CH641837A5 - Beta-galactosidase und verfahren zu deren herstellung. - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue ß-Galactosidase, welche wirksam ist zum Aufschluss oder zur Hydrolyse von Lactose zu Glucose und Galactose, und welche in saurem pH-Bereich, wie er in den Verdauungsorganen von Menschen vorherrscht, stabil ist und ebenfalls stabil ist beim Lagern bei Zimmertemperatur und erhöhten Temperaturen. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur fermentativen Erzeugung dieser neuen ß-Galactosidase durch Züchtung eines Mikroorganismus der Art Pénicillium und insbesondere Pénicillium multicolor.

ß-Galactosidase ist ein Enzym, welches die in der Milch von Säugetieren vorhandene Lactose zu Glucose und Galactose hydrolysiert. In den letzten Jahren erweckte dieses Enzym öffentliche Aufmerksamkeit, weil es nützlich ist zur Verbesserung oder therapeutischen Behandlung von Verdauungsstörungen bei Kindern, welche nicht befähigt sind, Lactose zu verdauen, und weil es ausserdem nützlich ist zur Verwendung bei der Verarbeitung verschiedener Milchprodukte.

•Einige Arten von ß-Galactosidase wurden bereits in kommerziellem Massstab erzeugt, wobei Verfahren verwendet wurden, bei denen ein Bakterium, eine Hefe oder ein Pilz gezüchtet und die gebildeten ß-Galactosidasen aus der Kultur oder der Kulturbrühe des Mikroorganismus isoliert werden. Alle bekannten ß-Galactosidasen sind jedoch nicht befriedigend, weil sie einen oder mehrere Nachteile bezüglich ihrer Aktivität und Stabilität sowie der erzielbaren Ausbeute aufweisen.

Bekannte ß-Galactosidasen, welche durch Mikroorganismen erzeugt werden, umfassen jene, welche durch Bakterien, wie Milchsäurebakterien, erzeugt werden und jene, welche durch Hefen, wie Saccharomyces Fragiiis gebildet werden. Diese bekannten ß-Galactosidasen, welche durch Bakterien und Hefen erzeugt werden, das interzellulare Enzym darstellen, welches erzeugt wird und innerhalb des Zellkörpers des Bakteriums oder der Hefe verbleibt, ist es notwendig, diese Enzyme aus dem Zellkörper der entsprechenden Mikroorganismen zu entfernen und zu extrahieren. Für die Herstellung dieser intercellularen Enzymprodukte ist daher eine Reihe von Verfahrensstufen notwendig, und ausserdem ist es schwierig, diese interzellularen Enzymprodukte in hohen Ausbeuten zu gewinnen.

Andererseits ist es bekannt, dass gewisse ß-Galactosidasen als extrazellulares Enzym durch Pilze der Art Aspergillus, wie zum Beispiel Aspergillus niger [siehe JA-AS 21078/74], Aspergillus oryzae [Vorveröffentlichung der JA-Patentanmeldung «Kokai», Nr. 151385/76], Aspergillus awamori [JA-AS 22709/74], durch Pilze der Art Macrophomina [Vorveröffentlichung der JA-Patentanmeldung «Kokai», Nr. 117677/76], durch Pilze der Art Sclerotium [Vorveröffentlichung der JA-Patentanmeldung «Kokai» Nr. 117677/74] und durch Pilze der Art Tricoderma [Vorveröffentlichung der JA-Patentanmeldung «Kokai», Nr. 62688/74.

Unter diesen bekannten ß-Galactosidasen, welche als extrazellulare Enzyme gebildet werden, sind jene, welche durch Aspergillus niger und Aspergillus awamori, sowie , durch Pilze der Art Sclerotium erzeugt werden, eine saure ß-Galactosidase, welche das höchste pH bei einem hochsauren pH-Wert von 2 bis 3,5 aufweisen und daher nur

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beschränkt Anwendung findet.

Ferner sind die bekannten ß-Galactosidasen, welche durch Aspergillus oryzae und durch Pilze der Art Macropho-mina oder der Art Tricoderma erzeugt werden, verschieden von der neuen ß-Galactosidase, welche durch Pénicillium multicolor gemäss der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, und zwar bezüglich ihrer optimalen Temperaturwerte, dem optimalen pH-Wert, dem Temperaturbereich und pH-Bereich, in welchem diese Enzyme stabil sind. Ausserdem weisen die oben genannten bekannten Pilze, mit Ausnahme von Apsergillus oryzae FERM-P 1680, eine sehr geringe Fähigkeit auf, die ß-Galactosidase als extrazellulares Enzym zu erzeugen.

Aspergillus oryzae FERM-P 1680 weist eine ziemlich hohe Fähigkeit zur Erzeugung von ß-Galactosidase in hoher Potenz auf, doch kann die durch diesen besonderen Stamm erzeugte ß-Galactosidase in saurem pH bei Werten von 2,5 bis 3,0 inaktiviert werden und zeigt daher eine niedrigere Stabilität bei sauren pH-Werten als die neue erfindungsgemässe ß-Galactosidase. Wenn die ß-Galactosidase aus Aspergillus oryzae FERM-P 1680 als verdauungsförderndes Arzneimittel Menschen verabreicht wird, ist sie oft wertlos, da sie sehr leicht bei einem pH-Wert von 2,5 bis 3,0, welcher üblicherweise in der Bauchhöhle vorherrscht, inaktiviert wird.

Im allgemeinen weisen die enzymatischen Präparate, welche eine bekannte ß-Galactosidase enthalten, eine niedere Stabilität bei der Lagerung auf, und es wurde ein Stabilisierungsverfahren für diese enzymatischen Präparate durch Gefriertrocknung [siehe JA-AS 50390/72 als Beispiel] und ein Stabilisierungsverfahren für diese enzymatischen Präparate durch Einverleibung von Inositol [siehe Vorveröffentlichung der JA-Patentanmeldung «Kokai», Nr. 9783/76] vorgeschlagen, um die Zersetzung der ß-Galactosidase zu verhindern.

Ausserdem ist es ebenfalls bekannt, dass Pénicillium fre-quentans Westling [identifiziert als FERM-P 3085] eine ß-Galactosidase erzeugt, welche bei einem pH-Wert von 3 bis 5 bei 4°C stabil ist, wobei der optimale pH 3,5 bis 4,5 beträgt; Pénicillium luteum Sopp [identifiziert als FERM-P 3091] erzeugt eine ß-Galactosidase, welche bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4°C stabil ist, wobei das optimale pH 4,0 bis 5,0 beträgt; Pénicillium citrinum ATCC 9849 [identifiziert als FERM-P 3086] erzeugt eine ß-Galactosidase, welche bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4°C stabil ist, wobei das optimale pH 4,0 bis 5,0 beträgt; Pénicillium glaucum Link [identifiziert als FERM-P 3090] erzeugt eine ß-Galactosidase, welche bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4°C stabil ist, mit einem optimalen pH bei 4,0 bis 5,0; Pénicillium chrysogenum Thom IFD 4626 [identifiziert als FERM-P 3088] erzeugt eine ß-Galactosidase, welche stabil ist bei einem pH-Wert von 3 bis 8 bei 4°C, wobei das optimale pH 4,0 bis 5,0 beträgt, und Pénicillium notatum Westling [identifiziert als FERM-P 3087] erzeugt eine ß-Galactosidase, welche bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4°C stabil ist, mit einem optimalen pH bei 4,0 bis 5,0. Diese Pénicillium-Arten können jedoch die oben genannten ß-Galactosidasen nur in sehr geringer Ausbeute erzeugen, welche nicht kommerziell befriedigend ist. Ausserdem sind die bekannten ß-Galactosidasen, welche durch diese Penicil-lium-Arten erzeugt werden, nicht vollständig befriedigend, weil sie bei pH-Werten von 2,5 bis 3,0, wie sie im menschlichen Magen vorherrschen, nicht stabil sind und weil sie durch Erhitzen auf eine erhöhte Temperatur von etwa 65 °C während 15 Minuten bei pH 6 vollständig inaktiviert werden können.

Es wurde daher von den Erfindern eine umfassende Untersuchung durchgeführt, um eine neue ß-Galactosidase zu entwickeln, welche leicht in hoher Ausbeute in kommerziellem Massstab erzeugt werden kann und für zahlreiche Anwendungen geeignet ist. Als Resultate wurde nun gefunden, dass ein bekannter Mikroorganismus, nämlich Pénicillium multicolor, eine neue ß-Galactosidase in hoher Ausbeute erzeugt, welche ausgezeichnete enzymatische Eigenschaften aufweist und eine besonders nützliche pH-Stabilität und hohe thermische Stabilität besitzt. Diese neue ß-Galactosidase kann erhalten werden durch Züchten eines Stammes von Pénicillium multicolor in einem Kulturmedium, entweder flüssig oder fest, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, um das Enzym im Medium zu erzeugen und anzureichern, und anschliessende Isolierung des gewünschten Enzyms aus dem Medium.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine pulverförmige ß-Galactosidase aus dem Kulturmedium von Pénicillium multicolor, welche die folgenden Charakteristiken aufweist:

a) eine relative ß-Galactosidase-Aktivität von 224% für o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid und von 186% für p-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid, wobei angenommen wird, dass die relative ß-Galactosidase-Aktivität 100% für Lactose beträgt;

b) ein Molekulargewicht von etwa 120000, bestimmt nach der Gel-Filtrationsmethode;

c) sie ist aktiv bei einem pH von 2,5 bis 7, wobei das optimale pH 4,5 beträgt;

d) die genannte ß-Galactosidase-Aktivität geht verloren durch Erhitzen bei pH 6 und 75 °C während 15 Minuten, wobei die optimale Temperatur 55 °C beträgt;

e) die genannte ß-Galactosidase-Aktivität ist stabil in einem pH-Bereich von 2,5 bis 8,0, wenn das Präparat bei 4°C während 24 Stunden stehengelassen wird;

f) die genannte ß-Galactosidase-Aktivität wird zu 100% bei 60 °C stabil gehalten und auf 60% bei 65 °C, auf 25% bei 70 °C und auf 0% bei 75 °C herabgesetzt beim Stehen bei pH 6 während 15 Minuten;

g) die genannte ß-Galactosidase-Aktivität wird zu etwa 20% inhibiert durch die Gegenwart von Queckionen Hg + +, aber nicht wesentlich inhibiert durch die Gegenwart von Eisenionen Fe+ + und Kupferionen Cu + + bei einer Metall-ionen-Konzentration von 10~3 M, und h) der isoelektrische Punkt beträgt 5,37, gemessen nach einer elektrophoretischen Methode.

Die neue erfindungsgemässe ß-Galactosidase ist stabil bei einem pH-Wert von 2,5 bis 3,0, welcher üblicherweise in dem durch den menschlichen Magen erzeugten Magensaft vorherrscht. Üblicherweise variiert der pH-Wert, welcher in der Magenhöhle vorherrscht, je nach der Art und der Menge von Nahrungsmitteln im Magen und der Zeit seit der Nahrungsmittelaufnahme, sowie je nach Individuum. Der pH-Wert in der Magenhöhle beträgt üblicherweise 4 bis 5 nach Aufnahme von Kuhmilch und Milchprodukten. Es ist daher von grossem Vorteil, dass die neue ß-Galactosidase der vorliegenden Erfindung ein optimales pH von 4,5 aufweist. Ferner zeichnet sich die erfindungsgemässe ß-Galactosidase durch ihre hohe Stabilität bei Zimmertemperatur und bei einer erhöhten Temperatur bis zu 60 °C aus, so dass sie während langer Zeit gelagert werden kann ohne Vornahme jeglicher Stabilisierungs-massnahme. Beispielsweise wird die neue erfindungsgemässe ß-Galactosidase nicht wesentlich inaktiviert, selbst wenn sie in Form eines pulverförmigen Enzympräparates in einem versiegelten Gefäss bei 450 C während einem Monat aufbewahrt wird. Die restliche ß-Galactosidase-Aktivität bleibt bei etwa 95% oder mehr, selbst wenn sie bei 450 C während einem Monat an der offenen Luft mit einer relativen Feuchtigkeit von 50 bis 70% gelagert wurde. Das neue erfindungsgemässe Enzym weist daher zahlreiche Vorteile im Vergleich zu bekannten ß-Galactosidasen auf, welche niedere Stabilität besitzen und üblicherweise in der Kälte gelagert werden müssen.

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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung einer ß-Galactosidase, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass a) ein Stamm von Pénicillium multicolor in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches assimilierbare Kohlenstoff-und Stickstoffquellen enthält, um die ß-Galactosidase im Medium zu erzeugen und anzureichern, und b) die gewünschte ß-Galactosidase sodann aus dem Medium isoliert wird.

Der erfindungsgemäss verwendete Mikroorganismus, nämlich Pénicillium multicolor, ist eine bekannte Art, welche im «Japanese Fédération of Culture Collections of Microor-ganisms»-Katalog, Seite 103, herausgegeben 1968 durch die japanische Sammelstelle «Institute for Fermentation (IFO)», Osaka, Japan, beschrieben ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist insbesondere der Stamm Pénicillium multicolor KU-0-I32 geeignet. Dieser Stamm Pénicillium multicolor KU-O-132 wurde bei der japanischen Sammelstelle «Fermentation Research Institute», Agency of Industriai Science & Technology of Japan, Inage, Chiba City, Japan am 25. Januar 1978 unter der Nr. FERM-P 4375 hinterlegt und wurde ebenfalls ohne Einschränkung in der American Type Culture Collection, USA unter ATCC Nr. 20539 hinterlegt.

Die morphologischen Eigenschaften der oben genannten Stämme von Pénicillium multicolor werden im folgenden kurz beschrieben.

1. Makroskopische Beobachtungen nach Inkubation bei 25°C während 10 Tagen auf Czapek-Agar-Medium:

Kolonien von 30 bis 40 mm Durchmesser werden erzeugt durch das Wachstum von Pénicillium multicolor. Die Oberfläche des Wachstums ist radial gefaltet und bedeckt mit einer dichten und sammetartigen Schicht, bestehend aus Conidien von tiefblaugrüner bis graugrüner Farbe. Die Peripherie des Wachstums zeigt eine orange bis gelbe Farbe in einer Breite von 1 bis 2 mm. Die Rückseite des Wachstums ist gelbbraun gefärbt.

2. Mikroskopische Beobachtung nach Inkubation bei 25 °C während 10 Tagen auf Czapek-Agar-Medium:

I. Penicillia: Monoverticillap.

II. Conidophor: Gerade und Senkrecht ohne Verzweigung und 2 bis 3 Mikron breit und verbreitert an den Spitzen.

III. Sterigma: 8 bis 14 Sterigmen wachsen in dichter Ansammlung.

IV. Conidium: Kugel- oder eiförmig geformt und 2 bis 3 Mikron im Durchmesser. Die Oberfläche ist glatt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann ein Stamm von Pénicillium multicolor entweder in einem flüssigen Kulturmedium oder in einem festen Kulturmedium unter Anwendung bekannter Fermentationstechniken, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen bezüchtet werden. Das für die Fermentation verwendete Kulturmedium kann einen oder mehrere natürliche Nährstoffe, wie Weizenkleie, Reiskleie, entfettetes Sojabohnenmehl und Baumwollsamenmehl als Grundkomponenten enthalten. Das Kulturmedium kann ferner Lactose, Stärke, Glucose, Arabinose oder Xylose als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Pepton, Malzextrakt oder Hefeextrakt als Stickstoffquelle enthalten, falls notwendig. Anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalz und Calciumsalz können in das Kulturmedium einverleibt werden, falls erwünscht. Im allgemeinen ist es zweckmässig, die Züchtung von Pénicillium multicolor bei einer Inkubationstemperatur von 10 bis 35 °C, vorzugsweise 25 bis 33 °C und in einer Umgebung mit einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise 5 bis 7,5, während 1 bis 8 Tagen durchzuführen, doch können diese Bedingungen je nach der verwendeten Züchtungsmethode variieren. Die Erzeugung der neuen erfindungsgemässen ß-Galactosidase erreicht ein Maximum in 2 bis 6 Tagen Inkubation.

Bei Verwendung eines festen Kulturmediums kann die neue ß-Galactosidase in einer Potenz von etwa 1000 Einheiten pro Gramm des festen Kulturmediums erzeugt werden. In einem flüssigen Kulturmedium kann das neue Enzym in einer Potenz von etwa 150 Einheiten pro 1 ml des flüssigen Kulturmediums erzeugt werden. Diese hohe Produktivität des neuen Enzyms durch Pénicillium multicolor ist etwa 10- bis 30mal soviel als die Produktivität der bekannten ß-Galactosidasen durch die bekannten ß-Galactosidase erzeugenden Stämme, wie sie oben erwähnt wurden, mit Ausnahme von Aspergillus oryzae FERM-P 1680.

Um die neue erfindungsgemässe ß-Galactosidase aus dem Kulturmedium von Pénicillium multicolor, in welchem das Enzym während der Züchtung des Mikroorganismus erzeugt und angereichert wurde, zu gewinnen und zu isolieren, kann das flüssige oder feste Kulturmedium unter Anwendung bekannter Techniken für die Gewinnung von Enzymen verarbeitet werden, und das gewonnene Enzym kann mit den üblichen Reinigungsverfahren für Enzyme gereinigt werden. Das flüssige Kulturmedium kann zum Beispiel durch Filtration oder Zentrifugation von festen Stoffen befreit werden, und das derart erhaltene Filtrat wird sodann durch Destillation unter vermindertem Druck oder mit Hilfe einer Dialysemembran konzentriert und anschliessend mit Ammoniumsulfat ausgesalzen oder mit Hilfe eines Ausfällungsverfahrens mit Aceton und/oder Äthanol ausgefällt, um die neue ß-Galactosidase in Form eines rohen Pulvers zu erhalten. Das feste Kulturmedium kann mit Wasser extrahiert werden und der erhalten wässerige Extrakt kann auf dieselbe Weise wie oben für das Filtrat der Brühe erwähnt, weiterverarbeitet werden. Das Kulturmedium selbst, d.h. das Brühenfiltrat und der wässerige Extrakt als solche, können als rohe ß-Galactosidase verwendet werden, falls erwünscht. Zur weiteren Reinigung der rohen ß-Galactosidase kann sie einer üblichen Enzymreinigung unterworfen werden, wie z.B. dem Ionenaustausch-Verfahren, der Gel-Filtration, der Dialyse, der Adsorption oder der Proteinausfällungs-Methode. Wenn das konzentrierte Brühenfiltrat oder der wässerige Extrakt, welche die neue ß-Galactosidase darin aufgelöst enthält, mit Aceton bis zu einem Acetongehalt von 30 bis 40 Gewichtsprozent vermischt wird, kann praktisch die ganze ß-Galactosidase daraus ausgefällt werden unter Bildung einer ß-Galactosidase-Pul-vers, welches nach dem Trocknen eine hohe ß-Galactosidase-Potenz von z.B. etwa 34,8 Einheiten/mg aufweist. Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher vorteilhaft, indem es die Verwendung von billigem und im Handel erhältlichen Aceton als Fällungsmittel ermöglicht, um eine pulverförmige ß-Galactosidase von hoher Potenz zu erhalten. Die pulverförmige ß-Galactosidase mit einer Potenz von etwa 34,8 Einheiten/mg braucht üblicherweise nicht weiter gereinigt zu werden, solange sie oral an Lactose nicht vertragende Patienten verabreicht wird in Form eines verdaulichen Arzneimittels, welches entweder zu einem oral verabreichbaren Pulver, Granulat oder entsprechenden Tabletten zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie Stärke oder Zucker verarbeitet wird, oder sie kann in Milch oder jedem beliebigen Getränk aufgelöst sein, welches vom Patienten getrunken wird.

Die Potenz der neuen ß-Galactosidase der vorliegenden Erfindung kann auf bekannte Weise in folgender Art bestimmt werden:

1 ml einer Substratlösung, welche 3,7 mg/ml o-Nitrophe-nyl-ß-D-galactopyranosid in Wasser, 2 ml 0,2 M Macllvanic-Pufferlösung (pH 4,5) und 1 ml der Enzymlösung enthält, werden miteinander vermischt und das Gemisch auf 37° C während 15 Minuten erwärmt, um die enzymatische Reaktion zu bewirken. Anschliessend wird das Reaktionsgemisch mit 4 ml wässeriger Lösung von IM Natriumcarbonat vermischt,

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um die Reaktion zu unterbrechen. Das Reaktionsgemisch wird sodann einer colorimetrischen Analyse bei einer Wellenlänge von 420 mjj. unterworfen, um den Gehalt an erzeugtem o-Nitrophenol, unter Bezugnahme auf eine Standardkurve für die colorimetrische Analyse von o-Nitrophenol, zu bestimmen. Wenn das Enzym 1 li Mol o-Nitrophenol in 1 Minute erzeugen kann, so weist dieses Enzym eine Potenz von einer Einheit auf.

Die neue erfindungsgemässe ß-Galactosidase wird im folgenden bezüglich ihrer enzymatischen Eigenschaften mit der bekannten ß-Galactosidase aus Pénicillium citrinum verglichen, welche repräsentativ ist für die bekannten ß-Galactosidasen, welche durch andere Penicillium-Arten, wie sie in der oben genannten JA-Vorveröffentlichungs-Anmeldung «Kokai», Nr. 142593/76, beschrieben sind. Die Resultate dieses Vergleiches werden in der folgenden Tabelle kurz zusam-mengefasst.

Tabelle

1. Substrat-Spezifität neues Enzym

Galactosidase

gemäss aus Pénicillium

Erfindung citrinum

Substrat (Glycoside)

Relative Aktivität

(%)

Lactose

100

100

o-Nitrophenyl-ß-D-galacto-

pyranosid

224

398

p-Nitrophenyl-ß-D-galacto-

pyranosid

186

288

2. Molekulargewicht

(bestimmt nach einer

Gel-Filtrationsmethode)

ca. 120000

ca. 100000

3. Optimales pH

4,5

4 bis 5

4. pH-Bereich, in welchem

das Enzym aktiv ist

2,5 bis 7

3,5 bis 8

5. Optimale Temperatur

55°C

50°C

6. Temperaturbereich, in

welchem das Enzym aktiv ist unter 75 °C

unter 60 °C

7. pH-Bereich, in welchem

das Enzym stabil ist bei 4°C

während 24 Stunden

2,5 bis 8,0

3,5 bis 8,0

8. Wärmestabilität, d.h.

restliche

ß-Galactosidase-Aktivität,

bestimmt nach 15 Minuten

Stehen bei pH 6 und bei

60°C

100%

50%

65 °C

60%

0%

70°C

25%

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75°C

0%

0%

9. Wirkung von Metallionen

in molarer Konzentration von

10-3

Eisen Fe+ +

im im

wesentlichen wesentlichen

nicht nicht

beeinträchtigt beeinträchtigt

Kupfer Cu + +

im im

wesentlichen wesentlichen

nicht beeinträchtigt

beeinträchtigt

Quecksilber Hg+ +

um etwa 20%

im

inhibiert wesentlichen nicht beeinträchtigt?

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1. Substrat-Spezifität neues Enzym

Galactosidase

gemäss aus Pénicillium

Erfindung citrinum

Substrat (Glycoside)

Relative

(%)

Aktivität

10. Isoelektrischer Punkt

(bestimmt durch

Elektrophorese)

5,37

6,41

11. Löslichkeit in wässerigen

organischen Lösungsmitteln

Wasser mit 40 Gew.-%

0%

87%

Methanol

Wasser mit 50 Gew.-%

0%

71%

Methanol

Wasser mit 40 Gew.-%

0%

82%

Äthanol

Wasser mit 50 Gew.-%

0%

64%

Äthanol

Wasser mit 40 Gew.-% Aceton 0%

91%

Wasser mit 50 Gew.-% Aceton 0%

72%

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1

Ein festes Kulturmedium, welches ein Gemisch aus 10 g Weizenkleie, 10 g entfettetem Sojabohnenmehl und 20 ml Wasser enthielt, wurde in einem 500-ml-ErIenmeyer-Kolben verbracht und während 15 Minuten in einem Autoklaven bei 120°C sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wurde sodann mit einer Schrägkultur von Pénicillium multicolor KU-O-132 (identifiziert als FERM-P 4375) geimpft. Das geimpfte Medium wurde in steriler Luft bei 28 °C während 4 Tagen bebrütet und das bebrütete Medium sodann mit 200 ml Wasser vermischt, um die ß-Galactosidase in die wässerige Phase zu extrahieren. Das Gemisch wurde filtriert, um die festen Stoffe zu entfernen. Das Filtrat, d.h. der wässerige Extrakt, wies eine ß-Galactosidase-Potenz von 228 Einheiten/ml auf.

Beispiel 2

Ein flüssiges Kulturmedium (100 ml) enthaltend 3% Reiskleie, 1% Baumwollsamenmehl, 0,25% Monokaliumphosphat und 0,15% Dikaliumphosphat (pH 6,2) wurde in einem 500-ml-Kolben verbracht und durch Erhitzen in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wurde mit einer Schräg-Kultur von Pénicillium multicolor KU-O-132 geimpft und das geimpfte Medium wurde bei 28 °C während 3 Tagen unter Schütteln kultiviert, indem es auf einen Schütteltisch gestellt wurde. Die inkubierte Kulturbrühe wurde filtriert und das Brühenfiltrat wies eine ß-Galactosidase-Potenz von 140 Einheiten/ml auf.

Beispiel 3

a) Ein festes Kulturmedium, bestehend aus einem gleich-mässigen Gemisch von 1,5 kg entfettetem Sojabohnenmehl, 1,5 kg Baumwollsamenmehl und 3 Liter Wasser wurde als Schicht in eine grosse Wanne verbracht und durch Erhitzen in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wurde sodann mit 150 g einer Impfkultur von Pénicillium multicolor KU-O-132 geimpft, welche durch Inkubieren der oben genannten Schräg-Kultur dieses Mikroorganismus in einem Kleienmedium (einem Gemisch von Weizenkleie und Wasser im Gewichtsverhältnis 1:1) bei 28 °C während 3 Tagen erhalten worden war. Das geimpfte Medium wurde sodann bei 28°C während 5 Tagen ohne Bewegung inkubiert

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und das inkubierte Medium (5,4 kg) wurde zerkleinert und in eine zylindrische Säule aus Glas gepackt, durch welche anschliessend Wasser durchgeleitet wurde, indem das Wasser am Kopf der Säule eingeführt wurde. Die Extraktlösung (18 Liter), welche das gewünschte Enzym enthielt, wurde als Aus-fluss aus der Säule erhalten und zentrifugiert, um sie von einer kleinen Menge fester Stoffe, welche darin suspendiert war, zu befreien. Die erhaltene überstehende Lösung wies eine ß-Galactosidase-Potenz von 347 Einheiten/ml auf.

b) Diese überstehende Lösung wurde auf ein Volumen von 4 Litern durch Ultrafiltration konzentriert und die konzentrierte Lösung wurde sodann tropfenweise mit 2,7 Litern Aceton bei niederer Temperatur versetzt. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 165 g eines Pulvers aus der erfindungsgemässen ß-Galactosidase erhalten wurden, welche eine hohe ß-Galactosidase-Potenz von 34800 Einheiten/g aufwies. Die Ausbeute betrug 92%.

c) Das oben erhaltene ß-Galactosidase-Pulver mit einer Potenz von 34800 Einheiten/g wurde auf folgende Weise weiter gereinigt. Das ß-Galactosidase-Pulver wurde in 0,0IM auf pH 4,5 gepufferte Acetatlösung gelöst und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule von CM-Cellulose geleitet, um das Enzym an dieser Säule zu adsorbieren. Die CM-Cel-

lulosesäule wurde sodann mit wässerigen Natriumchloridlösungen verschiedener Konzentrationen eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereint und mit 0,01 M auf pH 7,0 gepufferte Phosphatlösung dialysiert. Die derart dialy-5 sierte Enzymlösung wurde sodann durch eine Säule aus DEAE-Cellulose geleitet, um das Enzym zu adsorbieren. Die DEAE-Cellulosesäule wurde anschliessend mit wässerigen Natriumchloridlösungen verschiedener Konzentration eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluates wurden vereint und durch °° eine Säule aus einem Gel-Filtrationsmittel («Sephadex» G 150, ein Produkt der Pharmacia Co. Ltd., Schweden) geleitet. Der Ausfluss aus der «Sephadex»-Säule wurde in Fraktionen gesammelt und diejenigen aktiven Fraktionen, welche die ß-Galactosidase-Potenz bei einer konstanten Höhe aufwiesen, 15 wurden vereint und unter vermindertem Druck konzentriert. Zu der derart erhaltenen konzentrierten Lösung wurde Äthanol bei niederer Temperatur tropfenweise zugesetzt, um das gewünschte Enzym auszufällen. Das Enzym wurde abfiltriert, unter vermindertem Druck getrocknet, wobei ein farbloses elektrophoretisch reines Pulver der ß-Galactosidase gemäss der Erfindung erhalten wurde, welches eine ß-Galac-tosidase-Potenz von 170000 Einheiten/g aufwies. Ausbeute: 50%.

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Claims (9)

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   PATENTANSPRÜCHE

   1. Pulverförmige ß-Galactosidase aus dem Kulturmedium von Pénicillium multicolor, gekennzeichnet durch folgende Charakteristiken:

   a) relative ß-Galactosidase-Aktivität von 224% für o- 5 Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid und von 186% für p-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid, unter Bezugnahme auf die relative ß-Galactosidase-Aktivität von 100% für Lactose;

   b) Molekulargewicht von etwa 120000, bestimmt nach der Gel-Filtrationsmethode; ">

   c) Aktivitätsbereich bei pH 2,5 bis 7, wobei das optimale pH 4,5 beträgt;

   d) Verlust der genannten ß-Galactosidase-Aktivität beim Erhitzen bei pH 6 und bei 75 °C während 15 Minuten, wobei die optimale Temperatur 55°C beträgt; is e) die ß-Galactosidase-Aktivität ist stabil in einem pH-Bereich von 2,5 bis 8,0 während 24 Stunden bei 4° C;

   f) die ß-Galactosidase-Aktivität wird stabil gehalten auf 100% bei 60 °C und auf 60% reduziert bei 65 °C, auf 25% bei

   70 °C und auf 0% bei 75 °C beim Stehen bei pH 6 während 15 20 Minuten ;

   g) die ß-Galactosidase-Aktivität wird um etwa 20% inhibiert durch die Gegenwart von Quecksilberionen Hg+ +

   jedoch nicht wesentlich inhibiert durch die Gegenwart von Eisenionen Fe+ + und Kupferionen Cu+ + bei einer Metall- 25 ionenkonzentration von IO-3 M, und h) isoelektrischer Punkt 5,37, gemessen nach einer elektro-phoretischen Methode.
2. 2. ß-Galactosidase gemäss Patentanspruch 1, in Form eines Pulvers mit einer relativen ß-Galactosidase-Aktivität 30 von etwa 34800 Einheiten/Gramm.
3. 3. Verfahren zur Herstellung einer ß-Galactosidase nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein Stamm von Pénicillium multicolor in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches assimilierbare Kohlenstoff- 35 und Stickstoffquellen enthält, um die ß-Galactosidase im Medium zu erzeugen und anzureichern, und b) die ß-Galactosidase sodann aus dem Medium isoliert wird.
4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekenn- 40 zeichnet, dass die flüssige Kultivierung von Pénicillium multicolor bei einer Temperatur von 10 bis 40° C und bei einem pH von 4 bis 9 während 1 bis 8 Tagen unter aeroben Bedingungen erfolgt.
5. 5. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekenn- « zeichnet, dass a) Pénicillium multicolor in einem Kulturmedium gezüchtet wird, welches Kleie als assimilierbare Stickstoffquelle enthält, um die ß-Galactosidase im Medium zu erzeugen und anzureichern, 50

   b) das Medium mit Wasser extrahiert wird, um einen wässerigen Extrakt des Enzyms zu ergeben,

   c) das Enzym aus dem Extrakt durch Zusatz von Aceton ausgefällt wird, und d) der erhaltene Niederschlag getrocknet wird. 55
6. 6. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass a) Pénicillium multicolor in einem flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, um das Enzym im flüssigen Medium zu erzeugen und anzureichern, 60

   b) die flüssige Kulturbrühe filtriert wird, um Feststoffe zu entfernen,

   c) das erhaltene klare Filtrat konzentriert wird,

   d) das Enzym aus dem konzentrierten Filtrat durch Zusatz von Aceton ausgefällt wird, und 05

   e) der erhaltene Niederschlag getrocknet wird.
7. 7. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus in Stufe (a) Pénicillium multicolor KU-O-132, identifiziert als FERM-P4375 verwendet.
8. 8. ß-Galactosidase nach Patentanspruch 1, erhalten nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 3.
9. 9. ß-Galactosidase nach Patentanspruch 8, erhalten nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 7.