CH635616A5

CH635616A5 - Verwendung von organismen der familie bacillaceae zur gewinnung von inhibitoren fuer glykosid-hydrolasen.

Info

Publication number: CH635616A5
Application number: CH1569977A
Authority: CH
Inventors: Werner Dr Frommer; Lutz Dr Mueller; Delf Dr Schmidt; Walter Dr Puls; Hans-Peter Dr Krause; Ulrich Prof Dr Heber
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1976-12-23
Filing date: 1977-12-20
Publication date: 1983-04-15
Also published as: NL185461C; FR2378854B1; JPS5379097A; DK148798B; NL7714141A; JPH0224519B2; ES465339A1; FR2385733B1; DK148798C; US4307194A; FR2378854A1; DK577577A; GB1554090A; JPH0117677B2; NL185461B; AT363054B; FR2385733A1; ATA918377A; JPS6427487A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Organismen der Familie Bacillaceae zur Gewinnung von Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, und zwar insbesondere Gluco-sidase-Inhibitoren, die im Verdauungstrakt wirksam werden. Diese Inhibitoren werden von Organismen der Familie Bacillaceae, besonders von Stämmen der Gattung Bacillus gebildet.

Zur Auffindung geeigneter Stämme bedient man sich der nachstehend beschriebenen Methoden.

Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der Familie Bacillaceae, insbesondere solche der Gattung Bacillus. Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit Nährlösungen, die das Wachstum dieser Stämme ermöglichen. Man kann z.B. eine Nährlösung verwenden, die 5 g Pepton und 3 g Fleischextrakt pro Liter enthält, jedoch sind grundsätzlich viele andere Typen von Nährlösungen, die geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Nährsalze enthalten, einsetzbar. Der pH-Wert der Nährlösungen kann in weiten Grenzen variieren; bevorzugt wird ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0 und 8,0 gewählt.

Als Kohlenstofflieferant für die Nährlösung kommen die verschiedenartigsten organischen Substanzen in Frage. Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole seien beispielhaft genannt.

Als Stickstoffquelle können Hefeextrakt, Sojamehl, Peptone, Fleischextrakt und viele andere organische Substanzen Verwendung finden.

Die Konzentrationen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie der Nährsalze, von denen FeS04, CaC03 und MgS04 beispielhaft erwähnt seien, können in weiten Grenzen schwanken. Auf den gesonderten Zusatz von Nährsalzen kann in manchen Fällen ganz verzichtet werden, da sie oftmals in den komplexen Stickstoffquellen als Beimengungen enthalten sind.

Da die Bildung von Inhibitoren oft stark von der Zusammensetzung der Nährböden abhängig ist, empfiehlt es sich, die Stämme zur Optimierung der Produktionsleistung in verschiedenen Nährlösungen zu kultivieren. Entsprechende Vorschläge können den Beispielen entnommen werden.

Von der Nährlösung füllt man z.B. 100-200 ml in einen

1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, sterilisiert in bekannter Weise, beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet den Kolben bei 15-80 °C, vorzugsweise bei 24-40 °C bzw. 50-70 °C bei thermophilen Bacillen, auf Schüttelmaschinen. Zeigt die Kultur Wachstum, was im allgemeinen nach 1-10 Tagen, meist nach 1 -5 Tagen, sichtbar wird, so entnimmt man eine Probe von z.B. 5 ml und trennt in dieser Probe die Zellen durch Filtration oder Zentrifugation ab. Von den Kulturbrühen werden 1-100 (il in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt und die Hemmkapazität pro ml berechnet.

Die Zellen werden zweimal mit je 5 Volumina (bezogen auf das Zellvolumen) Aceton und anschliessend einmal mit 5 Volumina Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zur Trockene eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Die Lyophilisate werden in Konzentrationen von 10-1000 [ig/ml in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt.

Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 ji Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die [iVal gespaltenen Bindungen werden als (iVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als jiVal Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20-22 AE/ml) mit 10-1000 |ig Inhibitor oder 1—100 jo.1 der zu testenden Kulturlösung in 0,4 ml 0,02M Natriumglycerophosphatpuffer/0,001 M CaCkpH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 35 °C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35 °C vorgewärmten 1% Stärkelösung bei 35 °C inkubiert und anschliessend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bernfeld in Colo wick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

[.ig Inhibitor *

AE **

* bezogen auf Trockensubstanz

** AE in nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/mg Inhibitor umgerechnet.

Saccarasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 jiMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die uMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereak-tion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung (Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12 (1958), entsprechenden SE-

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3

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Art

Stamm-Nr.

B. subtilis

B. subtilis var. niger B. amyloliquefaciens B. coagulans B. longisporus

DSM 704

DSM 675 (ATCC 9372) DSM 7 (ATCC 23350) DSM 1 (ATCC 7050) DSM 479, hemmt auch Amylase

20

25

Gehalt verdünnt.) mit 1-20 jxg Inhibitor oder 1-20 (il der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 M Natriummaleinatpuf-fer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35 °C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35 °C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 5 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35 °C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidase-reagens (Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase [Fa. Boehringer, Reinheitsgrad I] in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschliessenden io Zusatz von 1 ml Detergenslösung [2 g Triton X 100 + 8 g 95% Äthanol p. a.], 1 ml Dianisidinlösung [260 mg o-Dianisidin x 2 HCl in 20 ml H2O] und 0,5 ml 0,l%iger wässriger Peroxidaselö-sung[Fa. Boehringer, Lyophilisat, Reinheitsgrad II] hergestellt.) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35 °C. Danach wird 15 1 ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/1 umgerechnet.

Maltasetest

Eine Maltase-Inhibitor-Einheit (MIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Maltaseeinheiten zu 50% inhibiert.

Eine Maltaseeinheit (ME) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 (iMol Maltose in 2 (iMol Glucose spaltet. Die (iMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Maltosespaltung durch die Maltase nicht mehr stattfindet. Zur Durch- 30 führung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,060-0,070 ME eingestellten Maltaselösung (Enzympräparation wie unter Sac-charasetest beschrieben) mit 1-20 (ig Inhibitor oder 1-20 (il der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml einer auf 35 °C vorgewärmten 0,05 M 35 Maltoselösung in 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35 °C und stoppt die Maltasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens (Enzympräparation wie unter Saccharasetest beschrieben) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35 °C. Danach wird 1 ml 50% 40 H2SO4 zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.

Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Maltase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf MIE/g bzw. MIE/1 umgerech- 45 net.

Nach der oben beschriebenen Methode wurde eine ganze Reihe von Stämmen der Familie Bacillaceae geprüft. Dabei wurden insbesondere bei Stämmen der Gattung Bacillus deutliche Glykosidhydrolasen inhibierende Aktivitäten gefunden. 50 Am günstigsten hinsichtlich der Ausbeute erwiesen sich die Arten B. subtilis, B. subtilis var. niger, B. amyloliquefaciens, B. longisporus, B. polymyxa sowie B. coagulans.

Die Häufigkeit mit der nach der angegebenen Methode Stämme gefunden wurden, die sich in den Tests als aktive Inhi- 55 bitoren erwiesen, lag über 5%. Beispiele besonders wirksamer Stämme werden in Tabelle 1 aufgeführt:

Tabelle 1

Bacillus-Stämme mit Saccharase-Inhibitor-Wirkung 60

Art

Stamm-Nr.

B. polymyxa

DSM 365

B. polymyxa

DSM 372

B. polymyxa

DSM 742

B. polymyxa

DSM 292

B. polymyxa

DSM 356 (ATCC 8523)

B. polymyxa

DSM 36 (ATCC 842)

B. polymyxa

DSM 740

B. polymyxa

DSM 741

B. subtilis

DSM 1060

B. subtilis

DSM 1061

B. subtilis

DSM 1062

B. subtilis

DSM 1063

B. subtilis

DSM 1064

B. subtilis

DSM 1065

B. subtilis

DSM 1066

B. subtilis

DSM 1067

Die aufgeführten Stämme sind unter den angegebenen DSM-Nummern bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM), Göttingen, hinterlegt und von dort zu beziehen.

Die neuen Stämme DSM 704,740,741 und 742 werden in Tabelle 2 beschrieben; die restlichen Stämme sind aus der Literatur bekannt und werden im «Catalogue of Strains 1974» der DSM aufgeführt.

Bacillus subtilis, Stamm 2a wurde am 25. Mai 1976 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsbezeichnung DSM 704.

Bacillus polymyxa x 16 wurde am 26. Juli 1976 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsbezeichnung DSM 740.

Bacillus polymyxa x 18 wurde am 26. Juli 1976 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsbezeichnung DSM 741.

Bacillus polymyxa X20 wurde am 26. Juli 1976 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Göttingen, hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsbezeichnung DSM 742.

Zur Gewinnung der Glycosid-Hydrolasen-Inhibitoren werden die oben aufgeführten Stämme in den oben beschriebenen Nährlösungen kultiviert. Dabei ist zu beachten, dass praktisch jeder Stamm zur optimalen Produktion eine andere qualitativ und quantitativ anders zusammengesetzte Nährlösung benötigt.

Nach l-10tägiger Bebrütung bei 15-80 °C, vorzugsweise 24-40 °C bzw. bei Thermophilen 50-70 °C, in Schüttelkolben oder in Fermentern verschiedener Grösse werden die Zellen von der Kulturlösung abgetrennt und je nach dem Auftreten der Inhibitoren das wirksame Prinzip aus der Kulturlösung und/ oder aus den Zellen angereichert.

Aus den Kulturbrühen gewinnt man die Inhibitoren beispielsweise durch Lyophilisation oder Fällung mit Salzen oder wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln (wie z.B. niedere Alkohole und Ketone) oder durch Adsorption der Wirkstoffe an Ionenaustauschern.

Aus den Zellen gewinnt man die Inhibitoren vorzugsweise durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Alkoholen, Ketonen, Äthern, Estern und Sulfoxiden.

Dazu wird der Fermentationsansatz bei 3000-20 000 Upm, vorzugsweise 6-10 000 Upm, 10-60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, zentrifugiert oder filtriert, vorzugsweise mit Druck und unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmitteln, und derart in Kulturbrühe und Zellrückstand getrennt.

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Tabelle 2

Eigenschaften der Stämme DSM DSM DSM DSM

740 741 742 704

Stäbchen

Länge, u

3-6

2-5

3-7

2-1

Breite, u

0,6-

0,7-

0,6-

0,8

Gran-Reaktion

+

±

+

Sporen

ellipsoid/zylindrisch

+

rund

-

—

terminal/subterminal

+

zentral/parazentral

+

Sporenmutterzelle

+

-

angeschwollen

Beweglichkeit

+

Maximale Wachstumstemperatur

Wachstum positiv bei °C

40

45

55

Wachstum negativ bei °C

45

50

60

Catalase

+

Anaerobes Wachstum

+

-

Voges-Proskauer-Reaktion

+

pH in VP-Medium

6,2

6,5

5,6

Eigelb-Reaktion

-

Wachstum

pH 5,7

+

NaCl 5%

+

-

+

NaCl 7%

-

+

NaCl 10%

-

+

Lysozym (0,001%)

-

+

-

Säurebildung aus

D-Glucose

+

L-Arabinose

+

D-Xylose

+

D-Mannit

+

Gasbildung aus Glucose

+

-

Abbau von

Stärke

+

Casein

+

Gelatine

+

Ty rosin

-

Hippurat

—

-

Pektin

+

Verwertung von

Citrat

-

+

Propionat

-

Desaminierung von

Phenylalanin

—

Reduktion von MOj~ zu N02~

+

Gasbildung aus Nitrat

-

Bildung von

kristallinen Dextrinen

-

Indol

-

Dihydroxyaceton

+

—

Die Stämme DSM 740, DSM 741, DSM 742 und DSM 704 sind aufgrund von Sporenbildung und aerobem Wachstum der Gattung Bacillus zuzuordnen. Die ermittelten morphologischen und physiologischen Merkmale der Stämme DSM 740, DSM 741 und DSM 742 entsprechen denjenigen von Bacillus polymyxa, während der Stamm DSM 704 der Art Bacillus subtilis zuzuordnen ist.

Die Identifizierung erfolgte nach den Angaben von R.E. Gordon, W.C. Haynes, C. Hor-Nay Pong: The Genus Bacillus, Washington 1973.

Die Isolierung des Inhibitors aus der jeweiligen Kulturbrühe kann auf verschiedene Weise erfolgen:

a) Einengen der Kulturbrühen bei vermindertem Druck (10-50 Torr) bei Bad-Temperaturen von 20-100 °C, vorzugsweise 40-80 °C, auf ca. Vs-Vso des Ausgangsvolumens. Der eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentrifugiert und das klare Filtrat (der klare Überstand) evtl. nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.

b) Ausfällung der Inhibitoren aus der Kulturbrühe (oder den nach a) eingeengten Kulturbrühen) durch Zusatz von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Äthanol, Aceton, bis zu einem Gehalt von 60-90%. Da bei niederer Konzentration an Lösungsmittel inaktive Begleitsubstanzen gefällt werden, eignet sich dieses Fällungsverfahren besonders gut zur fraktionierenden Fällung zur Abtrennung von unerwünschten Begleitstoffen.

c) Aussalzen der Inhibitoren aus den Extrakten (oder den nach a) eingeengten Extrakten), z.B. mit Ammonsulfat, Kochsalz usw. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifuga-tion oder Filtration gesammelt und entweder direkt mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet oder nach Rücklösen in Wasser dialysiert und lyophilisiert.

d) Adsorption der Inhibitoren an Ionenaustauscher. Dieses Verfahren eignet sich zur Isolierung von solchen Inhibitoren, die auf Grund ihrer chemischen Natur Ladungen tragen. Die Desorption des Inhibitors geschieht durch Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes des Elutionsmediums.

Neben dem Inhibitor finden sich in den Kulturbrühen häufig unerwünschte Begleitsubstanzen. Die Abtrennung dieser Begleitstoffe kann auf verschiedene Weise erfolgen, z.B. durch Hitzedenaturierung der Begleitstoffe bei Inhibitoren, die hitzestabil sind, oder durch Dialyse durch entsprechende Membranen bei niedermolekularen Inhibitoren, wobei die ungewünschten Begleitstoffe von der Membran zurückgehalten werden oder durch fraktionierende Fällung (vgl. b) oder durch Adsorption der Begleitstoffe an Ionenaustauscher.

Die Gewinnung von Inhibitoren aus den Zellen geschieht beispielsweise durch mehrmalige Extraktion der Zellen mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise zweimaliger 10-bis 20minütiger Extraktion mit 3-5 Vol. Aceton (bezogen auf das Zellfeuchtvolumen) und anschliessend einmaliger 5-bis lOminü-tiger Extraktion mit Äther. Die Aceton- und Äther-Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.

Die neuen Substanzen lösen sich gut in Wasser. Eine Gruppe der Inhibitoren ist bei neutralen pH-Werten hitzestabil, säurestabil (pH 2), alkalistabil (pH 12) und dialysierbar. Diese Inhibitoren werden durch Trypsin und Pepsin nicht inaktiviert, sie hemmen ihrerseits die genannten Enzyme nicht. Sie sind mit den typischen Proteinfärbestoffen nicht anfärbbar. Nach Abschätzungen aus der Gelfiltration liegt das Molekulargewicht dieser Inhibitoren über 100 aber unter 2000.

Die besten Inhibitoren dieser Gruppen zeichnen sich durch eine extrem hohe, auch alle bisher bekannten Saccharase-Inhi-bitoren übertreffende Hemmaktivität gegenüber Saccharase aus.

Bei Fermentation des Stammes DSM 7 in einer Nährlösung der Zusammensetzung 4 (siehe Beispiel 4) werden nach viertägiger Fermentation über 400 000 SIE/1, bei einer Kultivierung dieses Stammes in Nährlösung S3 (siehe Beispiel 3) werden nach sechstägiger Fermentation über 300 000 SIE/1 gewonnen.

Durch Adsorption an stark sauren Kationenaustauschern in der H®-Form und anschliessende Desorption mit wässriger NH3-Lösung sowie Einengen und Lyophilisation des Desorbats wird ein Rohinhibitor mit etwa 40 000 SIE/g erhalten. Extraktion des Rohinhibitors mit Methanol, Einengen des Extraktes zur Trockene, Rücklösen in Wasser und Chromatographie der

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25

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wässrigen Lösung an schwach sauren Austauschern auf Dex-tran- oder Cellulose-Basis, insbesondere Carboxymethylcellu-lose, Desorption mit verdünnten Mineralsäuren, vorzugsweise

10-3-10-1 N Salzsäure, Einengen der saccharase-inhibitorisch aktiven Fraktionen und Lyophilisation dieser Fraktionen führt zu einem angereicherten Rohprodukt mit etwa 250 000 SIE/g. Chromatographie des angereicherten Rohproduktes an modifiziertem Dextran (Sephadex® LH 20) in Methanol, Einengen der saccharase-inhibitorisch aktiven Fraktionen und Zusatz von konzentrierten Mineralsäuren, vorzugsweise konzentrierte Salzsäure, bis zu einem pH-Wert von 1 -3 liefert ein kristallines Produkt mit 540 000 SIE/g. Diese Substanz ist chromatographisch rein. Als Summenformel wurde C6H13O4N bzw. C6H14O4NCI für das Hydrochlorid ermittelt. Auf Grund ihrer physikalischen Parameter (IR-, NMR-, UV-Spektren; Schmelzpunkt; spezifischer Drehwert) und den chemischen Eigenschaften (Perjodat-Oxidation, Elementaranalyse) ist sie identisch mit einer von S. Inoye et al. (Tetrahedron 23,2125 [1968]) beschriebenen Verbindung der Summenformel CaHnC^N bzw. C6H14O4NCI für das Hydrochlorid, welcher von den Autoren die Strukturformel

20

30

zugeordnet und für die der Name «1-Desoxynojirimycin» vorgeschlagen wurde.

Diese Verbindung wurde von den Autoren auf chemischem Wege durch Hydrierung des Antibioticums Nojirimycin erhalten. Das Ausgangsprodukt Nojirimycin wird nach T. Niida et al.35 (]. Antibiotics, Ser. A. 20,62 [1967]) durch Fermentation von Organismen der Gattung Streptomyces erhalten.

Durch die vorliegende Erfindung wird es erstmalig möglich, Desoxynojirimycin in einem Arbeitsgang durch direkte mikrobiologische Synthese mit guten Ausbeuten, ohne Umweg über 40 das relativ instabile und dadurch schwierig zu handhabende Nojirimycin herzustellen.

Es ist ausserordentlich überraschend und war nicht vorherzusehen, dass diese Verbindungen von Organismen der Gattung Bacillus produziert werden, da sich diese Mikroorganis- 45 men im allgemeinen als Sekundärstoff-Produzenten weniger eignen und allenfalls im wesentlichen peptidartige Sekundärstoffe bilden.

Darüber hinaus werden von einzelnen Stämmen, z.B. DSM 372, Saccharase-Inhibitoren gebildet, die im Gemisch neben 50 Desoxynojirimycin und/oder Nojirimycin noch andere im Dünnschicht-Chromatogramm deutlich unterscheidbare sac-charase-inhibitorisch aktive Komponenten produzieren.

Andere Stämme, z.B. DSM 741, bilden Inhibitoren, die im Dünnschicht-Chromatogramm kein Desoxynojirimycin oder 55 Nojirimycin erkennen lassen und die somit chemisch von anderer Struktur sind.

Es ist bekannt, dass bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und Getränken (z.B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, 60 Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glycosidhydrolasen (z.B. Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema

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Stärke bzw. Glycogen ^2^4 Maltose _¥^is4Glucose Saccharose Saccharose Glucose + Fructose bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluss an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, dass sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oder begünstigt.

Ferner ist bekannt, dass in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.

Malabsorption von Kohlenhydraten, z.B. infolge intestinalen Saccharasemangels, bewirkt eine Diarrhö. Geeignete Dosen eines Glucosidase-Inhibitors bewirken eine künstliche Malabsorption und sind deshalb geeignet, einer Obstipation entgegenzuwirken.

Die Inhibitoren eignen sich deshalb vorzugsweise als The-rapeutica für folgende Indikationen:

Adipositas, Hyperlipoproteinämie, Atherosklerose, Diabetes, Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies.

Zur Verbreiterung des Wirkungsspektrums kann es sich empfehlen, Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, die sich gegenseitig in ihrer Wirkung ergänzen, zu kombinieren, sei es, dass es sich um Kombinationen der Inhibitoren untereinander oder um Kombinationen der Inhibitoren mit bereits bekannten handelt. So kann es beispielsweise zweckmässig sein, Saccharase-Inhibi-toren mit bereits bekannten Amylase-Inhibitoren zu kombinieren.

Vorteilhaft sind in manchen Fällen auch Kombinationen der Inhibitoren mit bekannten oralen Antidiabetica (ß-cyto-trope Sulfonylharnstoffderivate und/oder blutzuckerwirksame Biguanide) sowie mit blutlipid-senkenden Wirkstoffen wie z.B. Clofibrat, Nicotinsäure, Cholestyramin und andere.

Die Verbindungen können ohne Verdünnung, z.B. als Pulver oder in einer Gelatinehülle oder in Kombination mit einem Trägerstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung appliziert werden.

Pharmazeutische Zubereitungen können eine grössere oder kleinere Menge des Inhibitors enthalten, z.B. 0,1 bis 99,5%, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen nichttoxischen, inerten Trägerstoff, wobei der Trägerstoff eine oder mehrere feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und/oder nichttoxisches, inertes und pharmazeutisch-verträgliches Formulierungshilfsmittel enthalten kann. Solche pharmazeutischen Zubereitungen liegen vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten vor, d.h. physikalisch-diskrete, eine bestimmte Menge des Inhibitors enthaltenden Einheiten, die einem Bruchteil oder einem Vielfachen des Dosis entsprechen, die zur Herbeiführung der gewünschten Hemmwirkung entsprechen. Die Dosierungseinheiten können 1,2,3,4 oder mehr Einzeldosen oder V2, V3 oder !A einer Einzeldosis enthalten. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise eine genügende Menge Wirkstoff, um bei einer Applikation gemäss eines vorher bestimmten Dosierungsschemas einer oder mehrerer Dosierungseinheiten die gewünschte Hemmwirkung zu erzielen, wobei eine ganze, eine halbe, oder ein Drittel oder ein Viertel der Tagesdosis gewöhnlich ein-, zwei-, drei- oder viermal am Tage verabreicht wird. Andere therapeutische Mittel können auch eingenommen werden. Obgleich die Dosierung und das Dosierungsschema in jedem Fall sorgsam abgewogen werden sollte, unter Anwendung gründlichen fachmännischen Urteils und unter Beachtung des Alters, des Gewichts und des Zustands des Patienten, der Art und der Schwere der Erkrankung, wird die Dosierung gewöhnlich in einem Bereich zwischen etwa 30 bis etwa 3 x 105 AIE/kg und zwischen etwa 1 bis etwa 1 x 104 SIE/kg

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des Körpergewichtes pro Tag liegen. In manchen Fällen wird den unter Verwendung nichttoxischer, alkoholischer Träger-man dabei eine ausreichende therapeutische Wirkung mit einer stoffe erhalten. Suspensionen kann man durch Dispergieren geringeren Dosis erreichen, während in anderen Fällen eine der Verbindung in einem nicht toxischen Trägerstoff darstel-

grössere Dosis erforderlich sein wird. len. Lösungsvermittler und Emulgiermittel, wie z.B. äthoxy-

Orale Applikation kann unter Verwendung fester und flüssi- 5 lierte Isostearylalkohole und Polyoxyäthylensorbitester, Konger Dosierungseinheiten durchgeführt werden, wie z.B. Pulver, servierungsmittel, geschmacksverbessernde Zusätze, wie z.B.

Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulate, Suspensionen, Lösun- Pfefferminzöl oder Saccharin und dgl., können auch zugegeben gen und dergleichen. werden.

Pulver wird durch Zerkleinerung der Substanz in einer ge- Dosierungsvorschriften können auf der Kapsel angegeben eigneten Grösse und Vermischen mit einem ebenfalls zerklei- io werden. Überdies kann die Dosierung so abgesichert sein, dass nerten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt. Obgleich ein der Wirkstoff verzögert abgegeben wird, z.B. durch Einheiten essbares Kohlenhydrat, wie z.B. Stärke, Lactose, Saccharose des Wirkstoffes in Polymerensubstanzen, Wachse oder dgl.

oder Glucose normalerweise zu diesem Zwecke Verwendung Zusätzlich zu den oben erwähnten pharmazeutischen findet und auch hier benutzt werden kann, ist es wünschens- Zusammensetzungen lassen sich auch diese Wirkstoffe enthal-wert ein nicht metabolisierbares Kohlenhydrat, wie z.B. ein Cel-15 tende Lebensmittel herstellen; beispielsweise Zucker, Brot,

lulosederivat zu benutzen. Kartoffelprodukte, Fruchtsaft, Bier, Schokolade und andere

Süssmittel, Geschmackszusätze, Konservierungsstoffe, Dis- Konfektartikel, und Konserven, wie z.B. Marmelade, wobei zu pergiermittel und Färbemittel können auch mitverwendet wer- diesen Produkten eine therapeutisch-wirksame Menge minde-

den. stens eines der Inhibitoren gegeben wurde.

Die Kapseln können durch Zubereitung der oben beschrie- 20 Die Inhibitoren weisen weiterhin die Eigenschaft auf, in Tie-

benen Pulvermischung und durch Füllung bereits gebildeter ren das Verhältnis des Anteiles an unerwünschtem Fett zum

Gelatinehüllen hergestellt werden. Die Pulvermischung kann Anteil des erwünschten fettarmen Fleisches (mageres Fleisch)

man vor dem Füllvorgang mit Gleitmitteln, wie z.B. Kieselgel, zugunsten des mageren Fleisches in hohem Masse zu beeinflus-

Talkum, Magnesiumstearat, Calciumstearat oder festem Poly- sen. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Aufzucht und

äthylenglykol versetzen. Die Mischung kann man ebenfalls mit 25 Haltung von landwirtschaftlichen Nutztieren, z.B. in der einem Desintegrator oder Lösungsvermittler, wie z.B. Agar- Schweinemast, aber auch von erheblicher Bedeutung für die

Agar, Calciumcarbonat oder Natriumcarbonat versetzen, um Aufzucht und Haltung von sonstigen Nutztieren und Ziertie-

bei Einnahme der Kapsel die Zugänglichkeit des Inhibitors zu ren. Die Verwendung der Inhibitoren kann weiterhin zu einer verbessern. erheblichen Rationalisierung der Fütterung der Tiere führen,

Die Anfertigung der Tabletten erfolgt zum Beispiel durch 30 sowohl zeitlich, mengenmässig wie auch qualitätsmässig. Da sie Herstellung einer Pulvermischung, grob oder feinkörnig, und eine gewisse Verzögerung der Verdauung bewirken, wird die Hinzufügung eines Gleitmittels und Desintegrators. Aus dieser Verweildauer der Nährstoffe im Verdauungstrakt verlängert, Mischung formt man Tabletten. Eine Pulvermischung bereitet wodurch eine mit weniger Aufwand verbundene Ad-libitum-man vor durch Mischung der Substanz, welche in geeigneter Fütterung ermöglicht wird. Weiterhin ergibt sich bei der Verweise zerkleinert wurde und ergänzt ein Verdünnungsmittel 35 wendung der Inhibitoren in vielen Fällen eine erhebliche Ein-oder eine andere Trägersubstanz wie oben beschrieben. Gege- sparung von wertvollem Proteinfutter.

benenfails fügt man ein Bindemittel hinzu: z.B. Carboxymethyl- Die Wirkstoffe können somit praktisch in allen Bereichen cellulose, Alginate, Gelatine oder Polyvinylpyrrolidone, einen der Tierernährung als Mittel zur Reduzierung des Fettansatzes

Lösungsverzögerer, wie z.B. Paraffin, einen Resorptionsbe- sowie der Einsparung von Futtereiweiss verwendet werden,

schleuniger, wie z.B. ein quarternäres Salz und/oder ein 40 Die Wirksamkeit der Wirkstoffe ist hierbei weitgehend

Adsorptionsmittel, wie z.B. Bentonit, Kaolin oder Dicalcium- unabhängig von der Art und dem Geschlecht der Tiere. Beson-

phosphat. Die Pulvermischung kann granuliert werden zusam- ders wertvoll erweisen sich die Wirkstoffe bei Tierarten, die men mit einem Bindemittel, wie z.B. Sirup, Stärkepaste, Aka- überhaupt oder in bestimmten Lebensabschnitten zu stärkerer zienschleim, oder Lösungen aus Zellulose- oder Polymeren- Fetteinlagerung neigen.

materialien. Danach presst man das Produkt durch ein grobes 45 Als Tiere, bei denen die Inhibitoren zur Reduzierung des

Sieb. Als Alternative hierzu kann man die Pulvermischung Fettansatzes und/oder zur Einsparung von Futtereiweiss einge-

durch eine Tablettenmaschine laufen lassen und die sich erge- setzt werden können, seien beisielsweise folgende Nutz- und benden ungleichmässig geformten Stücke bis auf Korngrösse Ziertiere genannt: Warmblüter wie Rinder, Schweine, Pferde, zerkleinern. Damit die entstandenen Körner nicht in den tablet- Schafe, Ziegen, Katzen, Hunde, Kaninchen, Pelztiere, z.B.

tenbildenden Düsen steckenbleiben, kann man sie mit einem 50 Nerze, Chinchilla, andere Ziertiere, z.B. Meerschweinchen und

Gleitmittel versetzen, wie z.B. Stearinsäure, Stearatsalz, Tal- Hamster, Labor- und Zootiere, z.B. Ratten, Mäuse, Affen usw.,

kum oder Mineralöl. Diese gleitfähig gemachte Mischung wird Geflügel, z.B. Broiler, Hühner, Gänse, Enten, Truthähne, Tau-

dann in Tablettenform gepresst. Die Wirkstoffe können auch ben, Papageien und Kanarienvögel und Kaltblüter, wie Fische,

mit freifliessenden inerten Trägerstoffen vereinigt werden und z.B. Karpfen und Reptilien, z.B. Schlangen.

direkt in Tablettenform gebracht werden unter Auslassung der 55 Die Menge der Wirkstoffe, die den Tieren zur Erreichung

Granulat- oder Zerstückelungsschritte. Man kann das Produkt des gewünschten Effektes verabreicht wird, kann wegen der mit einer klaren oder opaken Schutzhülle versehen, z.B. einem günstigen Eigenschaften der Wirkstoffe weitgehend variiert

Überzug aus Schellack, einem Überzug aus Zucker oder werden. Sie liegt vorzugsweise bei etwa 0,5 mg bis 2,5 g, insbe-Polymersubstanzen und einer polierten Hülle aus Wachs. Färb- sondere 10 bis 100 mg/kg Futter. Die Dauer der Verabreichung stoffe können diesen Überzügen beigefügt werden, damit zwi- 60 kann von wenigen Stunden oder Tagen bis zu mehreren Jahren sehen den verschiedenen Dosierungseinheiten unterschieden betragen. Die passende Menge Wirkstoff sowie die passende werden kann. Dauer der Verabreichung stehen in engem Zusammenhang mit

Die oral zu verabreichenden Zubereitungsformen, wie z.B. dem Fütterungsziel. Sie hängen insbesondere von der Art, dem

Lösungen, Sirup und Elixiere, lassen sich in Dosierungseinhei- Alter, dem Geschlecht, dem Gesundheitszustand und der Art ten herstellen, so dass eine bestimmte Menge Präparat eine 65 der Haltung der Tiere ab und sind durch jeden Fachmann leicht bestimmte Menge Wirkstoff enthält. Sirup kann so hergestellt zu ermitteln.

werden, dass der Wirkstoff in einer wässrigen Lösung, welche Die Wirkstoffe werden den Tieren nach den üblichen geeignete Geschmacksstoffe enthält, gelöst wird; Elixiere wer- Methoden verabreicht. Die Art der Verabreichung hängt insbe

7 635 616

sondere von der Art, dem Verhalten und dem Allgemeinzu- bedeckende geeignete Mittel, z.B. mit nichttoxischen Wachsen stand der Tiere ab. So kann die Verabreichung einmal oder oder Gelatine, vor Luft, Licht und/oder Feuchtigkeit geschützt mehrmals täglich, in regelmässigen oder unregelmässigen werden.

Abständen, oral erfolgen. Aus Zweckmässigkeitsgründen ist in Beispiel für die Zusammensetzung eines fertigen Mischfut-den meisten Fällen eine orale Verabreichung, insbesondere im 5 ters, für Geflügel, das einen Wirkstoffe enthält:

Rhythmus der Nahrungs- und/oder Getränkeaufnahme der 200 g Weizen, 340 g Mais, 360,3 g Sojaschrot, 60 g Rinder-

Tiere, vorzuziehen. talg, 15g Dicalciumphosphat,l 0 g Calciumcarbonat, 4 g jodier-

Die Wirkstoffe können als reine Stoffe oder in formulierter tes Kochsalz, 7,5 g Vitamin-Mineral-Mischung und 3,2 g Wirk-Form verabreicht werden, wobei die formulierte Form sowohl stoff-Premix ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter, als Premix, also in Mischung mit nichttoxischen inerten Träger- io Die Vitamin-Mineral-Mischung besteht aus:

Stoffen beliebiger Art, als auch als Teil einer Gesamtration in 6000 I.E. Vitamin A, 1000 I.E. Vitamin D3,10 mg Vitamin E,

Form eines Beifutters bzw. als Mischungsbestandteil eines allei- 1 mg Vitamin Ks, 3 mg Riboflavin, 2 mg Pyridoxin, 20 mcg Vita-nigen Mischfutters zu verstehen ist. Mit eingeschlossen ist auch min Bn, 5 mg Calciumpantothenat, 30 mg Nikotinsäure, 200 mg die Applikation geeigneter Zubereitungen über das Trinkwas- Cholinchlorid, 200 mg Mn SO4X H2O,140 mg Zn SO4X 7H2O, ser. 15 100 mg F e SO4 x 7 H2O und 20 mg Cu SO4 x 5H2O.

Die Wirkstoffe können gegebenenfalls informulierter Form Der Wirkstoff Premix enthält z.B. 1-Desoxynojirimycin in auch zusammen mit anderen Nähr- und Wirkstoffe, z.B. Mine- der gewünschten Menge, z.B. 1600 mg und zusätzlich 1 g DL-ralsalzen, Spurenelementen, Vitaminen, Eiweissstoffen, Ener- Methionin sowie so viel Sojabohnenmehl, dass 3,2 g Premix gieträgern (z.B. Stärke, Zucker, Fette), Farbstoffen und/oder entstehen.

Geschmacksstoffen oder anderen Futterzusatzstoffen, z.B. 20 Beispiel für die Zusammensetzung eines Schweinemischfut-Wachstumsförderern in geeigneter Form verabreicht werden. ters, das einen Wirkstoffe enthält:

Die Wirkstoffe können den Tieren vor, während oder nach der 630 g Futtergetreideschrot (zusammengesetzt aus 200 g Nahrungsaufnahme gegeben werden. Mais-, 150 g Gerste-, 150 g Hafer- und 130 g Weizenschrot), 80 g

Empfehlenswert ist die orale Verabreichung zusammen mit Fischmehl, 60 g Sojaschrot, 58,8 g Tapiokamehl, 38 g Bierhefe, dem Futter und/oder Trinkwasser, wobei je nach Bedarf die 25 50 g Vitamin-Mineral-Mischung für Schweine (Zusammenset-Wirkstoffe der Gesamtmenge oder nur Teilen des Futters und/ zung, z.B. wie beim Kükenfutter), 30 g Leinkuchenmehl, 30 g oder Trinkwassers zugegeben werden. Maiskleberfutter, 10 g Sojaöl, 10 g Zuckerrohrmelasse und 2 g

Die Wirkstoffe können nach üblichen Methoden durch ein- Wirkstoff Premix (Zusammensetzung z.B. beim Kükenfutter) faches Mischen als reine Stoffe, vorzugsweise in fein verteilter ergeben nach sorgfältigem Mischen 1 kg Futter.

Form oder in formulierter Form in Mischung mit essbaren, 30 Die angegebenen Futtergemische sind vorzugsweise zur nichttoxischen Trägerstoffen, gegebenenfalls auch in Form Aufzucht und Mast von Küken bzw. Schweinen abgestimmt, sie eines Premix oder eines Futterkonzentrates, dem Futter und/ können jedoch in gleicher oder ähnlicher Zusammensetzung oder dem Trinkwasser beigefügt werden. auch zur Aufzucht und Mast anderer Tiere verwendet werden.

Das Futter und/oder Trinkwasser kann beispielsweise die Wie bereits erwähnt, können die Inhibitoren einzeln oder

Wirkstoffe in einer Konzentration von etwa 0,001 bis 5,0%, ins- 35 aber auch in beliebigen Mischungen untereinander verwendet besondere 0,02 bis 2,0% (Gewicht) enthalten. Die optimale werden, wobei sowohl die reinen Wirkstoffe als auch die bei

Höhe der Konzentration des Wirkstoffs im Futter und/oder der Herstellung erhaltenen rohen Wirkstoffe gegebenenfalls Trinkwasser ist insbesondere abhängig von der Menge der Fut- nach einer Grobreinigung eingesetzt werden.

ter- und/oder Trinkwasseraufnahme der Tiere und kann durch jeden Fachmann leicht ermittelt werden. 40 Beispiel 1

Die Art des Futters und seine Zusammensetzung ist hierbei Beimpft man einen 1 -Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml ohne Belang. Es können alle gebräuchlichen, handelsüblichen einer Nährlösung der Zusammensetzung oder speziellen Futterzusammensetzungen verwendet werden, 2,0% Maisstärke die vorzugsweise das übliche, für eine ausgewogene Ernährung 1,0% Glucose notwendige Gleichgewicht aus Energie- und Eiweissstoffen, 45 0,5% Kaseinhydrolysat einschliesslich Vitaminen und Mineralstoffen enthalten. Das 1,0% Hefeextrakt Futter kann sich beispielsweise zusammensetzen aus pflanzli- pH mit NaîCCh auf 7,2 eingestellt chen Stoffen z.B. ölkuchenschroten, Getreideschroten, Getrei- + 0,4% CaŒ>3 denebenprodukten, aber auch aus Heu, Gärfutter, Rüben und Sterilisation 30' bei 121 °C

anderen Futterpflanzen, aus tierischen Stoffen, z.B. Fleisch- und 50 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704

Fischprodukten, Knochenmehl, Fetten, Vitaminen, z.B. A, D, E, und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelma-

K und B-Komplex, sowie speziellen Proteinquellen, z.B. Hefen, schine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität sowie bestimmten Aminosäuren und Mineralstoffen und Spu- von 70 SIE/ml.

renelementen, wie z.B. Phosphor und Eisen, Zink, Mangan,

Kupfer, Kobalt, Jod usw. 55 Beispiel 2

Premixe können vorzugsweise etwa 0,1 bis 50%, insbeson- Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml dere 0,5 bis 5,0% (Gewicht) der Wirkstoffe der Formel I neben einer Nährlösung der Zusammensetzung beliebigen essbaren Trägerstoffen und/oder Mineralsalzen, z.B. 7,5% Malzextrakt kohlensaurem Futterkalk enthalten und werden nach den übli- 0,3% Kaseinhydrolysat chen Mischmethoden hergestellt. 60 0,7% Hefeextrakt

Mischfutter enthalten vorzugsweise 0,001 bis 5,0%, insbe- 0,3% CaCCh sondere 0,02 bis 2,0% (Gewicht) der Wirkstoffe neben den übli- 0,3% K2HPO4

chen Rohstoffkomponenten eines Mischfutters, z.B. Getreide- Leitungswasser, Sterilisation 30' bei 121 °C,

schrote oder -nebenprodukte, ölkuchenschrote, tierisches pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K2CO3 eingestellt

Eiweiss, Mineralien, Spurenelemente und Vitamine. Sie können 65 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704 nach den üblichen Mischmethoden hergestellt werden. und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelma-

Vorzugsweise in Premixen und Mischfuttermitteln können schine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität die Wirkstoffe gegebenenfalls auch durch ihre Oberfläche von 197 SIE/ml.

635 616

8

Beispiel 3: Nährlösung S3

Beimpft man einen 140-Liter-Fermenter, der 100 Liter Nährlösung der Zusammensetzung 7,5% Malzextrakt

0,3% Kaseinhydrolysat s

0,7% Hefeextrakt 0,3% CaCCh o,3% K2HPO4

Leitungswasser, Sterilisation 30' bei 121 °C,

pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K2CO3 eingestellt 10 enthält, mit 1,2 Liter Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10 1-Liter-Erlenmeyerschüttelkolbenmit je 120mlNährlö-sung derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 704 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 28 °C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 260 SIE/ml enthält. 15

Beispiel 4: Nährlösung A

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3,0% Sojamehl 3,0% Glycerin 0,2% CaCCb Leitungswasser Sterilisation 30' bei 121 °C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 437 SIE/ml.

25

30

Beispiel 5

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 35

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 162 SIE/ml.

40

Beispiel 6

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 1,0% Glucose

1,0% Stärke lösl. 45

0,5% Kaseinhydrolysat

0,75% Fleischextrakt

0,75% Peptone

0,5% Hefe-Extrakt

0,1% K2HPO4 50

0,3% NaCl

0,1% MgSC>4x7 H2O

Leitungswasser, pH mit Na2CC>3 auf 7,2 eingestellt ^

Sterilisation: 30' bei 121 °C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und 55 bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 36,4 SIE/ml.

60

Beispiel 7

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 200 ml einer Nährlösung nach Beispiel 3

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und « bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von 224 SIE/ml.

Beispiel 8

Beimpft man einen 140-Liter-Fermenter, der 100 Liter Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit 1,2 Liter Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10 1-Liter-Erlenmeyerschüttelkolben mit je 120 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 7 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 28 °C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 286 SIE/ml enthält.

Beispiel 9

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml . einer Nährlösung nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 1 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von 28,4 SIE/ml.

Beispiel 10

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 15,6 SIE/ml.

Beispiel 11

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 25,8 SIE/ml.

Beispiel 12

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 3,2 SIE/ml.

Beispiel 13

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 26,4 SIE/ml.

Beispiel 14

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 24,0 SIE/ml.

Beispiel 15

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung

9

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2,0% Maisstärke

0,5% Glucose

0,3% Kaseinhydrolysat pH mit Na2C03 auf 7,2 eingestellt

+0,4% CaCCh

Sterilisation: 30' bei 121 °C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 2 Tagen eine Aktivität von 81,7 SIE/ml und nach 3 Tagen eine Aktivität von 121 SIE/ml.

Beispiel 16

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 8,6 SIE/ml.

Beispiel 17

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 53,0 SIE/ml.

Beispiel 18

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 17,8 SIE/ml.

Beispiel 19

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 6,0 SIE/ml.

Beispiel 20

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 21,6 SIE/ml.

Beispiel 21

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 200 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 26,8 SIE/ml.

Beispiel 22

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2,0% Maisstärke s 1,0% Glucose 0,5% Kaseinhydrolysat 0,5% Hefe-Extrakt pH mit Na2CÛ3 auf 7,2 eingestellt +0,4% CaCCh io Sterilisation: 30' bei 121 °C enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 26,5 SIE/ml.

15

Beispiel 23

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 22 20 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 479 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 7,9 SIE/ml.

25 Beispiel 24

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 6

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 36 und 30 bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 5,4 SIE/ml.

Beispiel 25

35 Beimpft man einen 1 -Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 36 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, 40 so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 5,4 SIE/ml.

Beispiel 26

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml 45 einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 356 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität 50 von 9,0 SIE/ml.

Beispiel 27

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung 55 nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,0 SIE/ml.

60

Beispiel 28

65 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292 und bebrütet den Kolben bei 28 QC auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,2 SIE/ml.

635 616

10

Beispiel 29

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 742 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,8 SIE/ml.

Beispiel 30

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 740 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 5,7 SIE/ml.

Beispiel 31

Die Fermentationsbrühe aus einem 100-Liter-Fermenter nach Beispiel 3

wurde mit halbkonz. HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt und die Bakterienmasse nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt 70 Liter tiefbraune Kulturlösung mit einem SIE-Gehalt von 220 000 SIE/1. Diese Lösung wurde mit einer Fliessrate von 20 I/h über eine mit 12 kg Lewatit® SC 104 in der H+-Form gepackte Säule von 0 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine saccharaseinhibitorische Aktivität und wurde verworfen. Die Säule wurde mit 501 dest. H2O (Waschwasser I), 2010,01 n HCl und anschliessend nochmals 201 dest. H2O (Waschwasser II) gewaschen. Zur Desorption der Aktivität wurde nun 2,5% Ammoniak angeschlossen. Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluats und der Zunahme der Braunfärbung wird die saccharaseinhibitorische Aktivität eruiert. Der Vorlauf (201) bis zum Anstieg der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende Fraktion (351) im Rotationsverdampfer eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat, 31). Das Konzentrat wurde lyophilisiert. Man erhielt 288 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 38 000 SIE/g.

Beispiel 32

Die Fermentationsbrühe aus einem 100-Liter-Fermenter nach Beispiel 8

wurde mit halbkonz. HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt und die Bakterienmasse nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt 601 tiefbraune Kulturlösung mit einem SIE-Gehalt von 240 000 SIE/1. Diese Lösung wurde mit einer Fliessrate von 201/h über eine mit 12 kg Dowex 50 W x 4 in der H+-Form gepackte Säule von 0 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine saccharaseinhibitorische Aktivität und wurde verworfen. Die Säule wurde mit 501 dest. H2O (Waschwasser I), 2010,01 n HCl und anschliessend nochmals 201 dest. H2O (Waschwasser II) gewaschen. Zur Desorption der Aktivität wurde nun 2,5% Ammoniak angeschlossen. Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluats und der Zunahme der Braunfärbung wird die saccharaseinhibitorische Aktivität eluiert. Der Vorlauf (201) bis zum Anstieg der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende Fraktion (351) im Rotationsverdampfer eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat, 31). Das Konzentrat wurde lyophilisiert. Man erhielt 360 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 24 000 SIE/g.

Beispiel 33

50 g Rohprodukt I aus Beispiel 31 wurden fein zermörsert und anschliessend 3 x mit je 30 ml techn. Methanol extrahiert. Dazu wurde der Ansatz zunächst 2 Min. im Ultraturraxhomo-genisator homogenisiert, dann in ein 40-50 °C warmes Wasserbad eingebracht und 20' gerührt. Nach jeder Extraktion wurde durch ein Faltenfilter abfiltriert. Der nach der 3. Extraktion im Faltenfilter verbleibende Rückstand wurde im Vakuum getrocknet (28,4 g). Da die Testung nur eine geringe spezifische Aktivität dieses Rückstandes ergab, wurde er anschliessend verworfen. Die methanolischen Extrakte wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der im Kolben verbleibende aktive Rückstand wurde in 750 ml H2O gelöst (1 = 2,8 mS, pH = 7,2) und mit einer Fliessrate von 500 ml/h über eine 5x50-cm-Säule, gefüllt mit CM-Cellulose in der H+-Form (CM-Cellu-lose der Fa. Whatman, Typ C 52), gegeben. Man wusch mit 51 Wasser nach und schloss dann zur Elution 2010,002 n HCl an. Durchlauf, Waschwasser und Eluat wurden in ca. 0,5-1-Portio-nen fraktioniert aufgefangen. Die saccharaseinhibitorische Aktivität wurde bestimmt und alle Fraktionen, die mehr als 30 000 SIE/1 enthielten, vereinigt: Im Durchlauf die tiefbraun gefärbten Fraktionen 2-4 und im hellgelben Eluat die Fraktionen 16-35. Die vereinigten Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt 18,2 g der Durchlauffraktion 2-4 mit einer spezifischen Aktivität von 4000 SIE/g (verworfen) sowie 3,1 g des sog. Rohprodukts II mit 250 000 SIE/g (ca. 50-60% rein). Das Rohprodukt II ist stark hygroskopisch und zerfliesst an der Luft in kurzer Zeit zu einer klebrigen Masse.

Beispiel 34

2,5 g des Rohprodukts II aus Beispiel 33 werden zur Abtrennung der Hauptmenge der begleitenden Peptide in 15 ml Methanol gelöst und über eine 5 x 90 cm mit Sephadex LH 20 in Methanol gefüllte Säule chromatographiert. Bei einer Fliessrate von 100 ml/h und einer Temperatur von 4-5 °C sammelt man 10-ml-Fraktionen. 10 |il dieser Fraktionen werden auf einer Kieselgelplatte (Fa. Merck) aufgetragen und dünnschichtchro-matographisch im System Äthanol/25% NH3/H2O = 80/10/10 untersucht. Die nach DC Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 5-10 ml eingeengt und über die gleiche Säule rechromatographiert. Man analysierte die Fraktionen in der DC und vereinigte die Inhibitor-haltigen Fraktionen, wobei nur ein sehr enger Bereich geschnitten wurde. Man engt zur Trockne ein. Derart LH 20 gereinigter Inhibitor ist ca. 90% rein. Zur Abtrennung der letzten verbliebenen Peptidverunreinigun-gen nimmt man die nach dem Einrotieren als Rückstand verbleibende Substanz in 2-3 ml Methanol auf und versetzt die gelbe methanolische Lösung mit 50 jil konz. HCl. Nach kurzer Zeit, evtl. auch erst nach mehrstündigem Stehen, kristallisiert der Inhibitor in Form leicht gelblicher Würfel oder Quader aus. Die Peptide bleiben in der Mutterlauge. Man zentrifugiert die Kristalle ab, wäscht 1 x mit eiskaltem Methanol und löst den gewaschenen Niederschlag anschliessend unter Erhitzen in 2 ml Methanol wieder auf. Man setzt 4 ml Butanol hinzu und stellt über Nacht bei 4 °C ab. Die am nächsten Morgen ausgefallenen farblosen Kristalle werden abzentrifugiert, 1 x mit eiskaltem Methanol, Imal mit Aceton und lmal mit Äther gewaschen und anschliessend i.Vak. getrocknet. Ausbeute 460 mg des Inhibitors als Hydrochlorid mit 540 000 SIE/g.

Beispiel 35

Zum Nachweis saccharaseinhibitorischer Komponenten in Kulturlösung oder Rohprodukt wurde auch folgendes dünn-schichtchromatographisches Verfahren mit anschliessender Enzymreaktion auf der Platte benutzt, welches den Nachweis inhibitorischer Komponenten direkt auf der Platte gestattet. In dieser Dünnschichtchromatographie trägt man 1-5 |il der Fermentationsbrühen oder 1-5 ug der Präparate auf Kieselgelfer-tigplatten (Fa. Merck, Typ KG 60 F 254) auf und entwickelt in Äthanol/NH3/H20 = 8/1/1 (I) oder Äthylacetat/Methanol/Was-ser = 10/6/4(11)-

Zur direkten Sichtbarmachung der saccharaseinhibitori-schen Komponenten besprayt man die entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml/20 x 20 cm Platte) und

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

635 616

lässt das Gel erstarren. Dann wird für 5' in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorinkubiert und anschliessend satt mit Substratgel besprayt. Nach dem Erstarren dieser 2. Gelschicht bringt man die Platte in eine feuchte Kammer ein und inkubiert bei 40 °C. Die Inhibitionsfärbung (helle Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwickelt sich in 60-90'. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den darauf befindlichen Agarschichten am Föhn mit Warmluft getrocknet.

Bereitung der Gele

Enzymgel: 1,5 g Agarose (L'Industrie Biologique Française) wird in 100 ml 0,2 m Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und anschliessend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird auf 50 °C abgekühlt und mit 250 p.1 Triton X-100 Lösung (2 g Triton X-100 + 8 g Äthanol p.a.) und 0,5 ml Dianisi-dinlösung (20 mg Dianisidin/1 ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden 1 ml GOD/ POD-Reagens (12,5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa. Böhringer, Best-Nr. 15423 und 2,5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad II, Fa. Böhringer, Best-Nr. 15302, gelöst in 5 ml Maleinat-puffer) und 4-5 Einheiten Saccharase aus Schweinedünndarm (Enzympräparation wie unter Saccharasetest beschrieben) zugesetzt. Das Gel muss bis zum Versprayen auf 50 °C gehalten werden, da es sonst beim Sprayvorgang in den Düsen erstarrt. Substratgel: 0,5 g Agarose wird in 100-ml-Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt anschliessend auf 50 °C ab, versetzt mit 100 |il Triton (2 g Triton X-l 00 + 8 g Äthanol p.a.) und gibt 1 g Saccharose (Serva Nr. 35579) zu. Nach dem Lösen der Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.

Die Untersuchung der Kulturlösungen der Stämme mit dieser Methode ergaben saccharaseinhibitorische Komponenten mit folgenden RrWerten im System I

Stämme

Rf-Werte

DSM 7

0,25

DSM 741

0,25; 0,41; 0,50; 0,59; 0,71

DSM 704

0,25

DSM 372

0,25; 0,51; 0,60; 0,71

und folgenden RrWerten im System II

Stämme

RrWerte

DSM 704

0,05

DSM 479

(0,05); 0,22-0,35; 0,62-0,67; 0,88

DSM 741

(0,05); 0,23-0,35; 0,62-0,67

DSM 372

(0,05); 0,20-0,22

Beispiel 36

Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 1,0% Stärke 0,1% Glucose 0,5% Kaseinhydrolysat 1,0% Hefeextrakt pH mit NaîCCh auf 7,2 eingestellt +0,4% CaCCb Sterilisation: 30' bei 121 °C

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 479 s und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 2 Tagen eine Aktivität von 20,2 SIE/ml.

Beispiel 37

io Beimpft man einen 1-Liter-Erlenmeyerkolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2,0% Maisstärke 1,0% Glucose 0,5% Kaseinhydrolysat 15 1,0% Hefeextrakt 0,1% K2HPO4

pH mit NaîCOî auf 7,2 eingestellt +0,4% CaCCb Sterilisation: 30' bei 121 °C 20 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28 °C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 2,5 Tagen eine Aktivität von 50,3 SIE/ml.

25 Beispiel 38

Beimpft man 1-Liter-Erlenmeyerkolben, die 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung nach den Beispielen 1,2,4 oder 6 enthält, mit Sporensuspensionen der Stämme und bebrütet die Kolben bei 28 °C auf Rundschüttelmaschinen, so zeigen 30 die Kulturlösungen nach 4 Tagen folgende Aktivitäten:

Stamm

Nährlösung

Aktivität der Kulturlösung nach 4

nach Beispiel

Tagen in SIE/ml

KA-63

4

31

1

6,6

6

25

2

7,9

IAM 1523

4

50

1

4,3

6

3,8

2

2,7

OUT 8108

4

8,4

1

3,6

2

3,1

OUT8IIO

4

28

1

71

6

69

2

104

S 202

4

38

1

10,6

2

14,4

S 204

4

54

1

2,7

S 219

4

28

1

1,5

2

10,3

S 242

1

17

4

3,8

2

4,1

G

Claims

635 616

1. Verwendung von Organismen der Familie Bacillaceae zur Gewinnung von Inhibitoren für Glykosidhydrolasen.

2. Verwendung von Organismen der Gattung Bacillus gemäss Anspruch 1.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verwendung von Organismen der Arten B. subtilis, B. subtilis var. niger, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. longi-sporus und B. polymyxa gemäss Anspruch 1.

4. Verwendung der Stämme DSM 292, DSM 356, DSM 36, DSM 740, DSM 741, DSM 1, DSM 479, DSM 365, DSM 742, DSM 7, DSM 372, DSM 675, DSM 704, DSM 1060, DSM 1061, DSM 1062, DSM 1063, DSM 1064, DSM 1065, DSM 1066 und DSM 1067 gemäss Anspruch 1.

5. Verwendung von Organismen der Gattung Bacillus zur Gewinnung von 1-Desoxynojirimycin.

6. Verwendung der Stämme DSM

7, DSM 704, DSM 675 und DSM 372 zur Gewinnung von 1-Desoxynojirimycin.

Es ist bekannt, dass eine Reihe von Actinomyceten, vor allem Actinoplanaceen Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden (DT-OS 2 064 092).

Weiterhin weiss man, dass Nojirimycin, ein bakteriostatisch wirkendes Antibioticum aus Stämmen der Gattung Streptomy-ces, gewisse mikrobielle a-Glucosidasen hemmt (T. Niwa et al. Agr. Biol. Chem. 34,966 [1970]).