DE2209832B2 - Herstellung von Saccharaseinhibitoren - Google Patents
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Description
Gegenstand älterer Patentanmeldungen (z. B. deutsche Patentanmeldung P 20 64 092.0) ist die Erkenntnis,
daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem die Actinoplanaceen, Inhibitoren für Glykosidhydrolasen,
insbesondere kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren
ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in
die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.
Die meisten der Inhibitoren aus dieser Gruppe sind hochpotente Amylaseinhibitoren, aber nur mittelstarke
oder schwache Saccharaseinhibitoren.
Die Erfindung befaßt sich mit der Umwandlung der genannten Amylaseinhibitoren in potente Saccharaseinhibitoren.
Dieses Verfahren zur Hersteilung von Saccharaseinhibitoren ist dadurch gekennzeichnet, daß
man die von den Actinoplanaceenstämmen CBS 957.70, 961.70 und 615.71 gebildeten Amylaseinhibitoren in 1 bis
40% Lösung mit 0,1 bis 5 n-Mineralsäuren während 0,1 bis 6 Stunden bei 60 bis 1100C hydrolysiert oder sie
enzymatisch hydrolysiert.
Amylasetest
Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu
50% inhibieren. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten
angegebenen Testbedingungen 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μ\α\
gespaltenen Bindungen werden als μνβΐ gebildeter
reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve
als μν&\ Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung
des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20 — 22 AE/ml) mit 0-10μg Inhibitor oder 0-20 μΐ der zu
testenden Lösung in 0,4 ml 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer/0,001-m CaCl2 pH 6,9 versetzt und etwa
10 — 20 Minuten in einem Wasserbad von 35°C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf
35° C vorgewärmten 1% Stärkelösung bei 35° C inkubiert und anschließend mit 1 ml Dinitrosalicylsäure-Reagens
(nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., Band 1, Seite 149) versetzt. Zur
Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit
10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten
Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve
die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung
der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten
μ» Inhibitor*)
AE**)
AE**)
*l Bezogen iiuf Trockcnsiihsuiu/.
**) AE im nichl inhibierten Ansät/ der gleichen Serie.
**) AE im nichl inhibierten Ansät/ der gleichen Serie.
aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AI E/mg Inhibitor umgerechnet.
Saccharasetest
Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert
als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibieren. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die
Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 μΜοΙ Saccharose in
Glucose und Fructose spaltet. Die μΜοΙ gebildete Glucose wird mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion
quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharose nicht
mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12SE eingestellten Saccharaselösung1)
mit 0 — 20 μg Inhibitor oder 0—20 μ! der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1-m Natriummaleinatpuffer
pH 6,0 auf 0,1ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer
auf 35°C vorgewärmten 0,05-m Saccharoselösung in 0,1-m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man
inkubiert 20 Minuten bei 35° C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens2)
ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35° C. Danach wird 1 ml 50% H2SO4 zugesetzt und bei
545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.
Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50%
Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.
Die Umwandlung der Amylaseinhibitoren in Saccharaseinhibitoren geschieht durch Abspaltung hemminaktiver
Molekülbruchstücke (meist Mono-, Di- oder Trisaccharide) aus den Inhibitor-Molekülen. Diese
Abspaltung hemminaktiver Molekülbruchstücke erfolgt durch enzymatisch-hydrolytische oder durch chemischhydrolytische Spaltung; am besten bedient man sich der
Säurehydrolyse unter folgenden Bedingungen:
l-40%ige, am besten 2-20%ige, Lösungen der vorgenannten hochpotenten Amylaseinhibitoren werden
in 0,1 —5 n-, am besten 0,5 — 2 n-Mineralsäuren, am günstigsten HCl oder H2SO4, während 0,1 —6 Stunden,
am besten während 0,5-4 Stunden, bei 60-110°C, am günstigsten 80-100° C, hydrolysiert. Dabei beobachtet
man mit zunehmender Hydrolysedauer einen steilen Abfall der amylaseinhibitorischen Aktivität der Lösungen
bei gleichzeitigem steilem Anstieg und anschließen-
') Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa
nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12, (1958), Seite 1997. Mit 0,1-m Natriummaleinatpuffer pH
6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.
2) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösung von 2 mg Glucoseoxidase in 100 ml 0,565-m Tris-HCl-Puffer pH 7,0
2) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösung von 2 mg Glucoseoxidase in 100 ml 0,565-m Tris-HCl-Puffer pH 7,0
b5 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g
Triton X 100 + 8 g 95% Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin ■ 2 HCI in 20 ml H2O) und 0,5 ml
0,l%iger wäßriger Peroxidaselösung hergestellt.
dem flachem Abfall der saccharaseinhibitorischen Aktivität der Lösungen. Der Quotient
./ AIC
Kurve 1:
Kurve 2:
Kurve 3:
Kurve 4:
Kurve 5:
Kurve 6:
Kurve 2:
Kurve 3:
Kurve 4:
Kurve 5:
Kurve 6:
In-HCI
In-HCl
0,75 n-HCl
0,75 n-HCl
0,5 n-HCl
0,5 n-HCl
In-HCl
0,75 n-HCl
0,75 n-HCl
0,5 n-HCl
0,5 n-HCl
20 mg/ml,
200 mg/ml,
200 mg/ml,
20 mg/ml,
200 mg/ml,
200 mg/ml,
20 mg/ml,
200 mg/ml.
200 mg/ml.
Kurve 1: | 2 | η | η | η | η | 90° | C, |
Kurve 2: | 2n | η | η | 80° | C, | ||
Kurve 3: | 1 | 0,5 | η | 90° | C, | ||
Kurve 4: | 1 | 2 | 80° | C, | |||
Kurve 5: | 2 | 90° | C, | ||||
Kurve 6: | 1 | 70° | C = 0,5 800C, | ||||
Kurve 7: | 60° | C, | |||||
Kurve 8: | 70° | C. |
Die Isolierung des saccharaseinhibierenden Prinzips aus derartigen Hydrolysaten geschieht am besten durch
Adsorption an Aktivkohle nach vorherigem Neutralisieren
des Hydrolats und anschließender fraktionierender Desorption des Inhibitors von der Kohle mit wäßrigen
Alkoholen oder wäßrigem Aceton. Wenn die Hydrolysate sehr dunkel gefärbt sind, werden sie vor der
Adsorption des Saccharaseinhibitors an die Kohle bei sauren pH-Werten (pH 1 -3) mit Aktivkohle entfärbt.
Die Hemmkapazität der besten Inhibitorpräparate beträgt 15 000 SIE/g.
Der erfindungsgemäße Abbau kann auch enzymatisch erfolgen, wofür sich /J-Amylase besonders eignet.
Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von saccharosehaltigen Nahrungs- und
Genußmitteln Hyperglykämien auftreten, die infolg" einer raschen Spaltung der Saccharose durch Saccharasen
des Verdauungs.raktes nach folgendem Schema
■*
steigt mit steigender Hydrolysedauer entsprechend steil an [vergleiche F i g. 1. Diese zeigt den zeitlichen Verlauf
des Amylaseinhibitorgehaltes (1) und Saccharaseinhibitorgehaltes (2) sowie des Quotienten /(3) einer 2%igen
Lösung des Amylaseinhibitors aus dem Stamm CBS 961.70 bei Hydrolyse in 0,5 n-HCl bei 100°C über 0 - 100
Minuten. Auf der x--Ach.se ist die Zeit in Minuten, auf der yi-Achse AIE χ 106 pro Liter, auf der j^-Achse
SIE χ 103 pro Liter und auf der/3-Achse der Quotient λ
aufgetragen]. Hohe Säurekonzentrationen, niedrige Konzentrationen des Inhibitors in der Lösung und hohe
Temperaturen innerhalb der im Patentanspruch genannten Bedingungen bewirken ein besonders starkes
Ansteigen des /-Wertes, also eine besonders kräftige Verschiebung der Saccharase/Amylase-Inhibitionsrelation
zur Saccharase (vgl. F i g. 2 und 3. Diese Abbildungen zeigen den zeitlichen Verlauf der Saccharase/Amyiase-Inhibitionsrelation
gegen die Hydrolysezeit bei verschiedenen Hydrolysebedingungen). In
beiden Abbildungen zeigt die x-Achse die Zeit in Minuten, die y-Achse den Quotient f.
F i g. 2 zeigt den Hydrolyse-Verlauf bei 100° C
F i g. 2 zeigt den Hydrolyse-Verlauf bei 100° C
Fig.3 zeigt den Einfluß der Säurekonzentration und
Hydrolysetemperatur auf das SIE/AIE-Verhältnis.
C = 20 mg Amylaseinhibitor aus Stamm SE 50/ml Säure (HCI).
Saccharase
Saccharose
» Glucose + Fructose
bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt.
Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Irisulinbekretion, die
ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt.
Die erfindungsgemäß nach obigen Methoden gewonnenen und dann isolierten Saccharaseinhibitoren vermindern
die alimentäre Hyperglykämie und Hyperinsulinämie nach Belastung mit Saccharose erheblich.
Weiter ist bekannt, daß Karies nach Genuß von saccharosehaltigen Genuß- und Nahrungsmitteln besonders
stark und häufig vorkommt (z.B. W. Gold;
Advances in Applied Microbiology Il 1 [1969] 135— 157). Eine Hemmung der Saccharosespaltung durch erfindungsgemäßen
Inhibitor vermindert die Bildung kariogener Stoffe in der Mundhöhle.
5 g des Amylaseinhibitors aus dem Actinoplanaceen-Stamm
CBS 961.70 mit 10 χ 10° AIE/g und 220 SIE/g
wurden in 50 ml 0,05-m Na-Acetatpuffer pH 4,5 gelöst und mit 25 mg jS-Amylase aus Gerste versetzt und bei
35°C inkubiert. Nach 3 Stunden war die Spaltung beendet. Der Inkubationsansatz wurde direkt in 450 ml
Trockensprit unter Rühren eingetropft, die weiße flockige Fällung abgenutscht, mit Äthanol und Äther je
2mal gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Ausbeute:
' 2,5gmit4,6 χ 106 AIE/gund 700SlE/g.
' 2,5gmit4,6 χ 106 AIE/gund 700SlE/g.
100 g des Amylaseinhibitors aus dem Stamm CBS
•40 961.70 wurden in 500 ml 2 n-H2SO4 gelöst und 4 Stunden
bei 100°C hydrolysiert. Die schwarzbraune Lösung
wurde nach dem Abkühlen mit 1On-KOH auf pH 2,0 eingestellt und zur Entfärbung 2mal mit je 4 g
Aktivkohle versetzt, jeweils ca. 10 Minuten gerührt und j abgenutscht. Die Kohle wurde verworfen, das hellgelbgefärbte Filtrat mit 1On-KOH neutralisiert (pH 6,6).
Man versetzte mit 20 g Aktivkohle zur Adsorption der hemmaktiven Bruchstücke an die Kohle. Nach 1 Ominütigem
Rühren wurde abgenutscht und das Filtrat nochmals mit 10 g Aktivkohle adsorbiert. Die Kohlerückstände
wurden vereinigt, das Filtrat verworfen. Die vereinigten Kohlerückstände wurden zur Entfernung
restlicher Salze und Glucose mit 2 Liter destilliertem Wasser und 2 Liter 2,5°/oigem Äthanol auf der Nutsche
gewaschen und anschließend je 3mal mit je 750 ml 10%igem und dann 15%igem Äthanol desorbiert. Zur
Desorption wurde jeweils 10 Minuten gerührt, dann abgenutscht und mit frischem Desorptionsmittel versetzt.
Die entsprechenden Filtrate der 10% bzw. 15%
bo Desorption wurden vereinigt, am Rotationsverdampfer
auf ca. 20 ml eingeengt und anschließend lyophilisiert.
Ausbeute:
ca. 2 g der 10% Fraktion und
b5 1,2 g der 15% Fraktion.
b5 1,2 g der 15% Fraktion.
Spez. Aktivität:
10% Fraktion 9 000SIE/g;O,2 χ 10°AIE/g;
15% Fraktion 15 000SlE/g;O,5 χ IO"AIE/g.
200 mg eines aus dem Actinoplanaceen-Stamm CBS
615.71 isolierten Amylaseinhibitors (6 χ 10hAIE/g, 160
SIE/g) wurden in 10 ml 0,75 n-HCI gelöst. Die Ausgangslösung hatte eine Aktivität von 120 χ IOb
AIE/Liter bei 3200 SIE/Liter. Diese Lösung wurde 30
Minuten bei 1000C im Wasserbad inkubiert, dann abgekühlt und getestet. Der Gehalt des so gewonnenen
Hydrolysats am Amylaseinhibitor betrug 8 χ 10h AIE/Liter, der Gehalt an Saccharaseinhibitor 21 000
SIE/Liter.
200 mg eines aus dem Actinoplanaceen-Stamm CBS 957.70 isoliertem Amylaseinhibitors (4 χ \0b AIE/g, 310
SIE/g) wurden in 10 ml 0,75 n-HCI gelöst. Die Ausgangslösung hatte eine Aktivität 80 χ \0h AIE/Liter
und 6200 SIE/Liter. Diese Lösung wurde 30 Minuten bei 100DC im Wasserbad inkubiert, dann abgekühlt und
getestet. Der Gehalt des so gewonnenen Hydrolysats an Amylaseinhibitor betrug 10 χ 10fcAIE/Litcr, an Saccharaseinhibitor
28 000 SIE/Liter.
2(1
Versuchsanordnung zum Wirkungsnachweis vom Wirkstoff aus Beispiel 2 an Ratten im Saccharosebelastungsversuch.
Zur Erzeugung einer Hyperglykämie und Hyperinsulinämie
nach Kohlenhydratvcrfüttcrung erhalten Ratten (n = 6) 2,5 g/kg Saccharose als Lösung per os. Einer
gleichen Anzahl von Ratten wird zusätzlich zur Saccharose der genannte Wirkstoff zur Abschwächung
der Hyperglykämie und Hyperinsulinämie oral appliziert. Blulglucose und Seruminsulin werden in den
angegebenen Zeitabständen nach Kohlenhydratbelastung bestimmt. Die Bestimmung reduzierender Kohlenhydrate
erfolgt im Auto-Analyzer (Hoffman: J. biol. Chem. 120, 51 [1937]), die Bestimmung des Insulins
nach H a I e s und R a η d 1 e (Biochem. J. 88, 137 [1963]). Blut wird aus dem retroorbilalen Venenplexus der
Ratten entnommen.
Tabelle 1 zu B e i s ρ i e 1 5
Blutglucose in mg % (Mittelwert ± Is) und Seruminsulin
in μΕ/ml (Mittelwert ±ls) von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose
± Wirkstoff aus Beispiel 2.
Dosis/kg
p.os..
p.os..
lilutgluco.se 10
20 Min.
Scmminsulin
10
10
20 Min.
Kontrolle ohne Saccharose | 79± 5,9 | 79 + | 4,8 | 17 ± 11,0 | 9± 7,3 |
Kontrolle mit Saccharose | 142±20 | 148 + | 17 | 31 ±14,2 | 39 ±13,2 |
Saccharose + 100 SIF. | 95+ 5,3 | 94 + | 6,3 | 8± 5,7 | 7± 2,8 |
Saccharose + 1000 SIE
83 ± 5,2 85 ± 7,6
I'<0.001 gegen Saccharose-Kontrolle.
1><(),()1 gegen Saccharose Kontrolle. P <(),05 gegen Saccharose-Kontrolle.
11± 6,0
8± 5,4
Hierzu 3 BKitt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Saccharaseinhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man die von den Actinoplanaceenstämmen CBS 957.70, 961.70 und 615.71 gebildeten Amylaseinhibitoren in 1- bis 40%iger Lösung mit 0,1 bis 5 n-Mineralsäuren während 0,1 bis 6 Stunden bei 60 bis 1100C hydrolysiert oder sie enzymatisch hydrolysiert.
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