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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Trennen und gegebenenfalls Bestimmen von Lipoproteinfraktionen in Körperflüssigkeiten durch fraktionierte Fällung.
Die Lipoproteine des menschlichen Serums lassen sich in vier Hauptklassen einteilen : Very Low Density Lipoproteine (VLDL), Low Density Lipoproteine (LDL) und High Density Lipoproteine (HDL). Die HDL-Fraktion zerfällt noch in zwei Unterklassen : HDL2 und HDL3. Die Nomenklatur ist auf das Verhalten der Lipoproteine (Lp) in der Ultrazentrifuge zurückzuführen.
Die Bestimmung der HDL-Lipoproteinfraktionen und der HDLz-und HDLs-Lipoproteinsubfrak- tionen in menschlichen Körperflüssigkeiten, wie Serum oder Plasma, ist deshalb von grosser diagnostischer Bedeutung, weil auf Grund dieser Bestimmungen das atherogene Risiko von Patienten abgeschätzt werden kann. Ferner können Rückschlüsse auf metabolische Veränderungen und angeborene Stoffwechselstörungen gewonnen werden.
Die Bestimmungen der genannten Fraktionen wurden bisher hauptsächlich mit Hilfe der präparativen und analytischen Ultrazentrifuge durchgeführt. Diese Geräte sind jedoch sehr teuer, verlangen geschultes Personal und kommen nur für kleine Probenserien in Frage.
Weiters ist auch eine Präzipitationsmethode zum Abtrennen der HDLz-und HDLs-Lipoprotein- fraktion bekannt, wobei als Fällungsmittel Heparin und Dextransulfat unter Zusatz von Mangan (II)ionen verwendet werden. Diese stören jedoch bei verschiedenen weiteren chemischen Untersuchungen. Ausserdem sind mehrere Pipettierungsschritte und länger dauernde Inkubationen notwendig, was eine geringe Präzision zur Folge hat. Schliesslich lassen sich Proben mit hohem Triglyceridgehalt nach dieser bekannten Methode nicht analysieren.
Die Erfindung bezweckt die Vermeidung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren zu schaffen, welches eine möglichst einfache, rasche und reproduzierbare fraktionierte Trennung entweder der beide Subfraktionen enthaltenden HDL- Fraktion oder der HDLs-Subfraktion allein von den übrigen Lipoproteine in den Körperflüssigkeiten ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass als Fällungsmittel Polyäthylenglykol verwendet wird, wobei durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer End-Konzentration von 5 bis 8% w/v in dem Fällmedium ein die VLDL- und LDL-Fraktionen enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL2 - und HDL3 -Fraktionen im Überstand bleiben, bzw. durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer End-Konzentration von 9 bis 11% w/v in dem Fällmedium ein die VLDL-, LDL- und HDL2-Fraktionen enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL3- - Fraktion im Überstand bleibt.
Die Verwendung von Polyäthylenglykol als Mittel zur Fällung von Proteinen aus Körperflüssigkeiten ist an sich bekannt.
Gemäss der einen Ausführungsform der Erfindung wird ein Teil Plasma oder Serum mit zwei Teilen einer 8- bis 10%igen Polyäthylenglykol-Lösung mit einem pH-Wert von 6 bis 7 versetzt, gemischt und in einer Zentrifuge zentrifugiert, wobei ein die VLDL- und LDL-Fraktion enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL2-und HDL3-Fraktionen im Überstand bleiben.
Gemäss der andern Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird ein Teil Serum oder Plasma mit zwei Teilen einer 14- bis 15%igen Polyäthylenglykol-Lösung mit einem pH-Wert von 7 bis 8 versetzt, gemischt und in einer Zentrifuge zentrifugiert, wobei ein die VLDL-, LDLund HDL2-Fraktionen enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL3 -Fraktion im Überstand bleibt.
Bei beiden Ausführungsformen wird sodann der Cholesteringehalt des Überstandes enzymatisch oder chemisch bestimmt und auf Grund der bekannten Zusammensetzung der HDL-Fraktionen die Masse des HDL2 und die Masse des HDL3 ermittelt. Die chemische Zusammensetzung der HDL- - Fraktionen ist in der folgenden Tabelle dargestellt :
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Tabelle
EMI2.1
<tb>
<tb> % <SEP> der <SEP> Lipoprotein-Masse
<tb> Fraktion <SEP> Protein <SEP> Phospholipid <SEP> Cholesterin <SEP> Triglycerid <SEP>
<tb> HDL2 <SEP> 41 <SEP> 35 <SEP> 19 <SEP> 5
<tb> HDLa <SEP> 57 <SEP> 23 <SEP> 16 <SEP> 4
<tb>
EMI2.2
2/3 aus Cholesterinester. Multipliziert man den bei der Analyse gefundenen Cholesterinwert mit 1, 48, so erhält man die Masse der Mischung Freies Cholesterin und Cholesterinester.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im folgenden näher erläutert.
Man bereitete zunächst die Fällungsmittel vor, u. zw. als Fällungsmittel A eine Lösung mit 9, 5% Polyäthylenglykol und einem PH-Wert von 6, 5 und als Fällungsmittel B eine Lösung mit 14, 5% Polyäthylenglykol und einem PH-Wert von 7, 5.
Beispiel 1 :
100 (d menschliches Serum wurden mit 200 pl des Fällungsmittels A versetzt, um eine Endkonzentration von 6, 3% w/v Polyäthylenglykol zu erreichen ; sodann wurde die Mischung zentrifugiert und der Überstand abgetrennt. Im Überstand wurde das Cholesterin enzymatisch bestimmt und ein Wert von 55 mg/100 ml gefunden.
Weitere 100 gel des Serums wurden mit 200 ! des Fällungsmittels B versetzt, um eine Endkonzentration von 9, 7% w/v Polyäthylenglykol zu erreichen. Die Mischung wurde zentrifugiert und der Cholesteringehalt im Überstand bestimmt. Es wurde ein Wert von 41 mg/100 ml gefunden.
Aus den gefundenen Werten wurde die Masse des HDL2 und HDL3 unter Zugrundelegung der in der Tabelle angegebenen Mengenverhältnisse wie folgt errechnet :
55 x 1, 48 = 81, 4 mg/100 ml Cholesterinmasse in HDL2 und HDL3 (Gesamt-HDL)
41 x 1, 48 = 60, 7 mg/100 ml Cholesterinmasse in HDL3 81, 4-60, 7 = 20, 7 mg/100 ml Cholesterinmasse in HDL2
100 : 19 (% Cholesterin) = 5, 25 : Konversionsfaktor für HDL2 -Masse
100 : 16 (% Cholesterin) = 6, 25 : Konversionsfaktor für HDL3-Masse
20, 7 x 5, 25 = 108, 7 = Masse des HDL2
60, 7 x 6, 25 = 379, 4 = Masse des HDL3
Beispiel 2 :
Zwei Proben von je 100 p. l einer andern Serumprobe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit den Fällungsmitteln A und B gefällt.
Nach jeweiligem Abtrennen der Niederschläge wurden im Überstand statt des Cholesterins die Phospholipide bestimmt. Dabei ergaben sich die folgenden Werte : Überstand nach Fällung mit Fällungsmittel A : 96, 5 mg/100 ml
Phospholipide = Phospholipidgehalt in HDL2 + HDL3 (Gesamt-HDL) Überstand nach Fällung mit Fällungsmittel B : 73, 4 mg/100 ml
EMI2.3
Unter Zugrundelegung der in der Tabelle angegebenen Werte ergaben sich die Konversionsfaktoren :
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100 : 35 = 2, 86 (Konversionsfaktor für HDL2)
100 : 23 = 4, 35 (Konversionsfaktor für HDL3) und daraus : 23, 1 x 2,86 = 66, 1 mg/100 ml HDL2 -Masse
73, 4 x 4, 35 = 319, 3 mg/100 ml HDLs-Masse
Beispiel 3 :
Zwei Proben von je 100 111 einer weiteren Serumprobe wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit den Fällungsmitteln A und B gefällt.
Nach jeweiligem Abtrennen der Niederschläge wurden jedoch im Überstand an Stelle der Bestimmung des Cholesterins bzw. der Phospholipide der Gehalt an Apoprotein AI bestimmt und daraus die HDLz-und HDLs-Masse errechnet :
Im Überstand nach der Fällung mit Fällungsmittel A wurden 151 mg/100 ml Apoprotein AI gefunden, im Überstand nach der Fällung mit Fällungsmittel B 122 mg/100 ml Apoprotein AI.
Daraus ergaben sich unter Heranziehung der in der Tabelle angegebenen Werte die folgenden HDL2- und HDL3-Massen :
41 (% Protein in HDL2) x 0, 75 = 30, 75 - entspricht % der Apoprotein AI-Masse in HDL2
100 : 30, 75 = 3, 25 = Konversionsfaktor für HDL2 -Masse aus Apoprotein AI
57 x 0, 70 = 39, 9 - entspricht % der Apoprotein AI-Masse in HDL3
Als Konversionsfaktor für HDL3 -Masse aus Apoprotein AI ergab sich aus 100 : 39, 9 = 2, 51.
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122 x 2, 51 = 306, 2 mg/100 ml HDL3-Masse.
PATENTANSPRCHE :
1. Verfahren zum Trennen und gegebenenfalls Bestimmen von Lipoproteinfaktoren in Körperflüssigkeiten durch fraktionierte Fällung, dadurch gekennzeichnet, dass als Fällungsmittel Polyäthylenglykol verwendet wird, wobei durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer End-Konzentration von 5 bis 8% w/v in dem Fällmedium ein die VLDL- und LDL-Fraktionen enthaltender Niederschlag erhalten wird, während die HDL2 - und HDL3 -Fraktionen im Überstand bleiben, bzw. durch Zusatz von Polyäthylenglykol bis zu einer End-Konzentration von 9 bis 11% w/v in dem Fällmedium
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HDL2-FraktionenHDLs-Fraktion im Überstand bleibt.