DE2600664A1 - Verfahren zur direkten bestimmung des beta-cholesteringehaltes im blutserum - Google Patents

Verfahren zur direkten bestimmung des beta-cholesteringehaltes im blutserum

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Description

  • Verfahren zur direkten Bestimmung des
  • ß-Cholesteringehaltes im Blutserum.
  • Die Bestimmung des p-Cholesterinspiegels im Blutserum, d.h.
  • des Gehaltes an Cholesterin in der Fraktion der low density-Lipoproteine (IjDL) wird z.B. in der Labordiagnostik zur Differentialdiagnose von Fettstoffwechselfunktionen durchgeführt.
  • Das einzige bisher mit gutem Erfolg angewandte Verfahren zur direkten Bestimmung des p-Cholesteringehaltes ist die Ultrazentrifugation in einem Dichtegradienten.
  • Dieses Verfahren bedient sich zur Auftrennung der drei Lipoproteinbestandteile im Serum, nämlich 1)α-Lipoprotein (high density-Lipoprotein-(HDL), Moleküldurchmesser 75 - 100 2) -Lipoprotein (low density-Lipoprotein-(LDL), Molesüldurchmesser 150 - 250 i) und 3) Prä-ß-Lipoprotein (very low density-Lipoprotein (VLDL), Moleküldurchmesser 300 - 700 Å a + Chylomikronen (Moleküldurchmesser 1000 - 10000 Å) der unterschiedlichen spezifischen Massen der drei zu trennenden Bestandteile lIDL, LDL und VLDL.
  • Dieses Verfahren ist jedoch sehr aufwendig, da die Fraktionierung in zwei Arbeitsgängen mit extrem hohen Zentrifugalkräften (105 000 g) durchgeführt werden muß. Darüber hinaus erfordert diese Methode einen großen Zeitaufwand, da zur vollständigen Trennung die Ultrazentrifuge 2 x 20 Stunden und mehr laufen muß. Es versteht sich von selbst, daß bei derart extremen Belastungen ein großer Materialverschleiß in Kauf zu nehmen und das Verfahren als Routineverfahren nicht geeignet ist.
  • Vollständigkeitshalber seien noch andere Trennungsverfahren erwähnt, die jedoch nur indirekte Bestimmungsmethoden erlauben.
  • Dabei werden die Lipoproteine mit Polyanionen und zweiwertigen Metallsalzen (egarin oder Dextransulfat und Calcium- oder Magnesium- oder Nanganchlorid) fraktioniert ausgefällt.
  • Die Ermittlung des g-Cholesteringehaltes geschieht hier durch Differenzbildung der Cholesterinanteile der isolierten Lipoproteinpräzipitate.
  • Die Kombination von Ultrazentrifugation mit der Polyanionenpräzipitation wird in der Routinediagnostik angewandt. Sie erreicht günstigen Falls eine Präzision mit einer Fehlerbreite von 10%. Im allgemeinen liegt sie bei 10-20%.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Bestimmung des »-Cholesteringehaltes im Blutserum zu finden, das die Genauigkeit der Ultrazentrifugation garantiert, die oben erwähnten Nachteile jedoch vermeidet.
  • Sie wurde durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem Serum ein Polykation zusetzt und anschließend mit einem schwachen Kationenaustauscher prä p-(VLDL); und (EIDL) Lipoprotein extrahiert, wonach im Serum der Cholesteringehalt der y-I.ipoproteine (LDL) gemessen wird.
  • Als Polykation wird in vorteilhafter Weise Polyäthylenimin verwendet, das in Mengen von 1 - 2 Gew% Endkonzentration dem Serum zugesetzt wird.
  • Als Ionenaustauscher haben sich solche mit schwach sauren polaren funktionellen Gruppen (z.B.Carboxyl-oder Aminoxidgruppen) als geeignet erwiesen. Die Verwendung von Kationenaustauschern auf Methacrylsäure-Divinylbenzolbasis führten hierbei zu sehr gut reproduzierbaren Ergebnissen.
  • Methodik Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend durch Beispiele näher erläutert: 1. 1,5 ml Humanserum werden in einem Reagenzglas mit 50 einer 40%igen Polyäthyleniminlösung (Polymin P, BASF Ludwigshafen, BRD) bei 200C 15 Minuten lang geschüttelt.
  • 0,4 g eines schwach sauren Kationenaustauschers in H-Form> z.B. ein Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolimerisat (IRC-50 P.A., Fa. Serva, IIeidelberg, DRD) werden als Granulat hinzugefügt und die Mischung 10 Minuten lang geschüttelt.
  • Nach weiteren 10 Minuten wird der Überstand dekantiert und aus dieser Lösung Cholesterin chemisch nach dem Verfahren von Liebermann-Burchard oder enzymatisch bestimmt. Der gefundene Cholesterin-Gehalt entspricht dem Gehalt an -Cholesterin im Serum.
  • 2. Zum Vergleich wird -Cholesterin nach Fraktionierung der Lipoproteine im Serum in folgender Weise bestimmt: 3 ml Humanserum werden bei 105000 g 20 Std. lang mit einem 40,3 Rotor in einer Beckmann-Zentrifuge in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten mit der Dichte 1,006 zentrifugiert.
  • Die VLDL-Lipoproteine befinden sich in der Lösung mit der Dichte < 1,006, die LDL und llDL-Lipoproteine in der Lösung mit der Dichte > 1,006. Die LDL-Lipoproteine werden durch Präzipitation mit Heparin und Manganchlorid von den IIDL getrennt. Das Cholesterin wird aus dem Serum, aus der Fraktion der VLDL, aus der Fraktion, die die DL und LDL enthält, sowie aus der Fraktion, die die IIDL enthält, nach dem Verfahren von Zack oder von Liebermann-Burchard gemessen. Aus der Differenz des Cholesterin-Gehaltes der Fraktion von HDL und LDL und der Fraktion der HDL wird das p-Cholesterin berechnet.
  • Ergebnisse In der Tabelle 1 sind einige Versuchswerte Meßwerten der Ultrazentrifugalmethode gegenübergestellt.
  • Ein Vergleich der p-cholesterinbestimmung mit Hilfe der Ultrazentrifugation und mit der Extraktion mit Polyäthylenimin und dem Kationenaustauscher von 100 ilumanseren ergab eine Korrelation von 95 c") kr = 0,95. Über einen Bereich von 50 mg% bis 500 mg%' »-Cholesterin verläuft die Korrelationskurve linear mit einer Funktion YExtr. = 1,06 . XUZ - 5,02 Wie die Funktion der Geraden zeigt wird in dem Präzipitationsverfahren ein -Cholesterinwert bestimmt, der im Vergleich zur Bestimmung mit Hilfe der Ultrazentrifugation um 5 mg höher liegt. Diese Differenz kann auf einen Verlust von Cholesterin bei der Auftrennung mit Hilfe der Ultrazentrifugation zurückgeführt werden, der maximal bis zu 15 % beträgt.
  • Die Untersuchung einer Verdünnungsreihe in Seren, deren Lipoproteingehalt durch Zugabe einer 6%igen Albuminlösung verändert wurde, ergab nach der Extraktion mit Polyäthylenimin und dem Kationenaustauscher eine lineare Abnahme des p-Cholesteringehaltes (Abb. 1).
  • Die Reproduzierbarkeit der p-Cholesterinbestimmungen aus aliquoten Volumina desselben Serums, die in gleicher Weise mit Polyäthylenimin und dem Kationenaustauscher behandelt wurden, ist präziser (Variationskoeffizient vk : 2,4) als die der Ultrazentrifugation (Variationslçoeffizient vk : 5,9) (Tabelle 2) Die im Rahmen einer Verlaufskontrolle von mehreren Wochen untersuchten Seren eines Patienten nach beiden Verfahren ergab eine Übereinstimmung der ,ß-Cholesterinbestimmungen, die für klinische Zwecke voll ausreicht (Tabelle 3).
  • Die Untersuchung von Seren mit einem extrem hohen Gehalt an Triglyceriden (Typ IV, Typ V) oder einem extrem hohen Gehalt an Cholesterin (Typ II) mit Hilfe der Extraktion mit Polyäthylenimin und dem Kationenaustauscher führten zu ß-Cholesterinwerten, die in gleicher Weise befundet werden müssen wie die Bestimmung mit Hilfe der Ultrazentrifugation (Tabelle Tabelle 1: Vergleich der ß-Cholesterinbestimmung mit Hilfe 1. des Polyäthyleniminextraktionsverfahrens 2. der Ultrazentrifugations-Rpäzipitationsverfahrens Gesamtchloresterin ß-Chloresterin ß-Chloresterin (Extraktionsverf.) (UZ-Präzipitationsverf.) 144 mg/100ml 107mg/lOOml 102 mg/lOOml 137 mg/100ml 78mg/lOOml 81mg/ lOOml 153 " 86 " 72 " 155 " 123 " 123 " 171 " 121 " 120 " 164 " 116 " 124 " 224 " 189 " 201 " 220 " 179 " 185 " 249 " 199 " 189 " 250 " 193 " 190 " 277 " 101 " 106 " 291 " 241 " 221 " 326 " 281 " 275 " 309 " 172 " 164 " 315 " 252 " 245 " 352 " 266 " 261 " 341 " 208 " 224 t' 350 " 139 " 149 " 383 " 352 " 313 " 435 " 396 " 373 " 446 " 388 " 396 " 470 " 448 " 418 " 505 " 483 " 466 " Abbildung 1: Verdünnungsreihe: Gehalt an ß-Cholesterin im Serum nach Extraktion der VLDL und HDL mit Polyäthylenimin und einem DVB-Methacrylsäurekopolimerisat-Kationenaustauscher nach Verdünnung mit einer 6%igen Humanalbuminlösung.
  • Tabelle 2: Reproduzierbarkeit der ß-Cholesterinbestimmung aus einem Serum 1. durch Extraktion mit Polyäthylenimin und IRC 50 2. durch Polyanionenpräzipitation - Ultrazentrifugation Gesamtwert des Serumcholesterins: 509 mg/100ml Anzahl d. 1. Extraktions- 2. Ultrazentrifugation-Bestimmungen verfahren Präzipitationsverfahren No. 1 448 mg/100 ml 471 mg/ml 2 426 " 428 " 3 425 " 457 " 4 433 " 471 " 5 437 " 383 " 6 428 " 435 " 7 429 " 458 " 8 436 " 418 " 9 437 " 426 " 10 426 " 445 " 11 433 " 474 " 12 412 " 474 " 13 403 " 455 " 14 430 " 416 " 15 430 " 459 " 16 436 " Mittelwert 429 mg/100ml 445mg/lOOml Standardabweichung 10,4 mg/100ml 26,5 mg/lOOml Variationskoeffizient 2,42 5,95 Tabelle 3: Verlaufskontrolle des nach dem 1. Extraktionsverfahren 2. Ultrazentrifugations-Präzipitationsverfahren bestimmten ß-Cholesterins einer Person über einen mehrwöchigen Zeitraum.
  • Gesamtcholesterin ß-Cholesterin n.d. ß-Cholesterin n.d.
  • im Serum Extraktionsverf. UZ-Präzipitationsverf.
  • 266 mg/lOOml 198 mg/lOOml 220 mg/lOOml 308 " 215 " 233 " 220 " 166 " 170 " 244 " 193 " 189 " 197 " 179 " 185 " 198 " 128 " 127 " 201 " 156 " 153 " 197 " 142 " 160 " 199 " 144 " 140 " 219 " 195 " 157 " 219 " 197 " 169" Tabelle 4 Typ Gesamt TG Gesamt Chol. ß-Chol:(UZ) ß-Chol:(Extr.) 5 1720 401 87 105 1305 393 64 33 1360 340 65 70 4 815 277 89 132 690 372 109 110 820 348 145 135 2 167 508 464 449 239 512 466 483 252 497 452 487

Claims (5)

  1. Patentansprüche 1. Verfahren zur direkten Bestimmung des ß-Cholesteringehaltes im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Serum ein schwaches Polykation zusetzt und anschließend mit einem schwachen Kationenaustauscher prä ß- (VLDL) und oC (lIDL) Lipoprotein extrahiert, wonach im Serum der Cholesteringehalt der ß-Lipoproteine (LDL) gemessen wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Polykation Polyäthylenimin eingesstzt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polykation in Mengen von 1-2 Gew 7< enthalten ist.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Carboxylgruppen aufweisender Kationenaustauscher verwendet wird.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kationenaustauscher auf Methacrylsäuredivinylbenzolbasis eingesetzt wird.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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