DE2111518C3

DE2111518C3 - Hormonähnliche Substanz mit hypocalcämischer Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2111518C3
Application number: DE19712111518
Authority: DE
Inventors: Teizo Yokohama; Abe Jinnosuke; Take Teruo; Watanabe Susumu; Otani Masaru; Shizuoka; Higashi (Japan)
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1970-03-10
Filing date: 1971-03-10
Publication date: 1976-04-01

Description

35

Die Erfindung betrifft eine hormonähnliche Substanz init hypokalzämischer Wirkung bei Säugetieren und Menschen, die durch Extraktion aus endokrinen Drüsen der Aale von Anguilla-Arten isoliert wird, und ein Verfahren zur Extraktion dieser Substanz.

Es ist bekannt, daß Schilddrüsen und Nebenschilddrüsen bei Säugetieren im Cakiumstoffwechsel eine wichtige Rolle spielen. P. F. H i r s c h et al. berichteten in Endocrinology, Bd. 73 (1963), S. 244, über die Isolierung des Hormons Thyrocalcitonin, ein Hormon mit hypokalzämischer Wirkung bei Säugetieren, aus Rattenschilddrüsen. Es wurde festgestellt, daß Thyrocalcitonin auch in Schilddrüsen anderer Säugetiere, wie Hunde, Affen, Schweine und Rinder, und auch beim Menschen vorkommt.

Vor kurzem wurden dem Thyrocalcitonin analoge Polypeptide auch in anderen Organen gefunden, d. h. in einem Ultimobranchialkörper genannten Gewebe bei Vögeln, Fischen und Amphibien. Diese Substanzen wurden klinisch zur Behandlung von Osteopetrose und Alterskrankheiten verwendet.

Auf Grund der Tatsache, daß alle sekretierenden Gewebe, in denen diese Substanzen vorhanden sind, •ine positive Toluidinblau-Reaktion zeigen (sie werden fötlich-purpurn gefärbt), wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß in den Blutgefäßwänden der Vena cava, die entlang des Oesophagus des Aals in Richtung zum Herzen verläuft und an der Wand des Oesophagus haftet, ein Gewebe mit positiver Toluidinblau-Reaktion existiert. Bei Ratten, denen ein Extrakt dieses Gewebes verabreicht worden war, trat eine Senkung des Serumcalciumspiegels auf.

Außerdem wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß in der Perikardmembran des Aals ein sekretierendes Gewebe vorkommt, das den gleichen, vorstehend erwähnten Wirkstoff enthält. Die Existenz dieser Substanz in diesem sekretierenden Gewebe konnte jedoch nicht durch den Test mit der Toluidinblau-Färbung nachgewiesen werden. Soweit bekannt, war die Existenz von sekretierenden Geweben im Endokard von Vögeln, Fischen oder Amphibien nicht bekannt, die diesen Wirkstoff enthalten.

Die Serumcalcium-Werte und die Aktivität des hypokalzämisehen Hormons pro Einheit sekretierendes Gewebe von geschlechtsreifen, auf dem Weg zu den Laichplätzen befindlichen und jungen, noch nicht laichfähigen Aalen, die im November im Tone River gefangen worden waren, wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß bei erwachsenen Aalen im Vergleich zu den jungen Tieren sowohl die Calciumwerte als auch die Hormonaktivität gering sind.

Nr.	Gewicht	Serum-	Aktivität,
		calcium-	MRC
		spiegel	U/Drüse
	(g)	(mg/100 ml)
1	115	13,3	4,3
Junge Aale 2	159	13,0	3,1
3	140	14,2	5,6
4	192	11.4	1,5
Erwachsene Aale 5	200	12,4	0,9
6	205	12,8	2,8

Auf Grund dieser Tatsachen wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß der Hormongehalt im genannten

sekretierenden Gewebe von Aalen in einem gewissen Wachstumsstadium zeitweise ansteigt, wenn die Aale in Seewasser oder in einer Salzlösung ähnlicher Zusammensetzung gezüchtet werden. Pro Einheit sekretierendes Gewebe kann ein Hormon mit hoher hypokalzämischer Wirkung gewonnen werden, wenn als Rohmaterial zur Extraktion das genannte sekretierende Gewebe von Aalen in diesem Wachstumsstadium verwendet wird.

F i g. 1 zeigt in einem Diagramm die Beziehung zwischen der Züchtungszeit (Tage) der Aale in mit Wasser im Verhältnis 1:1 verdünntem Meerwasser zum Serumcalciumspiegel und zum osmotischen Druck des Serums;

F i g. 2 zeigt die Beziehung zwischen Züchtungszeit (Tage) von Aalen in mit Wasser im Verhältnis 1:1 verdünnten Seewasser zur hypokalzämischen Aktivität pro Einheit sekretierendes Gewebe; die

F i g. 3 und 4 zeigen IR (in KBr)- und UV-Spektren der Substanz (199 μg/ml, λ ^° = 277 πιμ £}?„ = 8,04) mit 70 MRC U/mg;

F i g. 5 zeigt ein Elutionsdiagramm einer Gelfiltration an vernetztem Dextran (Sephadex ® G-75); vgl. Beispiel 2.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Substanzen sind Polypeptide, die insofern eng verwandt zum Thyrocalcitonin sind, als sie in der Lage sind, den Serumcalciumspiegel bei Säugetieren und Menschen
senken.

Die Substanzen werden als weiße Pulver erhalten und haben folgende Eigenschaften.

L Löslichkeit:

Löslich in Wasser, aber unlöslich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln.
2 Dialysierbarkeit, Filtration durch Membranfilter (Nihon Shinku Gijutsu K. K.):

Die Substanz geht durch ein für Substanzen mit ] einem Molekulargewicht von 10 000 oder darunter durchlässiges Filter, aber nicht durch ein für Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1000 oder darunter durchlässiges Filter.

1. Molekulargewicht:

3000 bis 4500.
Bestimmungsverfahren:

Rinderserumalbumin (Molekulargewicht 67 000) und Bacitracin (Molekulargewicht 1423) werden als Vergleichsubstanzen verwendet. Die Molekulargewichte der Substanzen der Erfindung werden durch Gelfiltration an vernetzten Dextranen (Sephadex® G-75, G-50 und G-25) je nach ihrer Elutionsgeschwindigkeit bestimmt.

4. Farbreaktion:

Ninhydrinreaktion, Sakaguchi-Reaktion, Diazoreaktion und Crieg-Liebig-Reaktion positiv.

5. Fällungsmittel:

Die Substanzen sind durch Zugabe von Fäüungsmitteln für Proteine, wie Trichloressigsäure und Perchlorsäure, ausfällbar.

6. Die Substanzen werden durch proteolytische Enzyme, wie Nagase und Chymotrypsin, inaktiviert. Bedingungen der Inaktivierung:

Die Substanzen der Erfindung werden in 0,01m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 2 Stunden bei 37° C mit dem Enzym in einem Gewichtsverhältnis von 1: umgesetzt.

7. Aminosäurenzusammensetzutig: Eine Probe von 150 g mit

von
MRC U/mg wird

einer Aktivität 24 Stunden bei HO⁰C

von mit

η-Salzsäure hydrolysiert.

30

Aminosäure μΜοΙ

Lysin 0,063

Histidin 0,0041

NH₃ 0,0816

Arginin 0,0256

Asparaginsäure 0,0638

Threonin 0,0229

Serin 0,0384

Glutaminsäure 0,0792

Prolin 0,0207

Glycin 0,0846

Alanin 0,0760

Halbcystin (—)

Valin 0,0807

Methionin —

Isoleucin 0,0312

Leucin 0,0641

Tyrosin 0,0052

Phenylalanin 0,0192

8. Laufstrecken der Produkte der Erfindung (es wurden die nachstehend in Beispiel 7 aufgeführten Produkte verwendet) bei der Disk-Elektrophorese sind in folgender Tabelle wiedergegeben:

Probe Α(100μ₈)

B (5(^g)

Ο(150μ₈) E (150 μκ)

Elektrophorese
bedingungen

3 mA, 60 min 8 mA, 435 min 6 mA, 80 min 6 mA, 40 min 6 mA, 40 min

Standardgel
(pH 8,9 bis 9,0)

Entwick- Tris-Glycinlungslösung Puffer

(pH-Wert 8,6)

Färbemittel Ponceauxrot
Laufstrecke 0 (Aufsetzstelle)
M. G. = Methylgrün.

saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)

Natriumacetat-Puffer (pH-Wert 4,7)

saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)

/9-Alanin-Essigsäure-Puffer (pH-Wert 5,0)

Amidoschwarz Ponceauxrot Rm.g. = 0,4—0,45 Rm.g. = 0,5 saures Gel mit
6-m Harnstoff
(pH-Wert 4,4)

/3-Alanin-Essigsäure-Puffer
(pH-Wert 5,0)

Ponceauxrot
Rm.g. = 0,5

saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)

/3-Alanin-Essigsäuie-Puffer (pH-Wert 5,0)

Ponceauxrot Rm.g. = 0,5

9. Wurde die Substanz der Erfindung an Testtiere (männliche Ratten) verabreicht, so wurde zusätzlich zur Senkung des Blutcalciumspiegels eine Verminderung des Phosphor- und Magnesiumgehaltes des Bluts beobachtet.

10. Die in der Verbindung der Erfindung enthaltenen Disulfidbrücken sind nicht oxydationsbeständig und unter stark alkalischen Bedingungen instabil.

65

11. Spezifische Drehung:

[a] I³ = -20° (c = 0,4%, H₂O) (123 MRC U/mg Probe)

12. Dünnschichtchromatographie:

Probe (61 MRC U/mg). Laufmittel: n-Butanol zu Pyridin zu Wasser zu Essigsäure = 15: 10:12: Träger: Abizel® (Asahi Kasei Kogyo Kabushiki

Kaisha). Entwicklungsmittel: Daidon-Smith-Reagens. Laufstrecke: R_t = 0,48 bis 0,71.

Verfahren zur Extraktion der Substanz der Erfindung 1. Rohmaterial

(a) Teil des Blutgefäßes der Vena cava des Aals, die entlang dem Oesophagus zum Herzen verläuft und an der Oesophaguswand haftet.

Vorzugsweise wird der Teil des Oesophagus vor und nach dem Herzen in gleicher Länge herausgeschnitten, z. B. in einer Länge von etwa 2 cm in jeder Richtung. Das so gewonnene Gewebe kann entweder direkt oder in Form eines entfetteten und getrockneten Produktes verwendet werden. Das entfettete und getrocknete Produkt kann nach bekannten Verfahren gewonnen werden. Um Spurenmengen von Metallionen, einschließlich Calciumionen, zu beseitigen, ist es wünschenswert, bei diesem Verfahren Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton zu verwenden. Zum Beispiel wird das genannte Gewebe des Aals durch längeres Eintauchen in Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton entwässert und anschließend mit Chloroform entfettet. Das entstandene Produkt wird wieder längere Zeit in Aceton

ίο getaucht und dann an der Luft getrocknet.

(b) Als Rohmaterial zur Extraktion können das Herz oder das Perikardmembran von Aalen direkt ohne weitere Behandlung verwendet werden. Vorzugsweise werden sie jedoch in Form eines getrockneten Produktes verwendet. Diese erhält man auf die gleiche Weise wie unter (a) angegeben.

Verteilung von Geweben im Aal, die den Wirkstoff enthalten

Gewebe

Gewicht (mg)

U/Gewebe	mU/Gcwebe	mU/Protein (N)
	(mg)	(W!)
1,6	9,4	5,9
6,6	61,5	26,5
9,6	40,1	38,7

(a) Gewebe mit der am Oesopha- 170,3
gus haftenden Vena cava

(b) Perikardmembran 107,7
(a) + (b) 239,6

Die hypokalzämische Aktivität der aus Aalen gewonnenen hormonähnlichen Substanz, d. h. der nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren bestimmte Wert der Calcitonin-Aktivität, ausgedrückt pro 1 kg Körpergewicht, wurde mit den Weiten von sekretierenden Geweben anderer Tiere verglichen, die bei D.H. Copp, CO. Parkins: »Pharathyroid Hormone and Thyrocalcitonin (Calcitonin)« Amsterdam Excerpta Media Foundation (1968), S. 78, angegeben sind. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die aus dem sekretierenden Gewebe eines Aals extrahierte hormonähnliche Substanz mit hypokalzämischer Wirkung eine sehr hohe Aktivität zeigt, wenn man den erhaltenen Wert auf 1 kg Körpergewicht umrechnet. Man kann aus der Tabelle z. B. entnehmen, daß zur Gewinnung eines Wirkstoffes der Erfindung mit einer

Calcitonin-Aktivität, die dem aus der Schilddrüse eines Schweines gewonnenen Thyrocalcitonin entspricht, etwa 2 bis 4 Aale ausreichen.

	Sekre tiefendes Gewebe	mU/Gewebe	mU/Körper- gewicht dkg)
Ratte (rattus rattus)	Schilddrüse	100—300	200—800
Schwein (sus scrofa)	desgl.	2OOOO--4OOOO	250—500
Hund (canis familiaris)	desgl.	5 000—20 000	400—800
Huhn (gallus domestica)	Ultiinobranchialdrüsen	200—700	500—800
Truthahn (meleagra gallapavo)	desgl.	2 200	450—900
Wildente (pseudemys concinna suwaniensis)	desgl.	4—10	3—9
Frosch (rana catesbeiana)	desgl.	0,4	1—2
Lachs (oncorhynchus seta)	desgl.	1000—1500	100—200
Hai (squalus suckleyi)	desgl.	500—1000	250—500
Aal (anguilia japonica)	Perikardmembran und Gewebe	9 550	39 750

mit der am Oesophagus haftenden Vena cava

Die Bestimmung der hypokalzämischen Wirkung der hormonähnlichen Substanz, die aus dem sekretierenden Gewebe von Aalen gewonnen wurde, wurde nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren

DerExtrakt der durch Behandlung eines ein SekKtionS gan enthaltenden Gewebes eines Aals in Γ ho⁸ _monähnliche Substanz mit hy^kalz*

SSS wird mit einer 0,1 n

individuelle Unterschiede bestehen. Gewebe mit der am Oesophagus haftenden Vena cava aus der Nähe des Herzens und aus der Perikardmembran von Aalen, die in Seewasser oder Salzlösung weiter gezüchtet worden waren, und von solchen, die nicht weiter gezüchtet worden waren, wurden gewonnen, und dann wurde deren Aktivität pro Einheit sekretierendes Gewebe, Körpergewicht und ProteinstickstofT bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß die Aktivität in jedem Fall auf das 2- bis 3fache angestiegen ist, was darauf zurückzuführen ist, daß die Aale in Meerwasser oder einer Salzlösung ähnlicher Zusammensetzung gehalten wurden.

MRC

mU/Protein (N), μ (Folin-Methode)

MRC MRC

U/Gewebe mU/mg

Auf die f ^u _Wcrte

entstehen. Männlichen R^fV^tlw

die^r Lösungen intramuskulär ins

gleiche Weise, wie oben an gegeben/^we

des Serumcalciumspiegels »" ^^

Grund der hypol alzam.schen Aktivita^ü

Standard werden die entsprechenden We™ _k

monähnlichen Substanz im genannten Aa₁

bestimmt. . · Meerwasser oder

^Die ff.^JS'Ä 'Zusammensetzung einer Salzlosung mit ahniicne^r _künst.

gezüchtet. Bdspicls^« ta^M^r^.^^^ liches Meerwasser oder Sakwaswr ve _wasser

Im allgemeinen können Aale sowoni ^

als auch in Süßwasser leben. Jedoch «e wasser gefangene Aale leicht, ^n«*^ wasser oder in Salzlösungen ™<'™ ^™ _gebracht licher Salzkonzentration wie .^^^eerwasser werden. Es ist deshalb .vomghenj«.M ^ _der zu verdünnen oder die SalzKonzci wäßrigen Salzlösung so zu waWen^d. ^e _also gezüchteten Aale nicht sterben. Die AaW _io

in einer wäßrigen Lösung mit einer S^_n. die etwa einem Drittel b.s zwei ^Dr*^teln °£_{htet werd}en. tration von Meerwasser entspricht. gezucMe ^

Auf diese Weise steigt die Calcitonjnλ sekretierenden Gewebe ze.twe.se an wenj. d in Meerwasser oder einer *»°"^, ^SeS- ^ln ähnlicher Zusammensetzung ^""X_{n zü}chtungszeit F i g. 1 ist die Beziehung ^^e^f Wassef ver-(Tage) von Aalen .n ^wf *^e "iSSum-Wert und dünntem Meerwasser zum f*™™™ wiedergegeben, zum osmotischen Druck des Serums w ^ ^ Sowohl der Serumcalcium-Wert als au _der

tische Druck steigen bis ^ ^T^nachJBg_p . Züchtung und beginnen dann zu' »J*™ _Substanz

gezeigt ist, steigt die Akt.v.tat ^ά" ™^T™™_angssimCr als pro Einheit des sekretierenden Gewebes lang der Serumcalcium-Wert oder der °smoUsen an und erreicht 10 bis 15 Tage^ch Zuchtu g^ ^

den maximalen wert. fln*,..,c.

vität wieder zu fallen. _d Zeitpunkt,

Demgemäß ist es "^"^'imum erreicht, an dem der Calcitonin-XVert «"JJS Gewebe aus zu bestimmen, und danridas «g£j*«nde dem Aal zu ^-nnen Dje ZucMunß _untef ^

7iiir<:wiri<;c etwa 10 DIS W 1 dfc,¹-' « 5,2

50%Meer- 6^6-9,2 29,7-53,0 7,6-11,5 wasser

*5 i/₃Meer- 5,8-9,0 30,1-51,2 8,1-12,3

wasser

(Züchtungszeit: 13 Tage)

Da jedoch die extrahierte Flüssigkeit verschiedene Fremproteine enthält, wird die Flüssigkeit unter Anwendung üblicher Verfahren zur Entfernung der Fremdproteine weiter gereinigt. Ein Verfahren zur Entfernung dieser Fremproteine besteht in ihrer 35 Fällung. Hierbei werden die ausgefällten Fremdproteine gleichzeitig mit anderen im Extrakt vorhandenen Feststoffen entfernt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß dieses Verfahren auf einen flüssigen Extrakt angewendet wird, der nach dem Entfernen der 40 Feststoffe aus dem Extrakt erhalten wird. Außerdem kann das genannte rohe Pulver diesem Reinigungsverfahren unterzogen werden. Es kann jedes übliche Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Proteinen herangezogen werden.
⁴⁵ 2. Extraktion

Die erwähnten Rohprodukte werden zuerst einer Extraktionsbehandlung unterzogen.

Als Lösungsmittel zur Extraktion können Gemische 50 aus Wasser und hydrophilen organischen Lösungsmitteln verwendet werden, z. B. Alkohole mit 1 bi; 4 C-Atomen, Aceton, Phenol, Dioxan, Pyridin, Tetra hydrofuran, Methoxyäthanol, Dimethylformamid ode Dimethylsulfoxid. Es können auch verdünnte Säuren 55 z. B. Salzsäure, Essigsäure oder Oxalsäure, ode Wasser verwendet werden.

Der Wassergehalt dieser wäßrigen LösiingsmitU muß ausreichend sein, um die vorhandene hormor ähnliche Substanz (Molgewicht 3000 bis 4500) löse 60 zu können. Im allgemeinen genügen 5 bis 15 Volumer prozent Wasser, doch kann die Menge in Abhängij keit vom verwendeten Lösungsmittel variiert werde. Vorzugsweise wird cir.c 4- bis Snola«·- Harnstofflösur als Extraktionslösung verwendet. Vorzugsweise werde diese Lösungen mit Reduktionsmitteln, wie Cyste; oder Vitamin C, versetzt, um eine Oxydation währer des Extraktionsvorganges zu vermeiden. Als ein b vorzugtes, typisches Beispiel sei ein Lösungsmittt

609614/-

10

gemisch aus 8m Harnstoff, 0,1 n-Cystein und 0,2 η-Salzsäure erwähnt.

Zur Extraktion genügt es., das Rohmaterial bei normaler Temperatur in das Extraktionslösungsmittel zu geben und zu rühren.

gewonnen. Das Material wurde 3mal durch jeweils 5stündiges Eintauchen bei 5⁰C in 3 Liter 90 mg Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton entwässert. Das entwässerte Gewebe wurde anschließend durch dreimaliges, jeweils 2stündiges Eintauchen bei 5°C in 2 Liter Chloroform entfettet. Anschließend wurde der genannte Entwässerungsschritt unter Ver-Wendung von je 2 Liter Aceton 3mal wiederholt. Das erhaltene entfettete Material wurde an der Luft

3. Reinigung

Der nach Abtrennung und Entfernung von aus Gewebsfragmenten des Rohmaterials stammenden

Feststoffen erhaltene flüssige Extrakt wird unter ver- io getrocknet. Man erhielt 110 g trockenes Pulver,

mindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. HOg des so erhaltenen trockenen Pulvers wurden

Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt. der Extraktion unterworfen, wobei das Produkt bei

Man kann den bei der Extraktion (2) erhaltenen normaler Temperatur in 1 Liter 480 g Harnstoff und

Extrakt auch wie folgt reinigen: 17,5 g Cystein enthaltende 0,2 η-Salzsäure gegeben

a) Die verschiedenen Fremdproteine werden durch 15 und 2 Stunden gerührt wurde. Der entstandene flüssige

il Ek d i i i Gih Aton

Extrakt wurde mit 2 Liter eines Gemisches aus Aceton und Essigsäure (1 : 1) und außerdem mit einem Gemisch aus 28 ml 1 molarer Kochsalzlösung und 3 Liter Aceton versetzt und zur Ausfällung der Fremdproteine gründlich gerührt. Sodann wurden die Fremdproteine 15 Minuten bei 9000 U/Min, abzentrifugiert. Die überstehende, klare Flüssigkeit wurde mit 5 Liter peroxydfreiem Äther versetzt und gründlich gerührt, wobei ein Niederschlag aus Proteinen niedrigeren

) p

Zusatz von hydrophilen organischen Lösungsmitteln, z. B. Alkoholen mit 1 bis 4 C-Atomen, Aceton, Phenol, Dioxan, Pyridin, Tetrahydrofuran, Methoxyäthanol. Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, aus dem Extrakt ausgefällt.

b) Lösliche anorganische Salze, z. B. Natriumchlorid oder Ammoniumsulfat, können dem flüssigen Extrakt zugesetzt werden.

c) Durch Zugabe von Trichloressigsäure oder Per- g

chlorsäure zum flüssigen Extrakt wird ein Nieder- 25 Molekulargewichts auftrat, der hauptsächlich aus der schlag erhalten, der hauptsächlich aus der gewünschten gewünschten wirksamen Substanz bestand. Der Niederwirksamen Substanz besteht. Wird der Niederschlag schlag wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei in Wasser dispergiert, so löst sich der wirksame Be- 9000 U/Min, gewonnen. Er wurde 2mal mit 400 ml standteil in Wasser. Durch Entfernen des unlöslichen eines Gemisches aus Äther und Aceton (1:1) geRückstandes kann die Reinheit des wirksamen Be- 3° waschen und dann in 1 Liter 1,75 g Cystein enthaltenstandteils auf das 2- bis 5fache des vorhergehenden der 20prozentiger Essigsäure gelöst. Diese Lösung Reinheitsgrades verbessert werden. Ist der pH-Wert wurde mit 50 g Kochsalz versetzt. Die Endkonzendes Wassers zu niedrig, so werden verschiedene Fremd- tration betrug somit 5 %. Die Lösung wurde zur Ausproteine in unerwünschter Weise in Lösung gebracht. fällung von Verunreinigungen gründlich gerührt und Bei zu hohem pH-Wert werden die im wirksamen 35 der Niederschlag durch 15minütiges Zentrifugieren

fi bi

Bestandteil vorhandenen Disulfidbrücken aufgespalten. Der pH-Wert des Wassers wird deshalb am besten auf 5,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,0, eingestellt, um eine Entfernung der verschiedenen Fremdproteine zu erreichen.

Die Entfernung der Fremdproteine aus der rohen. wirksamen Substanz kann durch Gelfiltration unter Verwendung von Polyacrylamidgelen oder durch Tonenaustauschchromatographie unter Verwendung

g
bei 9000 U/Min, entfernt.

Die überstehende, klare Flüssigkeit wurde mit 170 ml 45%iger Trichloressigsäure versetzt. Die Endkonzentration betrug somit 7,5%. Dabei begann die gewünschte wirksame Substanz auszufallen. Dei Niederschlag wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei 9000 U/Min, gewonnen, mit 200 ml Äther gewaschen und in 500 ml 0,02 η-Salzsäure gelöst. Die den gewünschten Wirkstoff enthaltende salz-

h l

g g ghten Wirkstoff en

von Ionenaustauschern auf Basis von vernetzten Dex- 45 saure Lösung wurde auf eine mit Austauscherharz aul tränen mit funktionalen ionischen Gruppen erreicht Basis eines vernetzten Polystyrolgerüsts mit Trialkyl· werden. Als Ionenaustauscher können auch Carboxy- ammoniumendgruppen beschickte Säule (2 χ 30 cm' methyl-Cellulose oder Diäthylaminoäthyl-Cellulose gegeben. Die Säule hatte eine Durchflußgeschwindig verwendet werden. keit von 150 ml/Stunde. An diesem Ionenaustauscher

Die nach dem Entfernen der verschiedenen Fremd- 50 harz wurden die verschiedenen, in der Lösung enthal proteine erhaltene Flüssigkeit enthält Salze. Sie wird tenen Salze absorbiert. Schließlich wurde die Säul< daher üblicherweise unter Verwendung von Ionen- i

austauscherharzen oder nach anderen üblichen Verfahren entsalzt. Die so behandelte Flüssigkeit wird eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält ein Pulver, das hauptsächlich aus der gewünschten aktiven Substanz besteht. Die nach diesem Verfahren erhaltene Substanz kann weiter gereinigt werden, z. B. durch Gelfiltration, Elektrophorese, Gegenstromverteilung oder Dünnschichtchromatographie.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 Stufe A

Aus 2000 Aalen der Art Anguilla japonica wurden aus dem Stück der am Oesophagus haftenden Vena cava, das in der Nähe des Herzens liegt, 505 g Gewebe

mit 50 ml destilliertem Wasser eluiert. Es wurde eii salzfreies, den gewünschten Wirkstoff enthaltende: Eluat erhalten. Das Eluat wurde eingedampft und ge friergetrocknet. Es wurden 800 mg einer pulver förmigen Substanz mit hypokalzämischer Wirkuni erhalten.

60

65

Stufe B

Insgesamt 1.0 g pulverförmiger Substanz (6,5 MRC U/mg) aus mehreren Ansätzen der Stufe A wurden 11 100 ml eines Gemisches aus Butanoi, essigsäure uns Wasser (60:15: 25) dispergiert und durch einstündige Rühren bei 4°C extrahiert. Anschließend wurde de Extrakt mit 30 ml Butanoi, 110 ml Wasser um 3,75 ml Pyridin versetzt. Das entstandene Gemiscl wurde gerührt und anschließend stehengelassen, wöbe sich die Lösung in zwei Phasen trennte. Die ober

11 12

Butanolphase, in der der Hauptteil des gewünschten chrom C (Molekulargewicht 12 750) werden als

Wirkstoffes enthalten war, wurde von der unteren Vergleichssubstanzcn verwendet. Die Molekular-

Phase abgetrennt. Die untere Phase wurde mit 100 ml gewichte der Substanzen der Erfindung werden

der oberen Schicht eines Gemisches aus Butanol, durch Gelfiltration an vernetzten Dextranen

Essigsäure, Wasser und Pyridin (6:1:9:0,25) ver- 5 (Sephadex® G-50) und je nach ihrer Elutionsge-

setzt. Das Gemisch wurde umgerührt und stehen- schwindigkeit bestimmt.

gelassen. Das Gemisch trennte sich in zwei Phasen. Die

obere Butanolphase wurde abgetrennt. Die untere ^4- farbreaktion:

Phase wurde weitere dreimal nach dem vorgenannten Ninhydrinreaktion, Sakaguchi-Reaktion, Diazo-

Verfahren behandelt. Die so abgetrennten oberen 10 reaktion und Rydon-Smith-Reaktion positiv.

Phasen wurden vereinigt und unter vermindertem 5 Die Substanzen werden durch proteolytische

Druck eingedampft. Das eingedampfte Produkt wurde Enzyme, wie Subtilopeptidase A und Chymo-

mit Äther gewaschen und dann in 25 ml Wasser gelöst. trypsin, inaktiviert.

Die Lösung wurde gefriergetrocknet. Man erhielt _. .. . . . . .

105 mg eines Pulvers. ₁₅ Bedingungen der Inaktivierung:

Anschließend wurden 105 mg des so erhaltenen Die Substanzen der Erfindung werden in 0,01-m

Pulvers in 5 ml 0,2-m Ammoniumacetatlösung vom Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 2 Stunden bei 37° C

pH-Wert 4,7 gelöst. Die Lösung wurde auf eine mit mit dem Enzym in einem Gewichtsverhältnis von 1: 50

einem Ionenaustauscher auf Basis vernetztes Dextrane umgesetzt,

beschickte Säule (2,0 χ 80 cm), die mit 0,2-m Ammo- 20 , . .

niumacetatlösung vom pH-Wert 4,7 äquilibriert wor- ⁶· Aminosaurenzusammensetzung:

den war, aufgesetzt und mit einer Geschwindigkeit Eine Probe von 150 μg wird 24 Stunden bei 110⁰C

von 12 ml/Stunde mit dem genannten Puffer eluiert. mit 6 η-Salzsäure hydrolysiert.

Das entstandene Eluat wurde in Fraktionen von 4 ml . . ...

, , · 1 ■ 1 »1 -j Aminosäure μΜοι

gesammelt. Die biologische Aktivität einer jeden 45 . JI - ,

Fraktion wurde an Ratten bestimmt. Es stellte sich u-^a- λ nnii

heraus, daß der gewünschte Wirkstoff mit den Frak- Histidin u.uwi

tionen Nr. 65 bis 85 eluiert wurde. Deshalb wurden Arginin U,Ui3ö

diese Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Asparaginsäure U.UöJS

Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhielt 30 inreonm η n,al

24 mg (98 MRC U/mg) pulverförmigen Wirkstoff. cTuLunsäure''.'.".'.".'.'. \'.'.'.'. \'.'.'.'.'. 0,07«

Stufe C Prolin 0,0207

Anschließend wurden 24 mg des Pulvers in 1 ml ^GIyc!ⁿ

0,01-m Ammoniumformiatlösung vom pH-Wert 4,37 35 ™^a^"ⁿ \

gelöst. Die Lösung wurde auf eine mit Carboxymethyl- MaiDcystin

cellulose (CMC) beschickte Säule (l,0x 5,0 cm) ge- 7™?.· ·: ;

geben und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von Metnionin η rmo

4,5 ml/Stunde schrittweise mit 70 ml 0,01 m Ammo- Isoleucin U₁UJIi

niumformiatlösung vom pH-Wert 4,37, 60 ml 0,01- 40 i:^eucnl

bis 0,2-m Ammoniumformiatlösung, 30 ml 0,2-m Am- i,^?!'' "■

moniumformiatlösung und 40 ml 2,0-m Ammonium- !Phenylalanin

foirniatlösung eluiert. Das erhaltene Eluat wurde in ' ryptopnan ) (bpuren)

Fraktionen von je 2 ml gesammelt. Die Fraktionen *) Hydrolyse mit einer 4-m Ba(OH)j-Lösung 50 Stunden bei

Nr. 50 bis 65, in denen die Substanz mit Calcitonin- 45 ¹¹⁰°^{C in eincm} geschlossenen Röhrchen. Wirkung eluiert wurde, wie durch Bestimmung der

biologischen Aktivität der einzelnen Fraktionen fest- '■ =>pezinscne urehung:

gestellt wurde, wurden vereinigt. Die vereinigten [«] ? = — 20° (c = 0,4% H₁O). Fraktionen wurden unter vermindertem Druck einge-

dampft und dann gefriergetrocknet. Es wurden 12 mg 50 ⁸· Uisk-blektrophorese:

(220 MRC U/mg) eines hormonähnlichen Wirkstoffes Probe: 150 μ-g; Bedingungen: 6 mA 40 und 80 MiinPulverform erhalten, nuten; Gel: saures Gel mit 6-m Harnstoff: _. ._. , , ,. „ , . . Laufpuffer: ß-Alanin-Essigsäurepuffer; Anfärbe Die Eigenschaften dieser Substanz sind: mittel:Ponceauxrot;Laufstrecke: Rw.^gron = 0,f

1. Weißes Pulver. 55 _Λ -.- , - , ι u·

9. Dunnschichtchromatographie:

2. Löslichkeit: Laufmittel: n-Butanol zu Pyridin zu Wasser z\ Löslich in Wasser, aber unlöslich in verschiedenen Essigsäure = 15:10:12: 3; Träger: Abize organischen Lösungsmitteln, wie Benzol, Hexan (Asahi Kassi Kogyo Kabushiki Kaisha); Ent und Tetrachlorhohlenstoff. 60 wicklungsmittel: Rydon-Smith-Reagens; Lauf

. , strecke: Rt = 0,46 bis 0,71.

■>. MoieKuiargcwiCiii:

4000 bis 4500. B e i s ρ i e 1 2

_ . ,. 1000 Aale der Art Anguillajaponica wurden 12 Tag

Bestimmungsverfahren: _{65 bei} ^o _c _{in künstlich} hergestelltem Meerwasser mi

Cobalamin (Molekulargewicht 1355), Glucagon einer Meerwasserkonzentration von 50% (Vant Hoff

(Molekulargewicht 3485), Thyrocalcitomin vom künstliches Meerwasser) gehalten. Anschließend wurd

Schwein (Molekulargewicht 3600) und Cyto- das Vena-cava-Gewebe am Oesophagus in der Näh

des Herzens und die Perikardmembran entfernt. Das so gewonnene Rohmaterial wurde zweimal entwässert. Dabei wurde es 5 Stunden bei 5°C in 1500 ml. 30 mg Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton getaucht. Anschließend wurde das entwässerte Produkt zweimal entfettet, wobei es 2 Stunden bei 5°C in 1200 ml Chloroform getaucht wurde. Dann wurde weitere zweimal unter den gleichen Bedingungen, aber unter Verwendung von 1200 ml Aceton entwässert. Das entwässerte Produkt wurde an der Luft getrocknet. Es entstanden 75 g (Aktivität: 235 MRC U/mg) getrocknetes Produkt. 75 g getrocknetes Produkt wurden durch Dispergieren in einem Gemisch aus 225 ml Butanol, 150 ml Pyridin, 45 ml Essigsäure und 180 ml Wasser unter Rühren 24 Stunden bei 50⁰C extrahiert.

Das erhaltene Gemisch wurde durch Gaze und Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 50⁰C konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in 200 ml Wasser aufgenommen und zur Entfernung der unlöslichen Bestandteile 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Der klare Überstand wurde gefriergetrocknet. Es wurden 400 mg pulverförmiger Wirkstoff (9 MRC U/mg) erhalten.

400 mg des oben hergestellten Wirkstoffes wurden in 50 ml 0,2 n-Ammoniumazetatlösung (pH 4,7) gelöst. Diese Lösung wurde auf eine mit der genannten Ammoniumazetatlösung gepufferte Säule (7,5 X 90 cm) mit vernetztem Dextran (Sephadex G-75) gegeben. Die Elution wird mit der genannten Ammoniumazetatlösung bsi einer Geschwindigkeit von 127,5 ml/Stunde durchgeführt. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 15 ml gesammelt.

Die biologische Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde an Ratten bestimmt. Die Fraktionen Nr. 205 bis 225 wiesen eine hohe Aktivität bezüglich der Senkung des Serumkalziumspiegels auf. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Es wurden 12 mg (160 MRC U/mg) des Wirkstoffes erhalten. '

Die Eigenschaften der erhaltenen Substanz sind die gleichen wie im Beispiel 1 unter den Punkten 1 bis 5 und 7 bis 9, jedoch wurden unter Punkt 6 die folgenden Mengen an Aminosäuren gefunden:

45 Aminosäure μΜοΙΙ/mg

Lysin 6,97

Histidin 1,62

Arginin 5,35

Asparaginsäure 6,74

Threonin 3,96

Serin 5,58

Glutaminsäure 8,60

Prolin 17,20

Glycin 23,20

Alanin 11,10

Halbcystin 0,46

Valin 4,42

Methionin (Spuren)

Isoleucin 4,20

■ Leucin 6,32

Tyrosin 0,69

Phenylalanin 2,32

Tryptophan*) (Spuren)

*) Hydrolyse mit einer 4-m Ba(OH),-Lösung 50 Stunden bei ^6s 110°C in einem geschlossenen Röhrchen.

Beispiel 3

Aus etwa 1000 Aalen (Anguilla anguilla) wurden aus dem Stück der am Oesophagus haftenden Vena cava, das in der Nähe des Herzens und des Endocardiums liegt, Gewebestücke herausgeschnitten. Das derart erhaltene Rohmaterial wurde den gleichen Emfettungs- und Entwässerungsstufen wie im Beispiel 1 angegeben unterworfen. Man erhielt 75 g trockenes Pulver.

Das derart erhaltene trockene Pulver wurde in 750 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Butanol-Essigsäure-Wasser im Verhältnis 5:1:2 dispergiert. Durch 24stündiges Rühren bei 50° C wurde der Wirkstoff extrahiert. Das erhaltene Gemisch wurde durch Gaze und Filterpapier filtriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 50"C konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde zweimal mit je 50 ml Aceton und dreimal mit je 50 ml Chloroform gewaschen und dann in 75 ml 2 η-Salzsäure gelöst. Zur Abtrennung von Feststoffen wurde die Lösung 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 36 g Harnstoff versetzt und dann auf eine Säule (7,5 χ 90 cm) mit vernetztem Dextran (Sephadex G-75) gegeben und mit einer 0,1-m wäßrigen Ameisensäurelösung behandelt. Die Elution wurde mit der genannten Ameisensäurelösung bei einer Geschwindigkeit von 127,5 ml/Stunde durchgeführt. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 15 ml gesammelt.

Die biologische Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde an Ratten bestimmt. Die Fraktionen Nr. 205 bis 223 wiesen eine hohe Aktivität bezüglich der Senkung des Serumkalziumspiegels auf. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Es wurden 75 mg (60 MRC U/mg) des Wirkstoffes erhalten.

Die Eigenschaften der erhaltenen Substanzen sind die gleichen wie im Beispiel 1 unter den Punkten 1 bis 5 und 7 bis 9, jedoch wurden unter Punkt 6 die folgenden Mengen an Aminosäuren gefunden:

Aminosäure

μΜοΙ/mg

Lysin 5,18

Histidin 1,05

Arginin 6,60

Asparaginsäure 4,77

Threonin 4,10

Serin 4,67

Glutaminsäure 6,70

Prolin 14,50

Glycin 26,30

Alanin 12.60

Halbcystin 0^45

Valin 3,84

Methionin (Spuren)

Isoleucin 2,15

Leucin 5,20

Tyrosin 0,50

Phenylalanin 1,66

Tryptophan*) (Spuren)

*) Hydrolyse mit einer Ba(OH)₂-Lösung 50 Stunden bei 110⁰C in einem geschlossenen Röhrchen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Hormonähnliche Substanz mit hypokalzä- «lischer Wirkung, die durch Extrahieren mit einem S Lösungsmittelgemisch aus hydrophilen organischen lösungsmitteln und Wasser oder mit einer verdünnten Säure oder mit Wasser aus dem Herzen, insbesondere der Perikardmembian und/oder aus dem Vena-cava-Gewebe am Oesophagus in der Nähe des Herzens der Aale von Anguilla-Arten «der aus den daraus erhaltenen entfetteten Trockenprodukten und durch Entfernung der Fremdproteine aus dem entstandenen Extrakt oder aus einer durch Entfernen von Feststoffen aus dem Extrakt enthaltenen Flüssigkeit hergestellt worden ist.

2. Verfahren zur Herstellung einer hormonähnlichen Substanz mit hypokalzämischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man das Herz, insbesondere die Perikardmembran und/oder das ao Vena-cava-Gewebe am Oesophagus in der Nähe des Herzens der Aale von Anguilla-Arten oder daraus erhaltene entfettete Trockenprodukte mit einem Lösungsmittelgemisch aus hydrophilen organischen Lösungsmittel und Wasser oder mit einer as verdünnten Säure oder mit Wasser extrahiert und die Fremdproteine aus dem entstandenen Extrakt oder aus einer durch Entfernen von Feststoffen aus dem Extrakt erhaltenen Flüssigkeit entfernt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Aale 10 bis 17 Tage in Meerwasser oder einer Salzlösung von ähnlicher Zusammensetzung gehalten worden sind.