DE2743524C3

DE2743524C3 - Verfahren zur direkten Lipid-Bestimmung im Blutserum

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Publication number: DE2743524C3
Application number: DE19772743524
Authority: DE
Inventors: Claus-Christian Dr.Rer.Nat. Dr.Med. 6901 Wilhelmsfeld Heuck
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-09-28
Filing date: 1977-09-28
Publication date: 1982-04-15
Also published as: DE2743524B2; DE2743524A1

Description

Die Bestimmung der Lipide im Blutserum, d. h. des Gehaltes an Cholesterin und/oder der Triglyceride in der Fraktion der low density-Lipoproteine (LDL) wird beispielsweise in der Labordiagnostik zur Differentialdiagnose von Fettstoffwechselfunktionen durchgeführt.

Eines der bisher angewandten Verfahren zur direkten Bestimmung des j3-Cholesteringehaltes ist die Ultrazentrifugation in einem Dichtegradienten.

Dieses Verfahren bedient sich zur Auftrennung der drei Lipoproteinbestandtei'e im Serum, nämlich

1. a-Lipoprotein (high density-Lipoprotein-(HDL), Moleküldurchmesser 75—100 Ä)

2. /?-Lipoprotein (low density-Lipoprotein-(LDL), Moleküldurchmesser 150—250 A) und

3. Prä-jS-Lipoprotein (very low density-Lipoprotein (VLDL), Moleküldurchmesser 300-700 A) + Chylomikronen (Moleküldurchmesser 1000-10 000 Ä)

der unterschiedlichen spezifischen Massen der drei zu trennenden Bestandteile HDL, LDL und VLDL

Dieses Verfahren ist sehr kostspielig und aufwendig. Die Fraktionierung muß in zwei Arbeitsgängen mit hohen Zentrifugalkräften (105 000 g) durchgeführt werden. Diese Methode erfordert einen Zeitaufwand von 8—40 Stunden. Da zur vollständigen Trennung die Ultrazentrifuge gegebenenfalls 2 χ 20 Stunden laufen muß, versteht es sich von selbst, daß bei derart extremen Belastungen ein großer Materialverschleiß in Kauf zu nehmen und das Verfahren als Routineverfahren nicht geeignet ist.

In der DE-OS 26 00 664 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem man dem Serum ein schwaches Polykation zusetzt und anschließend mit einem schwachen Kationenaustauscher prä-jS-(VLDL) und a-(hdl) Lipoprotein extrahiert, wonach im Serum der Cholesteringehalt der ^-Lipoproteine (LDL) gemessen wird. Als Polykation wird dabei in vorteilhafter Weise Polyäthylenimin, also ein schwaches Polykation verwendet, das in Mengen von 1—2 Gew.-% Endkonzentration dem Serum zugesetzt wird.

Als Ionenaustauscher haben sich solche mit schwach sauren polaren funktioneilen Gruppen, z. B. Carooxylgruppen als geeignet erwiesen. Die Verwendung von Kationenaustauschern auf Methacrylsäure-Divinylbenzolbasis führten hierbei zu sehr gut reproduzierbaren Ergebnissen.

Weiterhin seien noch andere Trennungsverfahren erwähnt, die jedoch nur eine indirekte Bestimmung erlauben. Dabei werden die Lipoproteine mit Polyanionen und zweiwertigen Metallsalzen (Heparin oder Dextransulfat und Calcium- oder Magnesium- oder Manganchlorid) fraktioniert ausgefällt. Die Ermittlung des /8-Cholesteringehaltes geschieht hier durch Differenzbildung der Cholesterinanteile der isolienen Lipoproteinpräzipitate.

Die Kombination der Ultrazentrifugation mit der Polyanionenpräzipitation wird in der Routinediagnostik angewandt. Die Arbeitszeit beträgt in diesem Fall immer noch 24 Stunden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur direkten Bestimmung der Lipide in den LDL zu entwickeln, das die gleiche Aussage wie die herkömmliche Methodik mit Hilfe der Ultrazentrifugation gerantiert, die oben erwähnten Nachteile jedoch vermeidet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur direkten Bestimmung von Lipiden im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Serum ein hydrophob derivatisiertes Polykation zusetzt und anschließend mit einem schwachen Ionenaustauscher oder¹ einem stark polaren Adsorber mit lipophilem Charakter die prä-|3-(VLDL) und «-Lipoproteine (HDL) extrahiert, wonach im Serum der Lipid-Gehalt der /!-Lipoproteine (LDL) gemessen wird.

Die hydrophob derivatisierten Polykationen oder Gemische derselben mit den unsubstituierten Polykationen stellen bessere Adsorbentien für die Extraktion der HDL und VLDL-Fraktionen des Serums dar als das unsubstituierte Polykation allein. Die Verwendung dieser Verbindungen hat sich als vorteilhaft erwiesen:

1. Man kommt mit wesentlich geringeren Mengen aus. Die erforderliche Menge beträgt bis zu etwa '/5 des unsubstituierten Polymers.

2. Die Reagenzlösung ist bedeutend weniger viskos als diejenige be; der Verwendung von unsubstituiertem Polykation.

3. Es können enzymatische Bestimmungen der Lipide gegebenenfalls sogar in Gegenwart des Polykations durchgeführt werden. Neben einer chemischen wird dadurch auch eine enzymatische Bestimmungsweise ermöglicht

Hydrophobe Derivatisierung des Polykations bedeutet, daß es durch übliche hydrophobe Reste substituiert ist

Als Polykation wird in vorteilhafter Weise Polyäthylenimin bzw. acyliertes oder alkyliertes Polyäthylenimin verwendet, das in Mengen von insgesamt 0,1—2 Gew.-% Endkonzentration dem Serum zugesetzt wird.

Es kommen als Substituenten insbesondere langkettige Fettsäurereste bzw. die entsprechenden Alkylreste in Frage, die gesättigt und/oder ungesättigt und/oder verzweigt sein können. Als vorteilhaft erwies sich dabei eine Kettenlänge der Reste von etwa 6—26 C-Atomen. Als besonders gut geeignet erwies sich die Kettenlänge im Bereich von etwa 10—20 C-Atomen. Als gesättigte Acylreste kommen, um einige beispielhaft zu nennen, diejenigen in Frage, die sich von folgenden Säuren ableiten, wobei die Zahl der C-Atome jeweils in Klammern angegeben ist:

Capron-(C₆), Capryl-(C₈), Pelargon-fG,),

Caprin (Cio), Undecyl-(d),

Laurin- oder Dodecyl-(Ci₂),Tridecyl-(C|₃),

Myristin-(Ci₄),Pentadecyl-(C₁₅),

PaImMn-(Ci₆), Margarin-(Ci₇), Stearin-(Cis),

Nonadecyl-(Ci9), Arachin-(C₂₀), Behen-(C₂₂),

Lignocerin-(C₂4),Cerotin-(C₂6)-Säure.

Von den ungesättigten Säuren sind beispielsweise die ein-, zwei- bzw. dreifach-ungesättigten Cis-Säuren, wie ölsäure (cis-/4⁹-Dehydro-Stearinsäure), Linolsäure (ciscis-4⁹¹²-Dehydro-Stearinsäure und Linolensäure (allcis-4⁹¹²¹⁵-Dehydro-Stearinsäure) zu nennen. Als verzweigte Fettsäure soll beispielsweise die Isovaleriansäure genannt werden.

Der Substitutionsgrad der primären und sekundären Aminogruppen beträgt vorteilhaft von ca. 35—40% im Fall der kürzeren Kettenlänge der Reste bis ca. 5 — 10% im Fall der höhergliedrigen Reste.

Als Ionenaustauscher haben sich auch hier Kationenaustauscher mit schwach sauren, polaren funktioneilen, z. B. Carboxylgruppen als geeignet erwiesen, wie Amberlite IRC 50. Die Verwendung von Kationenaustauschern auf Methacrylsäure-di-vinylbenzolbasis führte zu sehr gut reproduzierbaren Ergebnissen. Als stark polare Adsorber mit lipophilem Charakter haben sich nitrosierte Polymere auf Polystyrolbasis, die also Aminoxidgruppen enthalten, erwiesen, wie z. B. Amberlite XAD-2, Partikelgröße 100-200 μ (ζ. B. von Serva, Heidelberg).

Es hat sich für den Fall, daß bei Seren, bei denen der Triglyceridgehalt 1000 mg/100 ml übersteigt (Typ IV und Typ V — Hyperlipidämie) gezeigt daß nach Behandlung mit aeyliertem Polymer auf die Behandlung mit dem Ionenaustauscher bzw. dem Adsorber mit lipophilem Charakter verzichtet werden kann. Die obere, cremeartige Phase wird dabei entfernt und aus der klaren unterständigen Phase das Lipid bestimmt

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend durch Beispiele näher erläutert

Gewinnung des Serums und Analysenmethoden

Es wurden Serumproben von gesunden Personen mit Normolipidämie und von nicht-behandelten Personen mit Hyperlipidämie vom Typ Ha, lib, IV und V j» (Bezeichnung nach Fredrickson) nach Fasten für die Dauer einer Nacht verwendet Es wurde innerhalb von 12 Stunden analysiert.

,.- Herstellung von aeyliertem Polyäthylenimin

Eine wäßrige Lösung von Polyäthylenimin (Polymin P, BASFAG, Ludwigshafen) wird 72 Stunden lang lyophilisiert, um das Lösungsmittel zu entfernen. 1 g Rückstand wird in 50 ml Methanol (99,6%ig) gelöst und es wird 1 g Dodecoylchlorid (Fluka, Ulm) unter Rühren bei 25⁰C in diese Lösung eintropfen gelassen. Das Gemisch wird 24 Stunden lang bei 50° C gerührt Danach werden 100 ml Benzol (p. a., Merck Darmstadt) hinzugegeben und die Lösung wird im Vakuum so weit

J? eingedampft, daß das acylierte Polymer ausfällt Der Niederschlag wird dreimal mit 100 ml Benzol gewaschen um die freie Dodecansäure und nichtumgesetztes Dodecoylchlorid zu entfernen. Es wird zur Trockene eingedampft und das zurückbleibende Dodecoyl-polyäthylenimin in destilliertem Wasser aufgelöst, so daß eine 5%ige Lösung entsteht.

In entsprechender Weise wird das Linolyl-polyäthylenimin hergestellt.

Herstellung von alkyliertem Polyäthylenimin

Sie erfolgt nach I. S. Scarpa, H. C. Kiefer und 1. M. Klotz, Intrascience, Chem. Rept 8, Nr. 1-3, 1974, S. 45 ff.

Bestimmung der LDL-Lipide

1. Es werden 40 μΐ einer 5%igen wäßrigen Lösung von Dodecoylpolyäthylenimin mit 1,4 ml Humanserum gemischt. Das Gemisch wird 5 Minuten lang mit der Hand geschüttelt oder zentrifugiert (60rpm). Danach wird 0,4 g Amberlite IRC 50-Granulat (Serva, Heidelberg) hinzugegeben, 10 Minuten bei niedriger Geschwindigkeit und dann 2 Minuten bei 2000—3000 rpm zentrifugiert, so daß ein klarer Überstand erhalten wird. Dieser wird zur Cholesterin- und Triglycerid-Bestimmung verwendet. Das Cholesterin wird chemisch nach dem Verfahren von Liebermann-Burchard oder enzymatisch bestimmt. Der gefundene Cholesterin-Gehalt entspricht dem Gehalt an ^-Cholesterin im Serum. Die Triglycerid-Bestimmung erfolgt nach Kessler und Lederer. Der Triglycerid-Gehalt ergibt

sich aus der Differenz des Leerwertes aus dem Gesamtserum (= Gehalt an freiem Glycerin im Serum) und dem Meßwert aus dem genannten Überstand. Cholesterin und Triglyceride können in an sich bekannter Weise auch vollautomatisch, z. B. am Technicon AA II-Gerät aus Isopropanol-Extrakten nach Behandlung mit Zeolit bestimmt werden.

2. Zum Vergleich werden Cholesterin und Triglyceride nach Fraktionierung der Lipoproteine im Serum in folgender Weise bestimmt:
3 ml Humanserum werden bei 105 000 g 20 Stunden lang mit einem 40,3 Rotor in einer Beckmann-Zentrifuge in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten mit der Dichte 1,006 zentrifugiert. Die VLDL-Lipoproteine befinden sich in der Lösung mit der Dichte < 1,006, die LDL und H DL-Lipoproteine in der Lösung mit der Dichte > 1,006. Die LD-Lipoproteine werden durch Präzipitation mit Heparin und M inganchlorid von den HD-Lipoproteinen getrennt. Das Cholesterin wird aus der Fraktion, die die HDL und LDL enthält, sowie aus der Fraktion, die die HDL enthält, nach dem Verfahren von Zack oder von Liebermann-Burchard gemessen. Aus der Differenz des Cholesterin-Gehaltes der Fraktion von HDL und LDL der Fraktion von HDL wird das

^-Cholesterin berechnet Die Recovery-Berechnung bei der Ultrazentrifugationsmethode erfolgt durch Summierung der VLDL- und LDL/HDL-Werte. Es wird mit dem Cholesteringehalt im ι Ii Vollserum verglichen.

Ergebnisse

Tabelle la enthält eine Aufstellung über verschiedene

ι ■> Fraktionierungsansätze und die Reproduzierbarkeit der Bestimmung des Gehalts an Triglycerid und Cholesterin.

In Klammern sind jeweils die Konzentrationsangaben des Polykations bzw. des Polykation-Gemischs und das Gewichtsverhältnis von unsubstituiertem Polykation zu acyliertem Polykation aufgeführt Tabelle Ib enthält 18 Wiederholungsmessungen unter Verwendung eines 2:1-Addukts.

Tabelle Iu

Verschiedene Fraktionicrungsnnsütze und der nach Fraktionierung bestimmte Gehall an Triglyceriden und

Cholesterin.

PEI = Polyiithylenimin, PEI-C₁₂-O = Dodecoyl-PEl; PEI-C,₈.₂ = Linolyl-PEI

Gesamtmenge im Serum

TG (mg%) Chol (mg%)

1,5 ml + 0,05 ml (20%) PEI + Amberlile IRC 50

1,5 ml + 0.05 ml (20%) PEI-C,₂-₀U :2) + Amberlite IRC

1,5 ml + 0.05 ml (20%) PEI-C,₂-o(l : D + Amberlite IRC 1,5 ml + 0.05 ml (40%) PEl-C,₈.₂(1:3,2) + Amberlite IRC

Tabelle Ib

Wiederholungsmessungen aus einem Serum

1,4 ml Serum + 0,05 ml (10%) PEI-C,₂-₀(2:1 + IRC 50

TG (mg%) 35 37 41 35 35 37 38 36 35 35 36 40 37 41 37 36 42 37

Chol <mg%) 125 127 126 125 125 123 123 127 127 120 118 123 119 123 126 12b 119 121

Gesamtmenge im Serum
TG (mg%) 111 103

Chol (mg%) 178 175

121	176
120	177
50	157
43	157
40	128
50	132
41	130
27	102
32	103
28	99
76	114
75	112
81	116

Ein Vergleich der LDL-Cholesterinbestimmung durch Ultrazentrifugation mit der erfindungsgemäßen Methode mit Serumproben bei Fällen von Normolipidämie und Hyperlipidämje zeigt sowohl im Fall niederer Triglycerid-Konzentration (Normolipidämie und Typ Ha; Korrelationskoeffizient r=0,94) als auch Triglycerid-reicher Proben (Typ IV und Typ Hb, /·=0,95) gute Ergebnisse. Für Triglyceride ist die Korrelation (r— 0,80)

nicht ganz so gut wie für Cholesterin.

Die Präzision der LDL-Cholesterin- und LDL-Triglycerid-Bestimmung wurde an Hand von Serumproben in Fällen der Normolipidämie und Typ Hb, Typ IV und Typ V Hyperlipidämie untersucht (Tabelle 2). Es handelt sich hier um Bestimmungen nach der Fraktionierung mit einer 5%igen Lösung von dodecoyliertem Polyäthylenimin und Amberlite IRC 50 gemäß den Ausführungen im obigen Beispiel. Der Variationskoeffizient liegt zwi-

Tabelle 2

Die Mengenangaben bedeuten mg/100 ml

sehen 2,5 und 6,4 für Cholesterin und 5,1 bis 13,0 für Triglyceride (Tabelle 2). Erklärend zu Tabelle 2 ist zu sagen, daß im Fall des Typs V sich bei der erfindungsgemäßen Fraktionierung Werte ergeben, die um etwa das 2fache höher liegen als bei der Ultrazentrifugation. Für diese Serumproben wird Cholesterin mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation nur zu 60%,Triglycerid zu 48% wiedergefunden.

Gesaml-Chol.	Gesaml-TG	LDL-Chol	VK	LDL-Chol	VK	LDL-TG	VK	LDL-TG	VK
Voll- Recov.	Voll- Recov.	(UC)		(Ext.)		(UC)		(Ext.)
serum (UC)	serum (UC)

Normal

Typ Hb

Typ IV

Typ V

178 175

289 287

258 245

1130 689

Vollserum

Recov. (UC)

LDL-Chol. bzw. TG (UC)

LDL-Choi. bzw. TG (ExI.)

111 98 108±5 4,6 123±3 2,5 31 ±5 16,1 28±4 13

211 182 205 ±11 5,5 211 ±13,5 6,4 79±5 6,3 83±6 7,7

299 255 169±7 4,1 183±5 2,7 81 ±5 6,2 85±7 8,1

4100 1987 59±11 19 132±4 3,4 63±12 19 153±8 5,1

= Gesamt-Cholesterin bzw. Gesamt-TG im nichtfraktionierten Serum.

= Recovery-Werte nach Ultrazentrifugation (Dichtegradient).

= Nach Ultrazenlrifugation (Dichtegradient) und Polyanionen-Präzipitation bestimmt.

= Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt.

= Anzahl der Messungen.

= Variationskoeffizient.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber dem Ultrazentrifugationsverfahren vor allem durch den erheblich geringeren Materia!-, Arbeits- und Zeitaufwand einen hervorragenden technischen Fortschritt bietet, gegenüber dem Ultrazentrifugationsverfahren kombiniert mit der Polyanionenpfäzipitation darüber hinaus eine erhöhte Präzision. Gegenüber dem Verfahren mit unsubstituiertem Polykation hat es den Vorteil, daß mit erheblich geringeren Mengen und in Lösungen mit wesentlich geringerer Viskosität gearbeitet werden kann. Letzteres hat den Vorteil, daß die enzymatischen Reaktionen in Gegenwart des Polykations durchgeführt werden können.

«Β 215/395

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur direkten Bestimmung von Lipiden im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Serum ein hydrophob derivatisiertes Polykation zusetzt und anschließend mit einem schwachen Ionenaustauscher oder einem stark polaren Adsorber mit lipophilem Charakter die prä-ß-(VLDL) und a-Lipoproteine (HDL) extrahiert, wonach im Serum der Lipid-Gehalt der /!-Lipoproteine (LDL) gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophob derivatisierte Polykation zusammen mit einem unsubstituierten Polykation zusetzt

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Polykation PoIyäthylenimin eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—3, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophob derivatisierte Polykation ein acyliertes Polykation ist.

5. Verfahren nach einem d;r Ansprüche 1—4, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophob derivatisierte Polykation ein alkyliertes Polykation ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Acyl- bzw. Alkyigruppen gesättigt und/oder ungesättigt und/ oder verzweigt sind und eine Kettenlänge von Ce, bis C26 besitzen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Acyl- bzw. Alkyigruppen gesättigt und/oder ungesättigt und/oder verzweigt sind und eine Kettenlänge von CiobisC₂obesitzen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—7, dadurch gekennzeichnet, daß das Polykation in Mengen von insgesamt 0,1 — 2 Gew.-% enthalten ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1—8, dadurch gekennzeichnet, daß als Ionenaustauscher ein Carboxylgruppenaufweisender Kationenaustauscher verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß als Ionenaustauscher ein Kationenaustauscher auf Methacrylsäure-Divinylbenzolbasis eingesetzt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 — 10, dadurch gekennzeichnet, daß der stark polare Adsorber mit lipophilem Charakter ein Aminoxidgruppen-haltiges Polymeres auf Polystyrolbasis ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 — 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmenden Lipide Cholesterin und/oder Triglyceride sind.