DE2209833C3 - Herstellung eines Amylaseinhibitors - Google Patents

Herstellung eines Amylaseinhibitors

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Description

Gegenstand älterer Patentanmeldungen (deutsche Patentanmeldung P 20 64 092.0, brit Patentanmeldung Nr. 59 939/71) ist die Erkenntnis, daß eine Reihe von Actinomyceteii Inhibitoren von Glycosidhydrolasen, und zwar insbesondere Inhibitoren für Glycosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes, bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säure- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.
In den genannten Patentanmeldungen, z. B. in den Beispielen 28 — 38 der deutschen Patentanmeldung, wird die Gewinnung eines derarigen Amylaseinhibitors aus dem zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Actinoplanaceen-Stamm SE 50 beschrieben. Die Kulturlösungen optimaler Fermentationen dieses Stammes enthalten ca. 30 000-40 000 AIE/ml, die daraus gewonnenen reinsten Inhibitoren besitzen spezifische Aktivitäten von3-8 ■ WAmylase-InhibitorEinheiten (AI E)/g.
Aufgabe der Erfindung ist die Ermittlung eines Verfahrens zur Herstellung eines Amylaseinhibitors, bei dem wesentlich höhere Ausbeuten und reinere Produkte als nach dem Verfahren der genannten Patentanmeldungen erhalten werden.
Dabei wurde gefunden, daß bei Verwendung einer Variante des Stammes SE 50, nämlich des Stammes SE 50/13, und bei Verwendung von Nährlösungen mit einem hohen Stärkegehalt, Kulturbrühen mit Gehalten von 100 000-110 000 AIE/ml erhalten werden.
Die erfindungsgemäß einzusetzende Variante SE 50/13 erhält man, wenn man Kulturen des Stammes SF 50 auf Nähragrarplatten ausstreicht oder anderweitig auf dem Nähragrar verteilt und nach mehrtätiger Bebrütung, z. B. bei 28° C, die sich entwickelten Kolonien abimpft und auf ihre Fähigkeit, Amylaseinhibitor zu produzieren, prüft. Man kann die Ausbeute an Varianten in bekannter Weise erhöhen, wenn man die Kultur vor dem Ausstreichen Mutagenen aussetzt.
Außerdem hat es sich gezeigt, daß sich das inhibierende Prinzip bei neutralen pH-Werten (5-8) direkt aus der Kulturlösung an Aktivkohle adsorbieren und mit wäßrigen Alkoholen oder Aceton, besonders bei sauren pH-Werten (1 —3), wieder desorbieren läßt. Da bei sauren pH-Werten (1 -3) überraschenderweise nur spurenweise Adsorption des inhibierenden Prinzips, dagegen aber sehr starke Adsorption der die Kulturbrühen verunreinigenden Farbstoffe an die Kohle stattfindet, kann man mit einer derartigen Voradsorption der Kulturlösungen bei sauren pH-Werten reinere Inhibitoren mit höherer spezifischer Aktivität gewinnen. [A b b.: Diese zeigt die Adsorption des amylaseinhibierenden Prinzips und der braunen Farbstoffe (gemessen als Extinktion bei 550 nm) aus der Kulturlösung bei sauren b;'.w. neutralen pH-Warten.]
Die wie oben erhaltenen Varianten müssen nicht
.1°
35
40
fio notwendigerweise in allen Nährlösungen mehr Amylaseinhibitor bilden als der Eiternstamm. Es hat sich jedoch gezeigt, daß besonders hohe Ausbeuten an Amylaseinhibitor gebildet werden, wenn man in der Nährlösung mit Stärkegehalten von 4 - 6% arbeitet.
Kultiviert man z. B. in einer Nährlösung, die neben 2% Stärke noch 1% Glucose, 0,5% Caseinhydrolysat, 1% Hefeextrakt und 0,4% CaCO3 enthält, 3 Tage bei 28° C, so erhält man mit dem Stamm SE 50 Nährlösungen, die 30-40000 AIE/ml und mit dem Stamm Se 50/13 Nährlösungen, die 50-60 000 AIE/ml enthält
In einer Nährlösung der Zusammensetzung 5% Stärke, 1% Hefeextrakt, 0,2% K2HPO4 erhält man nach 3tägiger Fermentation dagegen mit dem Stamm SE 50 50-60000 AIE/ml, mit dem Stamm SE 50/13 100-130 000 AIE/ml.
Die Ausbeute an Amylaseinhibitor ist vom Gehalt an Stärke abhängig. Bis etwa 5,5-6% Stärke in der Nährlösung steigt der Gehalt an Amylaseinhibitor an. Bei höheren Konzentrationen werden die Nährlösungen zu viscos, so daß andere Einflüsse, wie z. B. die schlechte O2-Versorgung, während der Fermentation die Ausbeute vermindern.
Die übrigen Bestandteile der Nährlösung können stark schwanken. Man kann anstelle der Stickstoffquellen Caseinhydrolysat -l- Hefeextrakt nur die entsprechende Menge Hefeextrakt oder Caseinhydrolysat verwenden oder beide durch andere Stickstoffquellen, wie z. B. Pepton, ersetzen.
Auch das Puffersystem, bestehend aus der Anfangseinstellung, dem CaCO3 und dem Kaliumphosphat, kann verschieden zusammengesetzt sein. Es muß nur gewährleistet sein, daß der pH-Wert während der Fermentation selbstverständlich in physiologischen Grenzen, d. h. zwischen 5,0 und 8,5, am besten zwischen 6,0 und 7,8, bleibt. Dies kann auch durch automatische Säuren-Laugen-Zugabe erreicht werden.
Andere Zucker, wie Glucose, können, in kleinen Konzentrationen zugesetzt, die Fermentation, besonders das Anwachsen, beschleunigen.
Der Stamm SE 50 ist im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn/Holland unter der Nummer CBS 961.70 und der Stamm SE 50/13 unter der Nummer CBS614J1 hinterlegt.
Die Erfindung ist also durch den Patentanspruch definiert.
Amylasetesi
Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (1 AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Amylaseeinheit (AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen I μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spaltet. Die μνβΐ gespaltenen Bindungen werden als μ\α\ gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosalicylsäure kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Maltoseeichkurve als μ VaI Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20 — 22 AE/ml) mit 0-10μg Inhibitor oder 0-20 μΐ der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02 m Natiriumglycerophosphatpuffer/0,001 m CaCb pH 6,9 versetzt und etwa 10-20 Minuten in einem Wasserbad von 350C äquilibriert. Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 350C vorgewärmten 1% Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35° C inkübicrt und anschließend mit! m! Dinitrosä!icw!säur£- Reagens (nach P. Bernfeld in Colowick-Kaplan,
Meth. Enymol, Band 1, Seite 149) versetzt Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichicurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten
μ% Inhibitor*)
AE**)
·) Bezogen auf Trockensubstanz.
**) AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen Serie.
aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf Al E/mg Inhibitor umgerechnet.
Zur Herstellung derartiger hochaktiver Inhibitoren wird der Stamm SE 50/13 in einer Nährlösung aus 5% Stärke, 1% Hefeextrakt und 0,2% K2HPO4 3 Tage bei 28° C in Schüttelkolben oder Fermentern verschiedener Größe fermentiert. Nach Beendigung der Fermentation stellt man zur Entfärbung den ganzen, braungefärbten Ansatz mit halbkonz. HNO3 auf pH 1—3, an-, besten 2 — 2,5, ein und versetzt mit 2—10g, am besten 5g, Aktivkohle/Liter Kulturlösung. Anschließend trennt man das Mycel und die Aktivkohle durch Zentrifugieren oder Filtrieren, evtl. unter Zuhilfenahme eines Filterhilfsmittels, ab und gewinnt aus dem klaren, hellgelben Überstand bzw. Filtrat nach Neutralisation mit NH3 die Aktivität durch Einengen und fraktionierte Alkoholfällung nach Beispiel 38 der deutschen Patentanmeldung P 20 64 092.0 oder durch Adsorption an Aktivkohle. Dazu wird das neutralisierte Filtrat mit 0,3—1,5g, vorzugsweise 0,75-1 g, Aktivkohle pro 106 AIE versetzt, 10—120 Minuten, vorzugsweise 20-30 Minuten, bei Raumtemperatur gerührt und abfiltriert — evtl. unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmittel. Vom Kohlerückstand wird das inhibierende Prinzip mit 30 — 60%, am besten 50%, Äthanol oder 30-60%, am günstigsten 50%, Dioxan oder 20-50%, am besten 35%igem, Acetan bei am günstigsten sauren pl ί-Werten von 2 — 3 desorbiert.
Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von stärkehaltigen Nahrungs- und Genußmitteln Hyperglykämien auftreten, die infolge einer raschen Spaltung der Stärke durch Amylasen des Verdauungstraktes nach folgendem Schema
Stärke
Amylase, Maltase
Glucose
bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die aiimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Insulinsekretion, die ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an eine derartige Hyperglykämie tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Hyperinsulinämie häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämie als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastnüs, eines Ulcus duodeni oder ventriculi auslöst oder begünstigt.
Es hat sich nun gezeigt daß nach erfindungsgemäßer Methode gewonnener und isolierter und gereinigter Amylaseinhibitor die aiimentäre Hyperglykämie und Hyperinsulinämie nach Belastung von Ratten und Menschen mit gekochter und ungekochter Stärke erheblich vermindert Der erfindungsgemäß erhaltene Inhibitor eignet sich deshalb als Therapeuticum für die folgenden Indikationen:
Adipositas, Hyperlipämie (Atherosklerose), Diabetes,
ι ο Prädiabetes, Ulcus ventriculi et duodeni.
Dosierung:
1000-100 000 AIE/kg ein oder mehrmals täglich vor und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten p. os.
Zubereitungsformen:
Tablette, Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granulat, Kaugummi und als Zusatz zu stärkehaltigen Lebens- und/oder Genußmitteln.
Vergleich
Beimpft man einen l-Liter-Erlenmeyerkolben mit 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2% Stärke, 1% Glucose, 0,5% Caseinhydrolysat, 1,0% Hefeextrakt, 0,4% CaCO3.(Sterilisation: 30 Minuten 121°C, pH vor der Sterilisation auf 7,2 mit KOH eingestellt) mit 1 ml einer Vorkultur des Stammes SE 50/13 (gewonnen in einer Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glycerin, 3% Sojamehl, 0,2% CaCO3, Sterilisation: 30 Minuten 121°C, pH nach Sterilisation 7,2) und bebrütet auf einer Rundkettelmaschine bei 280C, so erhält man nach 3tägiger Fermentation eine Kulturbrühe,die 55 000AIEZmI enthält.
Versuch 1
Arbeitet man nach dem Vergleich, jedoch mit einer Nährlösung der Zusammensetzung 5% Stärke, 1,0% Hefeextrakt, 0,2% K2HPO4, so erhält man eine Kulturbrühe,die 108 000 AlE/ml enthält.
Versuch 2
Beimpft man eine Nährlösung der Zusammensetzung 4% Stärke, 0,7% Hefeextrakt nach dem Vergleich mit dem Stamm SE 50/13, so erhält man nach 3tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 80 ΓΟ0 AlE/ml.
Versuch 3
55
Beimpft man eine Nährlösung der Zusammensetzung
5% Stärke, 1,0% Hefeextrakt, 0,4% K2HPO4 nach dem Vergleich mit dem Stamm SE 50/13, so erhält man nach 4tägiger Fermentation eine Kulturbrühe mit 105 000 AI E/ml.
Versuch 4
Beimpft man eine Nährlösung der Zusammensetzung
fts 6% Stärke, 1,3% Hefeextrakt, 0,2% K2HPO4 nach dem Vergleich mit dem Stamm SE 50/13, so erhält man nach 4iagigcr Fermentation eine Kuiturbrühe mit i2öööÖ AI E/ml.
Versuch 5
Beimpft man einen Glasfermenter mit 8 Ltr. Nährlösung nach Versuch 1 mit einem 3 Tage alten Schüttelkolben und bebrütet unter intensiver Rührung und Belüftung 3 Tage bei 28° C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 105 000 AIE/ml enthält.
Aufarbeitung der Kulturbrühe des Versuchs 5
IO
6 Ltr. Fermentationsbrühe (105 · 10* AIE/Ltr, Gesamtaktivität 630· 106AIE) nach Versuch 5 werden nach dem Abkühlen auf 20° C mit halbkonzentrierter HNO3 auf pH 2,5 eingestellt, mit 30 g Carboraffin-Aktivkohle versetzt und 10 Minuten gerührt. Anschließend ,5 wird 15 Minuten bei 10 000 Upm zentrifugiert und der klare, hellgelbe Überstand (5,1 Ltr, 100 ■ 10« AIE/Ltr, Gesamtaktivität 510 · 10* AIE) nach Neutralisation mit NH3 auf 500 ml eingeengt (970 · 10« AIE/Ltr, Gesamtaktivität 485 · 10* AIE). Die 500 ml Konzentrat wurden 45 Minuten mit 200g Amberlite IRA 410Cl- gerührt, abgenutscht und mit Vs Vol.-400 ml Methanol versetzt, um die Hauptmenge der höhermolekularen Stärkeabbauprodukte (zusammen mit noch vorhandenen Aktivkohleresten) auszufällen. Es wird 5 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert. Die 850 ml überstand (450 ■ 10« AIE/Ltr, Gesamtaktivität 380 · ΙΟ6 AIE) werden unter intensivem Rühren in 4 Ltr. Trockensprit eingetropft. Die weiße, flockige Fällung wird abgenutscht, 3mal mit Trockensprit und 2mal mit Äther ,0 gewaschen und im Vakuum bei 50° C getrocknet. Ausbeute: 36 g eines weißen Pulvers mit 10 · 106 AIE/g (Gesamtaktivität 360 ■ 106AIE) = SZ0Zo Ausbeute (bezogen auf Aktivität).
Aufarbeitung einer erfindungsgemäß erhaltenen Kulturbrühe
2 Ltr. Fermentationsbrühe (100 ■ 10- AIE/itr, Gesamtaktivität 200 · 10* AIE) werden mit halbkonz. HNO3 auf pH 2,5 eingestellt und mit 10 g Carboraffin-Aktivkohle versetzt. Nach lOminütigem Rühren werden bei 15 000 Upm in 20 Minuten das Mycel und die Kohle sedimentiert. Der klare Überstand (1,6 Ltr, 95- 10* AIE/Ltr, Gesamtaktivität 152 · 106AIE) wird nach dem Neutralisieren mit Ammoniak mit 120 g Aktivkohh versetzt und 1 Stunde gerührt. Danach werden 60 j Clarcell als Filterhilfsmittel zugesetzt und anschließe™ abgenutscht. Der Kohlerückstand wird mit 500 m Wasser und 500 ml 10% Äthanol gewaschen unc anschließend 2mal mit je 500 ml 35%igem Aceton, da: vorher mit HCI auf pH 2,5 eingestellt worden war versetzt und 20 Minuten gerührt. Nach dem Rührer wird abgenutscht und die Filtrate vereinigt (900 ml 120 · 106 AIE/Ltr, Gesamtaktivität 110 · 10* AIE). Da; Desorbat wird mit NHj neutralisiert und auf 50 ml arr Rotationsverdampfer bei ~ 20 Torr eingeengt, mit 40 m Methanol unter Rühren vorgefällt (Fällung verwerfen und das Filtrat in 500 ml Trockensprit unter intensiven Rühren eingetropft. Der Niederschlag wird abge nutscht, mit Äthanol und Äther gewaschen und irr Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute 4,9 g mit 14 ■ 10* AIE/g s 340/0 Ausbeute, bezogen au Aktivität der Ausgangslösung.
Versuchsanordnung zum Wirkungsnachweis des
erfindungsgemäß erhaltenen Amylaseinhibitors
an Ratte und Mensch
Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie nach Applikation von Stärke erhalten Ratten (n=6) 1 g gekochte Stärke/kg p. os. Jeweils 6 andere Ratter erhalten zusätzlich zur Stärke den bei der Aufarbeitung der Kulturbrühe des Versuchs 5 erhaltenen Amylaseinhibitor in der angegebenen Dosierung. Die Blutglucose wird in den angegebenen Zeitintervallen nach Stärkeapplikation im Blut aus dem retroorbitalen Venenplex j< mit einem Auto-Analyzer (Technicon®, nach Hoffman: J. bioLChem. 120,51 [1937]) bestimmt.
Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Hyperinsulinämie bei Menschen (n—7 —8) werden 60 g gekochte Stärke verabreicht Die Blutglucose wird unmittelbar vor Versuchsbeginn und in kurzen Abständen danach, wie oben angegeben, im Kapillarblut dei Fingerbeere bestimmt In weiteren Versuchen wird dei Wirkstoff zu der Stärkesuspension hinzugegeben.
Insulinbestimmungen erfolgten radioimmunologisch in Anlehnung an die Doppelantikörpermethode vor Haies und Rändle (Biochem. J. 88, 137 [1963]) inSerum aus Venenblut
Tabelle 1
Durchschnittliche Blutglucose in mg/100 ml ± Is von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke ± Amylaseinhibitor.
S Min.
lOMin.
15 Min.
20 Min.
30 Min.
45 Min.
Kontrolle ohne Stärke 67±4,9 74±13 69+5,0 68±3,6 64±8,1 Kontrolle mit Stärke 111 ±7,2 128±9,1 142±6,5 132±8,7 132±7,5 Stärke + 0,02Mega AIE/kg 105 + 8,8 111±8,2 UJ±8,6 U8±7,6 1PJ±7,3 Stärke+0,05Mega AIE/kg 1QO±9,1^ 10J±6,2 UJ±5,5 107±5,3_ ?_9±_72? Stärke+ 0,12Mega AIE/kg 86±8,5 !1J1J^ 97+JM 8JJtJ,!? 82±8j?. Stärke +0,20Mega AIE/kg 79±4,7 77±7,1 87±5,9 85±4,5 70±4,6
55±5,9
109±8,l
100±4,7
87±10
66+A8
I'<0.05
P < 0,01
P<O,(K)1 gegen Kontrolle mit Stärke. Tabelle 2
Durchschnittliche Blutglucose in mg/100 ml ± Is von nüchternen Versuchspersonen (Vp.) vor (=0) und zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von 60g Stärke± Amylaseinhibitor.
OMin.
15 Min.
30 Min.
45 Min.
Kontrolle mit Stärke Stärke+0,3 Mega AIE/Vp. Stärke+0,6Mega AIE/Vp. Stärke+ 1,2 Mega AIE/Vp.
96±13
99±10		 110+19
102±15		 159 ±21
132±I4		 I54±23
128±11
88 ±4,8 101 ±6,3 108 ±6,2 1OO±8,5
93 ±9,5 100±ll 108 ±8,3 102 ±7,3
60 Min.
90 Min.
120 Min.
180 Min.
Kontrolle mit Stärke Tabelle 3 131+34 99±21 85±15 80±14
Stärke+0,3 Mega AIE/Vp. 116±16 98±6,1 92±12 86±11
Stärke+0,6Mega AIE/Vp. 95 ±8,6 86 ±6,4 78 ±7,3 93 ±6,4
Stärke + 1,2 Mega AIE/Vp. 98 ±9,8 87 + 8,5 88 ±7,3 90 ±6,2
P<rno5 P<0,01 p<0,001 gegen Konirolle mit Stärke.
Durchschnittliche Insulinwerte in μΕ/ml Serum von nüchternen Versuchspersonen (Vp.) vor (=0) und zu verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Stärke +Amylaseinhibitor.
OMin.
15 Min.
30 Min.
45 Min.
Kontrolle mit Stärke Stärke + 0,3 Mega AIE/Vp. Stärke + 0,6 Mega AIE/Vp. Stärke + 1,2 Mega AIE/Vp.
10±2,0
11+1,9
11 ±3,3
8 ±3,0
26±14
18±4,6
21 ±6,0
12±5,9
64±29 29 ±8,8
I8A6A. 13±7,2
59 ±22 26±10
TÖ+4J
60 Min.
90 Min.
120 Min.
180 Min.
Kontrolle mit Stärke 31 ±20 19±14 12±6,5 10±5,2
Stärke+0,3 Mega AIE/Vp. 22±11 15 ±5,3 •14±3,1 11 ±2,4
Stärke+ 0,6 Mega AIE/Vp. 14±J>,8 13±3,7 11 ±3,4 10±2,5
Stärke + 1,2 Mega AIE/Vp. 8 ±2,9 8 ±4,0 9 ±3,3 6 ±3,0
p^nns P<0,01 P < 0,001 gegen Kontrolle mit Stärke.
A b b.:
Adsorption von Farbstoffen und amylaseinhibierendeni Prinzip aus Kulturlösungen des Stammes SE 50/13
an AkUvKome:
Kurven 1 und 2 bezeichnen die Aktivitäten in ΑΙΕ/μΙ (rechte y- Achse), Kurve 1 bei pH 2.1. Kurve 2 bei pH 6,5,
nach Behandlung mit der auf der x-Achse angegebenen Menge Aktivkohle in g.
3 und 4 ^j^ die Extinktionen bei 5χ ^ (|inke ^Αάιχ) Mch Bduaibmg ^x der auf dei x-Achse angegebenen Menge Aktivkohle, Kurve 3 bei pH 64. Kurve 4 bei pH 2,1.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Herstellung eines Amylaseinhibitors nach üblichen Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß man den Actinoplanaceenstamm CBS-Nr. 614.71 und Nährlösungen mit einem Stärkegehalt von 4 bis 6% einsetzt
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