DE2507223C3 - Kollagenprodukt und Verfahren zur Herstellung des Kollagenproduktes - Google Patents
Kollagenprodukt und Verfahren zur Herstellung des KollagenproduktesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Kollagenprodukt, das Verfahren zu dessen Herstellung sowie Arzneimittel
und kosmetische Mittel, die dieses Produkt enthalten.
Kollagen ist ein Eiweißstoff, dessen Eigenschaften zum größten Teil bekannt sind (T r a u b, W. und P i e ζ,
K. A. in Avanc. Prot.Chem., 25, 243, Academic Press,
New York [1971]; Viidik, A., Intern. Rev. Conn. Tissue Res., 6, 127, Academic Press, New York (1973);
Ramachandran. G. N., und Hodge, A.G. in
»Treatise on Collagen«, Vol. I1S. 103 und 185, Academic
Press, London [1967]). Es ist bereits versucht worden, Kollagen zur Heilung von Wunden zu verwenden. Die
Ergebnisse dieser Versuche waren jedoch sehr wechselhaft und nicht reproduzierbar.
In nativem Zustand besteht das Kollagen aus drei Ketten (2 «i-Ketten, 1 (X2-KeUe), die helixartig ineinander
gebunden sind und die durch nichtkovalente Bindungen zusammengehalten werden. Dieses Kollagen
wird im folgenden als »monomeres Kollagen« bezeichnet. Einige oder eine ganze Reihe von »Molekülen« des
monomeren Kollagens können sich durch kovalente Bindungen miteinander verbinden, wodurch sogenanntes
»polymeres Kollagen« (enthaltend 2 bis etwa 4 Kollagen-Einheiten) und »hochpolymeres Kollagen«
(enthaltend mehr als 4 Kollagen-Einheiten) entsteht.
Es wurde nun gefunden, daß es zur Erzielung einer guten Wirkung mit Kollagen entscheidend darauf
ankommt, daß in den Kollagen enthaltenden Präparaten ein bestimmtes Verhältnis von monomerem zu polymerem
zu hochpolymerem Kollagen eingehalten wird.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eine Kollagenproduktes, das darin besteht,
daß man
a) Kollagen in einer Alkalisalzlösung, die eine Hexose oder Glycerin enthält, bei niederer Temperatur
rührt und die unlöslichen Bestandteile abtrennt, wobei man eine Lösung I, die monomeres Kollagen
enthält, und einen Rückstand A erhält,
b) den Rückstand A in 0,01- bis l.Omolarer Säure unter Zusatz von 0,5 bis 3% «-Ketoglutarsäure bei
Raumtemperatur rührt und anschließend die unlöslichen Bestandteile abtrennt, wobei man einen
Überstand II, der polymeres Kollagen enthält, und einen Rückstand B erhält,
c) den Rückstand B in einer wäßrigen Lösung, die 0,2
bis 8 Mol Urethan und gegebenenfalls 0,3 bis 8 Mol Harnstoff pro Liter enthält, oder in Trispuffer (pH
4,0 bis 8,0), der 0,05 bis 0,5 Mol/l Calciumchlorid enthält, rührt und zentrifugiert, wobei man das
hochpolymere Kollagen im Überstand III erhält, und
d) die Lösung I und die Überstände II und III getrennt durch Dialyse gegen Wasser oder durch Sättigung
mit Natriumchlorid ausfällt, die Niederschläge einzeln in einem physiologisch verträglichen Puffer
(pH 2 bis 7) suspendiert, und.die Lösungen so
mischt, daß das Verhältnis der Bestandteile I, Il und 111 zueinander (25 bis 50): (25 bis 50):(0 bis 40)
beträgt, und anschließend Prolin zusetzt, so daß der Prolingehalt bis zu 40% bezogen auf den
Gesamtgehalt an Aminosäuren nach der Hydrolyse beträgt.
Gegenstand der Erfindung sind weiter das nach dem gebildeten Verfahren erhaltene Produkt sowie Arzneimittel
und kosmetische Mittel, die aus dem neuen Kollagenprodukt sowie üblichen bekannten Zusätzen
bestehen.
Aus Ausgangsmaterial für die Herstellung des Produktes kann handelsübliches Kollagen verwendet
werden. Dieses ist stets ein Gemisch von monomerem, polymeren! und hochpolymerem Kollagen. Am besten
eignet sich ein Kollagen mit einem möglichst hohen Anteil an Monomerem, das aus jungen Tieren
gewonnen werden kann. Bei Kollagen aus alten Tieren kann der Anteil an Monomerem so gering sein, daß eine
Aufarbeitung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unwirtschaftlich wird.
Es kann zweckmäßig sein, das als Ausgangsmaterial verwendete Kollagen einem Reinigungsschritt zu
unterziehen, bevor man es gemäß der Erfindung aufarbeitet. Die Reinigung kann dadurch erfolgen, daß
man aus den Kollagenen Verunreinigungen z. B. mit einer Kochsalzlösung, die einen Komplexbildner enthält,
extrahiert.
Der erste Reaktionsschritt a) wird zweckmäßig bei 2-8°C durchgeführt. Die Alkalisalz-Konzentration
sollte nicht unter 0,01 Mol/l liegen, nach oben ist keine Grenze gesetzt.
Als Hexosen kommen insbesondere Glucose, Fructose und Galactose in Betracht, die vorzugsweise in einer
Menge von 0,05 bis 0,5 Mol/l verwendet werden. Geeignete Säuren für den Schritt b) sind z. B.
Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure und Oxalsäure. Besonders geeignet sind
Essigsäure und Milchsäure. Für den Schritt c) kommen als Urethane solche mit niederen Alkylgruppen,
besonders Äthylurethan, in einer Menge von normalerweise 0,2-5,0, vorzugsweise 1,5-2,5 Mol/l in Betracht.
Es hat sich als günstig erwiesen, zusätzlich Harnstoff in einer Menge von 0,3 — 8,0, vorzugsweise 0,5—1,5 Mol/l
zu der Urethanlösung zuzugeben. Der für d) verwendete Puffer sollte einen pH-Wert von 2 bis 7 besitzen und
0,01- bis l.Omolar sein. Zu seiner Herstellung können
alle geeigneten Salze und Säuren verwendet werden, die physiologisch verträglich sind. Besonders geeignet sind
Acetat- und Citrat-Puffer mit einem pH-Wert von 3,5 bis 6,0.
Es empfiehlt sich, zu der erhaltenen Lösung ein Antibiotikum zuzusetzen, um die Haltbarkeit zu
erhöhen. Es können auch weitere Substanzen wie z. B. Vitamine (Ascorbinsäure), Aminosäuren (Glycin,
D,L-Threonin, L-Cystein) oder Cu-, Zn- und Eisensalze zugesetzt werden.
Das neue, aus Kollagen erhaltene Produkt eignet sich sehr gut zur Behandlung offener Wunden, weil es die
Wundgranulation stark anregt. Auch für kosmetische Zwecke ist es wegen seiner feuchtigkeitsspendenden
und reparativen Wirkung gut verwendbar.
Beispiel 1
1. Vorreinigung des Kollagens
1. Vorreinigung des Kollagens
6 kg Kollagen werden in 201 deionisiertem Wasser, in
dem 4% EDTA (800 g) und 1% NaCI (200 g) gelöst sind, bei 40C 24 Stunden gerührt. Danach wird zentrifugiert.
Der Überstand wird verworfen.
a) Das vorgereinigte Kollagen (5,5 kg) wird in 1001
Wasser, in dem 1 kg Glucose und 1,5 kg NaCl gelöst sind, 24 Stunden bei 40C gerührt und anschließend
zentrifugiert. Der Überstand (1) wird aufbewahrt (801).
b) Der Rückstand (2,5 kg) wird mit 40 I 0,05 M
Essigsäure, in der 0,5% (200 g) «-Ketoglutarsäure enthalten sind, 24 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt und anschließend erneut zentrifugiert. Der Überstand (11) wird aufbewahrt (351).
c) Der Zentrifugierrückstand (1,5 kg) wird in 25 1 Wasser, in dem vorher 1,5 kg Harnstoff und 1,125
kg Äthylurethan gelöst sind, 24 Stunden bei 40C gerührt. Danach wird wieder zentrifugiert und der
Überstand (III) (20 I) aufbewahrt. Der Rückstand (400 g) wird verworfen.
d) Die Lösung I und die Überstände I, 11 und III
werden getrennt gegen Wasser dialysiert (40 Stunden bei 15°C). Die ausgefallenen Kollagenfasern
werden abgetrennt, in 0,1 M Zitratpuffer (pH 4,0) bei 4°C aufgenommen (1 in 45 1, II in 15 1,111 in
16,51) und zentrifugiert.
Es werden 40 Teile 1, 40 Teile II und 20 Teile III zusammengemischt und anschließend mit dem Zitratpuffer
1 :10 verdünnt. Die Gesamtkonzentration an I, U und III im Endprodukt liegt bei etwa 0,6%. Der Gehalt
an Prolin beträgt nach der Hydrolyse 15,7%. bezogen auf den Gesamtgehalt an Protein.
Das Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde in Schritt c) der Zentrifugierrückstand in 25 1 0,2 M
Trispuffer(pH 7,0), der 0,1 Mol/l CaCl2 enthielt, gerührt.
Die Ausbeute war dieselbe wie im Beispiel 1.
a) 5 kg Kollagen werden in 40 1 Wasser, in dem 1,136
kg Dinatriumhydrogenphosphat und 4 kg Glycerin gelöst sind, bei 80C 24 Stunden gerührt und
zentrifugiert. Der Überstand 1 wird aufbewahrt (301).
b) Der Rückstand (3,5 kg) wird mit 30 1 0,5 M Milchsäure und 300 g «Ketoglutarsäure 20 Stunden
bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zentrifugiert. Der Überstand II (20 1) wird
aufbewahrt.
c) Der Zentrifugierrückstand (2,2 kg) wird in 25 1 Wasser, in dem vorher 9 kg Äthylurethan gelöst
wurden, 24 Stunden bei 4°C gerührt. Danach wird zentrifugiert und der Überstand III aufbewahrt
(20 I).
d) Die Überstände I (301). II (201) und III (201) werden
getrennt mit NaCl gesättigt und bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Die ausgefallenen Kollagene
werden einzeln filtriert, mit kleinen Mengen Wasser gewaschen, gewogen und in je 5 1 0,1 M
Zitratpuffer (pH 4,5) gelöst. Die Lösungen I, II und UI werden so gemischt, daß das Gemisch
monomeres (I), polymeres (II) und hochpolymeres (111) Kollagen im Verhältnis 45 :45 :10 enthält.
Der Gehalt an Prolin beträgt nach der Hydrolyse 16,4%, bezogen auf den Gesamtgehalt an Protein.
Die nach den Beispielen 1, 2 und 3 erhaltenen Kollagenprodukte lassen sich direkt für medizinische
;md kosmetische Zwecke verwenden. Weitere Beispiele 0,5 g
für medizinische und kosmetische Zusammensetzungen 1,0 g
sind die folgenden:
A. 100 ml Lösung gemäß Beispiel 1 5
0,19gL-Pro!in
1,0 g Neomycinsulfat
B, 1(K) ml I Äsung gemäß Beispiel 2
0,22 g L-Prolin ι ο
0,5 g Glycin
0,5 g D,L-Threoriin
L-Cystein Neomycinsulfat
C. 100 ml Lösung gemäß Beispiel 3
0,23 g L-ProUn
0,5 g Glycin
0,5 g D,L-Threonin
0,5 g L-Cystein
0,1 g Ascorbinsäure
1,0 g Zn-SaIz
0,5 g Neomycinsulfat
0,5 g Bacitracin
Claims (4)
- Patentansprüche:2/1, Verfahren zur Herstellung eines Kollagenproduktes, dadurch gekennzeichnet, daß mana) Kollagen in einer Alkalisalzlösung, die eine Hexose oder Glycerin enthält, bei niedriger Temperatur rührt und die unlöslichen Bestandteile abtrennt, wobei man eine Lösung I1 die hauptsächlich monomeres Kollagen enthält, und einen Rückstand A erhält,b) den Rückstand A in 0,01-bis l.Omolarer Säure, insbesondere Essig- oder Milchsäure, unter Zusatz von 0,5 bis 3% «-Ketoglutarsäure bei Raumtemperatur rührt und anschließend die unlöslichen Bestandteile abtrennt, wobei man einen Überstand II, der polymeres Kollagen enthält, und einen Rückstand £ erhält,c) den Rückstand ß in einer wäßrigen Lösung, die 0,2 bis 8 Mol Urethan und gegebenenfalls 0,3 bis 8 Mol Harnstoff pro Liter enthält, oder in Trispuffer (pH 4,0 bis 8,0), der 0,05 bis 0,5 Mol/l Calciumchlorid enthält, rührt und zentrifugiert, wobei man das hochpolymere Kollagen im Überstand III erhält,undd) die Lösung I und die Überstände II und III getrennt durch Dialyse gegen Wasser oder durch Sättigung mit Natriumchlorid ausfällt, die Niederschläge einzeln in einem physiologisch verträglichen Puffer (pH 2 bis 7) suspendiert und die Lösungen so mischt, daß das Verhältnis der Bestandteile I, Il und III zueinander (25 bis 50): (25 bis 50):(0 bis 40) beträgt, und anschließend Prolin znsetzt, so daß der Prolingehalt bis zu 40% bezogen auf den Gesamtgehalt an Aminosäuren nach der Hydrolyse, beträgt.
- 2. Kollagenprodukt, erhalten durch ein Verfahren, bei dem mana) Kollagen in einer Alkalisalzlösung, die eine Hexose oder Glycerin enthält, bei niederer Temperatur rührt und die unlöslichen Bestandteile abtrennt, wobei man eine Lösung I, die hauptsächlich monomeres Kollagen enthält, und einen Rückstand A erhält,b) den Rückstand A in 0,01- bis l.Omolarer Säure, insbesonders Essig- oder Milchsäure, unter Zusatz von 0,5 bis 3% «-Ketoglutarsäure bei Raumtemperatur rührt und anschließend die unlöslichen Bestandteile abtrennt, wobei man einen Überstand II, der polymeres Kollagen enthält, und einen Rückstand ßerhält,c) den Rückstand B in einer wäßrigen Lösung, die 0,2 bis 8 Mol Urethan und gegebenenfalls 0,3 bis 8 Mol Harnstoff pro Liter enthält, oder in Trispuffer (pH 4,0 bis 8,0), der 0,05 bis 0,5 Mol/l Calciumchlorid enthält, rührt und zentrifugiert, wobei man das hochpolymere Kollagen im Überstand III erhält, undd) die Lösung I und die Überstände II und III getrennt durch Dialyse gegen Wasser oder durch Sättigung mit Natriumchlorid ausfällt, die Niederschläge einzeln in einem physiologisch verträglichen Puffer (pH 2 bis 7) suspendiert und die Lösungen so mischt, daß das Verhältnis der Bestandteile I, II und III zueinander (25 bis 50): (25 bis 50):(0 bis 40) beträgt, und anschließend Prolin zusetzt, so daß der Prolingehalt bis zu 40%, bezogen auf den Gesamtgehalt an Aminosäuren nach der Hydrolyse, beträgt,
- 3. Arzneimittel, bestehend aus dem Kollagenprodukt gemäß Anspruch 2 und üblichen bekannten Zusätzen.
- 4. Kosmetisches Mittel, bestehend aus dem Kollagenprodukt gemäß Anspruch 2 und üblichen bekannten Zusätzen.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19752507223 DE2507223C3 (de) | 1975-02-20 | Kollagenprodukt und Verfahren zur Herstellung des Kollagenproduktes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19752507223 DE2507223C3 (de) | 1975-02-20 | Kollagenprodukt und Verfahren zur Herstellung des Kollagenproduktes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2507223A1 DE2507223A1 (de) | 1976-09-02 |
| DE2507223B2 DE2507223B2 (de) | 1976-12-23 |
| DE2507223C3 true DE2507223C3 (de) | 1977-08-11 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5733884A (en) | 1995-11-07 | 1998-03-31 | Nestec Ltd. | Enteral formulation designed for optimized wound healing |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5733884A (en) | 1995-11-07 | 1998-03-31 | Nestec Ltd. | Enteral formulation designed for optimized wound healing |
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