Kollagens zu nutzen.
- Nachdem der Nachweis erbracht werden konnte, daß die bis jetzt als wertlos verworfenen Placentarückstände einen für die Gewinnung ausreichenden Kollagengehalt aufweisen, war das Rohstoffproblem gelöst, da die Placentarückstände bei der Extraktherstellung in großer Menge anfallen und zudem weitgehend frei von Verunreinigungen sind.
- Bei der Gewinnung des löslichen Kollagens ist es zzeckmäßig, nach dem Reinigungsverfahren, durch das vorhandene Fremdeiweißstoffe weitgehend entfernt werden, zunächst die neutralsalzlösliche Vorstufe des nativen Kollagens zu extrahieren und auszusalzen, da diese neutralsalzlösliche Vorstufe des nativen Kollagens wegen seiner geringen inter- und intramolekularen Quervernetzung besonders förderlich für den biologischen Aktivierungsprozeß ist.
- Aus den verbleibenden Rückständen kann anschließend noch das säurelösliche Kollagen als weitere biologische Vorstufe des nativen Kollagens extrahiert und ausgesalzt werden, das zwar nicht mehr die gleiche revitalisierende Wirkung wie die neutralsalzlösliche Vorstufe aufweist, dafür aber in wesentlich größeren Mengen anfällt.
- Das ausgefällte lösliche Kollagen wird schließlich noch einmal einem speziellen Reinigungsverfahren unterworfen, wobei es vorzugsweise in einer Pufferlösung aus Placentaextrakt gelöst wird. Auf diese Weise erhält man unmittelbar einen haltbaren kollagenhaltigen Placentaextrakt, der bevorzugt zur Herstellung von Hautpflegemitteln Verwendung findet.
- Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungs beipielen näher erläutert.
- Vor Durchführung der präparativen Versuche zur Gerinnung von löslichem Kollagen aus Placentarückständen der Extrakt-Fabrikation war zunächst der Nachweis zu führen, daß überhaupt biologisch aktives Kollagen im Ausgangsmaterial vorhanden ist, und der Gesamtkollagengehalt (lösliches und unlösliches Kollagen) zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden Proben eines ätherhaltigen Placentarückstandes aus der Fabrikation auf der Stufe der Gewinnung des Rohzentrifugates gefriergetrocknet, genau gewogen (Tabelle 1) und jede Probe mit 4 ml 6n HCl in einem verschlossenen Reagenzglas 24 Stunden auf 1020 erhitzt, um die Probe zu hydrolysieren. Nachdem das Hydrolysat nochmals 9 Stunden mit 100 ml 6n HCl unter Rückfluß erhitzt worden war, wurde zur Trockne eingedampft und eine bekannte Menge Wasser hinzugefügt (Tabelle 1: 500 bzw. 624 ml). 1 ml dieser Lösung wurde zur Hydroxyprolin-Bestimmung nach der Methode von Logan und Neumann verwendet. Die Meßergebnisse sind in Tabelle 1 sowie in den Abb. 1 und 2 zusammengestellt.
- Tabelle 1: Versuchsdaten zur Bestimmung des Kollagengehaltes von Placentarückständen (Faktor 13,5 zur Berechnung des Kollagengehaltes) Einwaage Wasser Extinktion Hydroxy Kollagen hinzu- des Hydroly- prolin g gefügt sates mit ml PAB bex nf xx) 560 nm ) 0,1543 500,31 0,212 12,25 29,4 0,166 624,0 0,172 9,9 27,6 0,147 624,0 0,154 8,9 28,0 x) Mittelwerte xx) nach Eichkurve Abb. 1 Abb. 2 Abb. 1 zeigt das sichtbare Spektrum der Farbe, die durch die Reaktion des Hydrolysates mit p-Aminobenzaldehyd (PAB) erzeugt worden ist. Abb. 2 gibt das in entsprechender Weise unter Verwendung von 13,4 t Hydroxyprolin gemessene Spektrum. Die Übereinstimmung der Kurven von Abb. 1 und 2 bestätigt, daß die Placentarückstände Hydroxyprolin im Hydrolysat enthalten, das durch Spaltung des Kollagens entstanden ist. Unter Verwendung des Faktors 13,5 errechnet sich der Kollagengehalt der Proben zu 28 bis 29 % (Tabelle 1).
- Beispiel 1: Gewinnung löslichen Kollagens aus Placentarückständen der Fabrikation von Placentaextrakten 320 kg Placentarückstände, die bei der Gewinnung von Placentafrischextrakt nach Abtrennung des Rohextraktes beim Zentrifugieren anfallen, werden - ggf. nach Gefriertrocknen - erneut zerkleinert und mit 300 kg Eiswasser bei Oo bis + 30 C gewaschen. Nach Zentrifugieren (30 Min., 4000 rpm) wird der Rückstand nach Zusatz einer kleineren Menge Toluol zur Verhinderung einer eventuellen bakteriellen Tätigkeit 24 Stunden mit 500 kg einer 0,01 molaren Natriumchlorid-Lösung von PH 7,4 (Phosphat-Puffer: 152 g Na2HP04 und 18,5 g NaH2PO4 auf 70 1 Wasser) bei 0 bis 30 stehengelassen. Der nach einstündigem Zentrifugieren bei 4000 rpm erhaltene Rückstand wird zur Gewinnung des neutralsalzlöslichen Kollagens 4 Tage bei 0 bis + 30 mit 0,15 molarer Natriumchlorid-Lösung bei PH 7,1 extrahiert (Toluolzusatz) und dann zentrifuD t: Zentrifugat A.
- Aus diesem Zentrifugat A wird das neutralsalzlösliche Kollagen durch Zugabe von festem Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 12 % bei + 20 ausgefällt und abzentrifugiert. Eine Reinigung des ausgefällten neutralsalzlöslichen Kollagens kann durch Dialyse und ggf. mehrmalige Umfällung erfolgen. Vor Herstellung einer haltbaren konservierten Endlösung des neutralsalzlöslichen Kollagens wird, wie unten beschrieben, der Kollagengehalt durch eine Hydroxyprolin-Bestimmung ermittelt. Das isolierte, gereinigte neutralsalzlösliche Kollagen wird in einer solchen Menge 0,1 molarer konservierter Citrat-Pufferlösung gelöst, daß der Kollagengehalt 4 g pro Liter beträgt. Vor Sterilabfüllung wird die so erhaltene Kollagenlösung noch einmal zentrifugiert.
- Der bei der Gewinnung von Zentrifugat A verbleibende Rückstand wird zur Isolierung säurelöslichen Kollagens nach Toluol-Zusatz mit 100 kg Citrat-Puffer von PH ,7 (die Pufferlösung ist durch Auflösen von 21 kg Zitronensäure und 4,4 kg NaOH in 1000 kg Eiswasser hergestellt und auf PH 3,7feineingestellt worden)unter Rühren in der Kälte bei + 20 extrahiert und nach 2 bis 5 Tagen erneut zentrifugiert: Zentrifugat B 1.
- Der Rückstand dieser Zentrifugation wird erneut bei 0 + 2 bis + 40 mit 1000 Liter Citrat-Puffer der oben angegebenen Zusammensetzung ausgezogen und dann ebenfalls nach einigen Tagen zentrifugiert: Zentrifugat B 2.
- Die Zentrifugate B 1 und B 2 werden1 jedes für sich, zur Abtrennung der Kollagen-Fraktion durch Zugabe von Natriumchlorid auf eine Konzentration von 7 % NaCl 0 gebracht, wobei immer noch eine Temperatur von + 2 bis + 30 eingehalten wird Der erhaltene Niederschlag jeder Fällung wird durch Zentrifugieren oder Filtration in der Kälte gesammelt und durch Waschen mit Eiswasser von Salzen befreit. Eine weitere Reinigung der Kollagen-Fraktion kann durch Dialyse oder/und Umfällen aus neutralem oder saurem Milieu erfolgen. Nach der Reinigung wird die Kollagen-Fraktion unter Rühren in eine 0,1 molare Natriumcitrat-Pufferlösung gebracht, die 0,2 bis 0,5 % Konservierungsmittel, z. B. Phenonip, 1 bis 5 % Tween 80 und 0,3 bis 2 46 Propylenglykole enthält. Diese Lösung wird ggf.
- nochmals zentrifugiert bzw. filtriert und bei 20 C aufbewahrt.
- Vor der Herstellung eines haltbaren konservierten säurelöslichen Kollagenpräparates wird von je einer Probe des Kollagens aus Zentrifugat B 1 und B 2 zur Ermittlung des Kolla gengehalt es eine Hydroxyprolin-Bestimmung durchgeführt: Eine nach erneutem Zentrifugieren gefriergetrocknete Probe hatte in vorliegendem Fall ein Gewicht von 2,13 g. Davon werden 7,1 mg für eine Zeit von 24 Stunden mit 2 ml 6n HCl bei 1020 im verschlossenen Reagenzglas hydrolisiert. Die Farbbildung des Hydrolysates mit p-Aminobenzaldehyd (PAB) ergab eine Extinktion von 0,194, was nach der aufgestellten Eichkurve einem Hydroxyprolin-Gehalt von 11,2 t entspricht.
- Die Analysenprobe enthielt demnach 0,248 g Kollagen.
- Beispiel 2: Herstellung eines kollagenhaltigen Placentaextraktes durch Auflösen von Kollagen in einem Placentaextrakt als Pufferlösung Neutralsalzlösliches bzw. säurelösliches Kollagen, wie aus Beispiel 1, kann nach Reinigung (Dialyse, Umfällen) anstatt in einer Citrat-Puffer- oder Essigsäure-Lösung auch in Placentaextrakten, die entsprechend gepuffert sind, aufgelöst werden. Zum Beispiel läßt sich ein 0,3 bis 0,4 % Kollagen enthaltender Placentaextrakt von PH 4,0 erhalten, in dem eine nach Hydroxyprolin-Bestimmung charakterisierte Kollagenmenge bei + 10 unter Rühren in einen standardisierten Placentaextrakt eingerührt wird, der folgende Kennzahlen aufweist: PH 4,0 Trockenrückstand zu o,6 % Stickstoff 0,031 % Aminosäuregehalt > 3 mg pro ml Nachgewiesene Aminosäuren Gly, Ala, Val, Tyr, Ser, Phe, Try, Asp, Glu, Leu, Iso-Leu, Arg, Met, His, Pro OH-Pro u. a.
- Nachgewiesene Stoffwechsel-Aktivitäten: Atmungssteigerungsfaktor (02-Verbrauch des Leberhomogenats = 1,0) 1,9 P/O-Quotient vor Bestimmung des 02-Verbrauchs 2,7 nach Bestimmung des 02-Verbrauchs 2,8 Gärungssteigerungsfaktor (C02-Entwicklung von Bäcker-Hefe nach 20 Minuten 1,0) 1,6 Sterilitätstest negativ Konservierungsinittel >0,4 % Abschließend wird in dem kollagenhaltigen Placentaextrakt der Kollagengehalt nochmals durch Hydroxyprolin-Bestimmung kontrolliert und ggf. auf einen angestrebten Wert korrigiert: Kollagengehalt im allgemeinen 0,3 bis 0,4 ,.
- Die Anteile von niedermolekularen Komponenten zu hochmolekularen (Molekulargewicht < 10.000 bzw > 100.000) liegen im allgemeinen bei 5 : 1 bis 9 : 1. Das Kollagen läßt sich, ggf. nach Ausblenden einiger Komponenten des Placentaextraktes, auch durch Aufnahme eines UV-Spektrums charakterisieren: A max. bei 255 nm. Auch der Gesamtstickstoffwert nach Kjeldahl eignet sich zur Charakerisierung in Verbindung mit der Hydroxyprolin-Bestimmung und unter Berücksichtung der durch den Placentaextrakt eingebrachten Stickstoffverbindungen.
Claims (5)
- PATENTANSPRÜCHE Verfahren zur Herstellung löslichen Kollagens, dadurch gekennzeichnet, daß als Ausgangsmaterial die bei der Gewinnung von Placentaextrakten anfallenden Rückstände verwendet werden.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückstände bei 0 bis 30 C zunächst durch Waschen mit einer gepufferten schwachen NaCl-Lösung von einem Teil der vorhandenen Fremdeiweißstoffe befreit und durch Zugabe einer ausreichenden Menge einer Neutral salzlösung innerhalb von 2 bis 6 Tagen extrahiert werden und daß anschließend das neutralsalzlösliche Kollagen nach Abtrennung der restlichen Placentarückstände durch Aussalzen mit einer ausreichenden Menge Kochsalz gefällt wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die restlichen Placentarückstände mit Citrat-Puffer bei O bis 30 C und während i bis 4 Tagen extrahiert werden und anschließend das säurelösliche Kollagen ausgesalzt wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das ausgefällte lösliche Kollagen nach seiner weitgehenden Reinigung von restlichen Fremdeiweißstoffen in einer ein Konservierungsmittel enthaltenen Pufferlösung mit einem pH-Wert< 7 gelöst wird0
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Pufferlösung ein Placentaextrakt verwendet wird.
Priority Applications (2)
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| DE19762616939 DE2616939C3 (de) | 1976-04-17 | 1976-04-17 | Verwendung von Placentaextraktrückständen und Verfahren zur Herstellung eines kollagenhaltigen Placentaextrakts |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19762616939 DE2616939C3 (de) | 1976-04-17 | 1976-04-17 | Verwendung von Placentaextraktrückständen und Verfahren zur Herstellung eines kollagenhaltigen Placentaextrakts |
Publications (3)
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2586703A1 (fr) * | 1985-09-02 | 1987-03-06 | Merieux Inst | Procede d'extraction de collagenes placentaires, collagenes obtenus notamment sous forme de gels ou de solutions et leurs applications |
| US4786436A (en) * | 1986-01-31 | 1988-11-22 | Bausch & Lomb Incorporated | Wetting solutions for contact lenses |
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| DE2405002A1 (de) * | 1974-02-02 | 1975-08-14 | Trommsdorff Fa H | Loeslichen natives kollagen aus humangewebe und verfahren zu dessen herstellung |
-
1976
- 1976-04-17 DE DE19762616939 patent/DE2616939C3/de not_active Expired
- 1976-08-09 BR BR7605189A patent/BR7605189A/pt unknown
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| US4786436A (en) * | 1986-01-31 | 1988-11-22 | Bausch & Lomb Incorporated | Wetting solutions for contact lenses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2616939B2 (de) | 1980-12-04 |
| BR7605189A (pt) | 1978-02-28 |
| DE2616939C3 (de) | 1981-10-15 |
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