DE2533447B2 - Peptidantibiotikum Gardimycin und sein Mononatriumsalz, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen - Google Patents

Peptidantibiotikum Gardimycin und sein Mononatriumsalz, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen

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Description

Verhältnis von Aminosäuren
25
Valin 2 Hydrolyse 6 N-HCI
Serin I 16 Std. bei 110 C
Glycin 2
Glutaminsäure 1
Isoleucin 2
Leucin 1 Hydrolyse 5 N-Bu(OH)2 4<
Alanin I 16 Std. bei 110 C
Lanthionin 1
p-Methyllanthionin 1
Tryptophan 1
2. Gardimycin-mononatriumsalz, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:
Schmelzpunkt 2600C (Zers.);
Äquivalentgewicht (bestimmt durch potentiometrische Titration) 2005-2168;
Elementaranalyse:
C48,7-48,6%; H 6,7-6,6%;
N 11,8 -12,2%; S 5,3 - 5,5%;
Na 1,1%; H2O 3,6-3,3%;
spezifischer Dreh wert [λ] ■/.'■ = -44° (c=0,5% in Dimethylformamid);
löslich in Wasser, wäßriger Natriumbicarbonatlösung, verdünnten wäßrigen Lösungen von Alkalihydroxiden, heißem Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Eisessig;
unlöslich in verdünnten Mineralsäuren, Benzol, Aceton, Chloroform. Tetrachlorkohlenstoff, Alkanolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und Tetrahydrofuran;
pKa-Werte (potentiometrisch bestimmt) von 7,1 in Wasser und 8,5 in Äthylenglykolmonomethyläther zu Wasser(16 : 4).
3. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049 oder Actinoplanes liguriae ATCC 31048 unter aeroben Bedingungen in einem üblichen wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, bei Temperaturen von 25 bis 350C züchtet, aus der auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellten Kulturflüssigkeit das Gardimycin mit Butanol extrahiert, den Butanolextrakt auf einen pH-Wert von 4,0 ansäuert, den Butanolextrakt einengt und in der Kälte stehenläßt, den entstandenen Niederschlag abtrennt und durch Gegenstromextraktion mit dem Lösungsmittelsystem Butanol, m/15 Natriumkaliumphosphatpuffer (pH 7,2), Hexan im Volumenverhältnis 1 :1 :0,1 behandelt und gewünschtenfalls das erhaltene Mononatriumsalz mit einer Säure zur freien Säure Gardimycin umsetzt
4. Verwendung von Gardimycin und seines Mononatriumsalzes bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen.
Gardimycin wird durch Fermentation von Mikroorganismen der Gattung Actinoplanes erhalten. Bei dieser Fermentation entstehen die Metabolite A, B und C, wobei der Metabolit B Gardimycin darstellt. Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen wurden aus Bodenproben isoliert, die in Temossi, Italien, und Garbadi Bridge, Indien, gesammelt wurden. Sie erhielten die Codenummer A/6353 bzw. A/10889. Beide Stämme wurden bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 31048 bzw. ATCC 31049 hinterlegt.
Zur Herstellung des Gardimycins wird der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält. Im allgemeinen wird der Mikroorganismus in einem Schüttelkolben vorkultiviert, bis sich eine erhebliche Menge an Antibiotikum gebildet hat. Sodann wird diese Kultur zum Beimpfen von größeren Fermentern verwendet. Die Züchtung wird vorzugsweise bei 25 bis 35° C unter aeroben Bedingungen so lange fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge an Antibiotikum gebildet hat. Während dieser Zeit werden nach der Agardiffusionsmethode mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt, um die Konzentration der antibiotischen Substanzen zu bestimmen. Dabei wird als Testorganismus Sarcina lutea benutzt.
Das Antibiotikum wird aus der auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellten Kulturflüssigkeit mit Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird vom wäßrigen Medium abgetrennt, auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, bis auf ein kleines Volumen eingeengt und 10 bis 15 Stunden in der Kälte stehengelassen. Danach wird der entstandene Niederschlag abfiltriert. Die Papierchromatographie an Whatman-Papier Nr. 1 und Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel des erhaltenen Rohproduktes und die nachfolgende Bioautographie (vgl. Nicolaus et al., Il Farmaco, Ed. Prat., Bd. 8 [1961], S. 350 bis 370) mit Staphylococcus aureus als Testkeim zeigen die Anwesenheit von mindestens zwei Fermentationsprodukten an, die zur Identifizierung als Metabolit A und Metabolit B bezeichnet werden, von dem der eine, d. h. E, das Gardimycin ist, das in höheren Ausbeuten gebildet wird.
Diese zwei Komponenten haben unterschiedliche Rf-Werte, die in verschiedenen Eluierungssystemen
variieren. Die Metaboliten A und B werden durch mehrfache Gegenstromextraktion mit dem Lösungsmittelsystem Butanol. M/15 Natrium-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2), Hexan im Volumenverhäitnis 1:1:0,1 gereinigt und als reine Verbindungen isoliert Während dieses Schritts wird der Metabnlit B, d.h. das Gardimycin, als Mononatriumsalz erhalten, der durch Ansäuern in die entsprechende freie Säure umgewandelt werden kann.
Die Mutierlaugen des Butanolextrakts werden in ein inertes, nicht polares organisches Lösungsmittel, beispielsweise Leichtbenzin, gegossen. Hierbei entsteht ein weiterer Niederschlag. Nach den chromatographischen Untersuchungen und der Bic autographic die auf die vorstehende Weise ausgeführt werden, besteht der erhaltene Feststoff im wesentlichen aus einer einzigen
Tabelle 1
Wirkungsspektrum (MHK: ug/ml)
Verbindung, die sich von den Metaboliten A und B hinsichtlich ihrer unterschiedlichen Rf-Werte in dem gleichen Eluierungssystem unterscheidet. Zur Identifizierung wird sie Metabolit C genannt.
Die Metaboliten A und C werden verworfen. Sie sind nicht bzw. wenig antibiotisch aktiv.
Metabolit B, d. h. Gardimycin, und sein Mononatriumsalz zeigen gute antibakterielle Aktivität in vitro und in vivo. Die Verbindungen haben insbesondere in vitro eine hervorragende antibakterielle Aktivität gegen gram-positive Keime bei Konzentrationen von 1 bis 50 u.g/ml. In Tabelle I sind die minimalen Hemmkonzentrationen der Verbindungen und von Lincomycin und Erythromycin gegenüber verschiedenen pathogenen Keimen zusammengefaßt
Stamm Gardimycin Gardimycin- Lincomycin Erythromycin
Mononalriumsalz
S. aureus ATCC 6538 50 25 0,025 0,006
S. aureus Tour 25 25 0,4 0,2
S.jß-haemolyticus C 203 ISM 0,8 0,8 0,025 0,012
D. pneumoniae UC 41 25 25 0,05 0.012
P. vulgarisX 19 H ATCC 881 >100 >100 >100 >100
E. coli SKF 12140 > 100 >100 >100 50
P. aeruginosa ATCC 10145 >100 >100 >100 25
C.albicansSKF2270 >100 >100 >100 >100
ISM = Instituto Sierotcragico Milanese;
SKF = Smith, Kline & French Co.;
UC - Upjohn Company.
Gardimycin zeigt überraschenderweise in vivo eine hohe Aktivität bei durch gram-positive Kokken der Gattung Diplococcus und Streptococcus infizierten Mäusen, die mit einer sehr niedrigen akuten Toxizität
Tabelle Il
einhergeht. In Tabelle II sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen bei der experimentellen Infektion von Mäusen mit Streptococcus haemolyticus C 203 ISM und Diplococcus pneumoniae UC 41 zusammengefaßt.
Verbindung LD50 mg/kg
i. p. Maus		 690 S. /f-huem.
C 203 ISM
ED5O mg/kg		 T. I.
LD5O/EÜ,(,		 D. pneum.
UC41
ED5O mg/kg		 13,2 T. I.
LD5Ü/ED5„
1000 S. C. S. C. 13,2
Gardimycin freie Säure 3310 Mononatriumsalz eigner 0,467 7080 9.33 251
Gardimycin Mononatriumsalz 3500 0,435 8050 >160 265
Erythromycin 3,79 182 74
Lincomycin 5,36 187 nicht
beslimmt
Gardimycin und sein i ι sich Resisten izentwicklune und keine Kreuzresistenz mit
zur Bekämpfung von Infektionen, z. B. Streptokokken-Angina, Tonsillitis, rheumatischem Fieber, Scharlach, Otitis media und Endocarditis, die durch gram-positive Keime, insbesondere Streptococcus haemolyticus und/oder Diplococcus pneumoniae, hervorgerufen werden. Die Verbindungen werden vorzugsweise parenteral appliziert. Gardimycin zeigt eine sehr niedrige bekannten Antibiotika.
Beschreibung des Stammes A/6353 (ATCC Nr. 31048) Cer Stamm wächst gut auf verschiedenen Agarmedien. Auf Hafermehlagar haben die Kolonien, die einen Durchmesser von etwa 5 mm besitzen, eingekerbte Konturen, schwach radiale Furchen und eine zentrale Vertiefung. Luftmycel fehlt immer.
Sporangien bilden sich reichlich auf Hafermehlagar, Glycerin-Asparagin-Agar und Czapek-Glucose-Agar, wobei Aussehen und Größe in Abhängigkeit vom Medium verschieden ist. Auf Hafermehlagar haben die Kolonien reguläre Konturen und ein kugelförmiges bis ovales Aussehen. Die Sporangien haben eine Größe von 15 bis 25 μ. Die Sporen sind beweglich und kugelförmig mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2 μ. Ein gelb-bernsteinfarbenes, lösliches Pigment wird in verschiedenen Medien produziert.
Beschreibung von Actinoplanes A/10889 (ATCC Nr. 31049)
Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Agar-Nährböden. Die Oberfläche ist undurchsichtig und
Tabelle III
gewöhnlich rauh bis gerunzelt. Luftmycel fehlt gewöhnlich, jedoch werden in einigen Medien Ansätze eines Luftmycels beobachtet. Unter dem Mikroskop zeigt das vegetative Mycel schwache Verzweigungen mit einem Durchmesser von ungefähr 1 μ. Sporangien werden mäßig nur auf Caiciummalatagar gebildet, sie sind kugelig mit unregelmäßiger Oberfläche, oft gelappt und mit einem Durchmesser von 7 bis 12 μ. Nach dem Aufbrechen der Wandung des Sporangiums werden die Sporen entlassen. Die Sporen sind nahezu kugelförmig und beweglich. Die Abmessungen betragen 1 bis 1,5 μ.
Einige morphologische Eigenschaften der beiden Stämme sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Stämme
A/10189 (ATCC 31049)
A/6353 (ATCC 31048)
Sporangien
Sporen
Luftmycel
Lösliches Pigment
nur auf Caiciummalatagar gebildet Größe: 7 x 12 u
kugelig (1 bis 1,5 μ) im Ansatz beobachtet fehlt
reichlich auf einigen Agar-Nährböden gebildet, jedoch unterschiedlich in Größe und Gestalt. Auf Hafermehlagar ist die Größe zwischen
15-25 μ kugelig (1,5 bis 2 μ)
fehlt immer
gelb-bernsteinfarbenes Pigment auf einigen
Agar-Nährböden
In Tabelle IV sind die Wuchsformen von Actinoplanes A/6353 und Actinoplanes A/10889 auf verschiedenen Standard-Nährböden zusammengefaßt, die von Shirling und Gottlieb (Intern J. Syst. Bact, Bd. 16 [1966], S. 313—340) sowie von Waksman(The Actinomycetes, Bd.
Tabelle IV
II, The Williams and Wilkins Co. [1961]) empfohler wurden. Die bei einigen Nährböden angegebener Zahlen beziehen sich auf die von Shirling und Gottlieb angegebenen Nährböden. Die Wuchsformen wurder nach 6- bis 14tägiger Inkubation bei 300C bestimmt.
Nährböden
Wuchsformen A/10889
A/6353
Medium Nr. 2
(Hefeextrakt-
Malzagar)
Medium Nr. 3
(Hafermehlagar)
Medium Nr. 4
(anorganische Salze-Stärke-Agar)
Medium Nr. 5
(Glycerin-Asparagin-Agar)
Medium Nr. 6
(Pepton-Hefeextrakt-
Eisenagar)
Medium Nr. 7
(Tyrosin-Agar)
reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, bernsteinfarben
mäßiges Wachstum, glatt, undurchsichtig, cremefarben bis orange an den Kanten
mäßiges Wachstum, glatte Oberfläche, tieforange
mäßiges Wachstum, glatte Oberfläche, orange
spärliches Wachstum, rauhe Oberfläche, dunkelbraun, mit braunem Pigment
reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, kaffeebraun, schwach-braunes Pigment reichliches Wachstum, schwach
runzelig, hell-orange bis hell-bernsteinfarben
reichliches Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, hell-orange, einige Sporangien, hell-gelbes lösliches
Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, orange, einige Sporangien,
kanariengelbes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, hell-orange, reichliche Pigmentbildung, kanariengelbes lösliches Pigment
mäßiges Wachstum mit glatter Oberfläche, orange
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, rosa-bernsteinfarben, gute
Sporangienbildung, rosa-bernsteinfarbenes lösliches Pigment
Fortsetzung
Nährböden
Ilafermehl-Agar
(nach Waksman)
Hickey und
Tresncr's Agar
Czapek Glucose
Agar
Glucose-Asparagin-Agar
Nähragar
Kartoffelagar
Bennet's Agar
Calciummalatagar
Magermilch-Agar
Czapek-Agar
Ei-Agar
Pepton-Glucose-Agar
Loeffler-Serum
KartofTelnährboden
Wuchsformen
Λ/10889
A/6353
reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, orange, Spuren eines rudimentären Luftmycels
reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, hellbraun
kaum Wachstum, glatte Oberfläche, hellorange,
Spuren eines rudimentären Luftmycels
reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, tief-orange
mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche, orange bis hellbraun
reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche,
orange bis hellbraun,
Spuren eines rudimentären Luftmycels
reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, hell-orange ,
mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche, cremefarben bis hell-orange
reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, tief-orange
kaum Wachstum, krustige Oberfläche, hellorange
reichliches Wachstum, glatte Oberfläche, orange
sehr spärliches Wachstum, glatte Oberfläche, hyalin
sehr spärliches Wachstum, dünn und glatt, hyalin
sehr spärliches Wachstum, glatte Oberfläche, hell-orange bis bernsteinfarben
spärliches Wachstum, runzelige Oberfläche, orange
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, hell-orange bis topas-gelb; gute Bildung großer Sporangien, gelbes lösliches Pigment
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, rosa-bernsteinfarben, reichliche Sporangienbildung
reichliches Wachstum mit glatter und dünner Oberfläche, orange, reichliche Sporangienbildung
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, orange, einige Sporangien
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, orange
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, bernsteinfarben
reichliches Wachstum mit krustiger Oberfläche, hell-orange
spärliches Wachstum mit glatter Oberfläche, farblos, einige Sporangien
reichliches Wachstum mit schwach krustiger Oberfläche, tief-orange, gelbes lösliches Pigment
spärliches Wachstum, hell-orange, mäßige Bildung von Sporangien
reichliches Wachstum mit glatter Oberfläche, hell-cremefarben, mäßige Bildung von Sporangien
reichliches Wachstum mit runzeliger Oberfläche, tief-orange
sehr spärliches Wachstum, dünn und glatt, farblos
spärliches Wachstum, hell-orange
spärliches Wachstum, runzelig, hellorange
Die günstigste Temperatur zur Entwicklung der Kolonien liegt im Bereich von etwa 18 bis 42"C, das Temperaturoptimum bei etwa 28 bis 37° C
In Tabelle V ist die Verwertung von Kohlenstoffquelien zusammengefaßt, die nach der Methode von Pridham und Gottlieb bestimmt wird.
Tabelle V KohlenstofTquelle
55 Wachstum
A/10889 A/6353
KohlenstofTquelle
Wachstum A/10889 A/6353
Inosit
Fructose
Rhamnose
Mannit
Xylose
Raffinose 60 Arabinose
Cellulose
Salicin
Sucrose 65 Mannose
Lactose Glucose (positive Kontrolle)
ίο
In Tabelle VI sind die physiologischen Eigenschaften der beiden Stämme zusammengefaßt.
Tabelle VI
Versuch
A/10889 Λ/6353
Stärkehydrolyse positiv positiv
Schwefelwasserstoffbildung positiv negativ
Melaninbildung positiv negativ
Tyrosinhydrolyse positiv negativ
Cascinhydrolyse negativ positiv
Calciummalathydrolyse negativ negativ
Lackmusmilchkoagulation negativ negativ
Lackmusmilchpeptonisierung negativ negativ
Nitratreduktion positiv negativ
Gelatineverflüssigung positiv negativ
Die beiden Stämme A/6353 und A/10889 werden wegen ihrer kugelförmigen Sporangien, beweglichen Sporen und der Morphologie ihrer Kolonien der Gattung Actinoplanes zugeschrieben. Sie unterscheiden sich jedoch eindeutig voneinander hinsichtlich ihres Wachstums auf verschiedenen Agarnährböden, der Bildung oder Nichtbildung löslicher Pigmente, der Kohlenstoffverwertung und der physiologischen Eigenschaften. Insbesondere zeigt der Stamm A/6353 eine sehr begrenzte Fähigkeit glykosidische Bindungen, einschließlich Sucrose, zu hydrolysieren, die, soweit beschrieben, von jeder Spezies der Gattung Actinoplanes verwertet wird. Der Stamm A/10889 bildet ein rudimentäres Luftmycel, was selten bei einer Spezies der Gattung Actinoplanes zu beobachten ist. Die zwei Stämme sind von allen, bisher bekannten Spezies der Gattung Actinoplanes leicht zu unterscheiden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung des Antibiotkums, Isolierung und
Abtrennung verschiedener Metaboliten
Mit dem Stamm Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049 wird unter aeroben Bedingungen eine Vorkultur in einem wäßrigen Nährmedium hergestellt, bis eine ausreichende antibiotische Aktivität der Kulturflüssigkeit vorliegt Ein Nährmedium für eine Schüttelkultur kann beispielsweise folgende Zusammensetzung haben:
g/Liter
Fleischextrakt 3,0
Hefeextrakt 10,0
Calciumcarbonat 4,0
Stärke 25,0
Leitungswasser auf 1000 ml
Die Kolben werden etwa 24 Stunden bei etwa 28 bis 300C geschüttelt Anschließend werden jeweils 1 Liter der Vorkultur zum Beimpfen von Fermentern, verwendet, die jeweils 10 Liter des folgenden Nährmediums enthalten:
Fleischextrakt
Pepton
Hefeextrakt
Natriumchlorid
g/10 Liter
40
40
10
25
Sojabohnenmehl
Glucose
Calciumcarbonat
Leitungswasser auf
100
500
50
10 Liter
Die Ansätze werden aerob bei 28 bis 30°C inkubiert und gerührt. In Zeitabständen wird die antibiotische Aktivität mikrobiologisch nach dem Agardiffusionstest
lü mit Sarcina lutea als Testorganismus bestimmt. Die maximale antibiotische Aktivität wird nach 96- bis 120f,tündiger Fermentation erreicht.
Die Fermentationsbrühe wird auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und danach mit einer Filterhilfe (Diatomeenerde) filtriert. Das Mycel wird verworfen. Das Filtrat wird mit Butanol in einer Menge entsprechend 50% seines Volumens extrahiert. Der Butanolextrakt wird von der wäßrigen Phase abgetrennt, mit angesäuerter wäßriger Lösung (pH 4,0) gewaschen, auf etwa 1Ao seines ursprünglichen Volumens eingedampft und 10 bis 12 Stunden bei einer Temperatur von 3 bis 6" C stehengelassen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Butanol gewaschen und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Ausbeute 3 g.
Chromatographische Untersuchungen des Niederschlags an Whatman Papier Nr. 1 oder Kieselgel und anschließende Bioautographie der Flecken mit Staphylococcus areus als Testorganismus weisen auf die Gegenwart von zwei Komponenten hin, die als Metabolit A und Metabolit B (Gardimycin) bezeichnet werden. In Abhängigkeit von der Natur des verwendeten Eluierungssystems besitzen sie verschiedene Rr-Werte.
Das Rohgemisch wird zur weiteren Reinigung in etwa 30 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wird etwa 16 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert und sodann unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt. Es werden 1,5 g Rohprodukt erhalten, das noch aus einem Gemisch von Metabolit A und Gardimycin besteht. Die zwei Antibiotika werden durch mehrere Gegenstromextraktionen getrennt und gereinigt. Dies ist aufgrund der verschiedenen Verteilungskoeffizienten des Metabolits A und Gardimycin in einem zuvor bestimmten Lösungsmittelsystem möglich. Das verwendete Lösungsmittelsystem besteht aus Butanol zu M/15 Natrium-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) zu Hexan in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 : 0,1. Die Verteilungskoeffizienten des Metaboliten A und Gardimycin in diesem Lösungsmittelsystem betragen 0,3 bzw. 0,8. Nach 100 Extraktionen werden 0,45 g Gardimycin als Mononatriumsalz erhalten.
Die Mutterlaugen, die aus dem Butanolextrakt nach dem Ausfällen des Metabolitengemisches A und B erhalten werden, werden auf ein kleines Volumen eingeengt und dann in einen Überschuß von Petroläther gegossen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert Nach den chromatographischen Untersuchungen, die unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend ausgeführt wurden, besteht diese Fraktion aus einem Produkt, das sich in den gleichen Eluierungssystemen von den Metaboliten A und B hinsichtlich seines Rf-Wertes unterscheidet Diese Fraktion wird als Metabolit C bezeichnet Die Metaboliten A und C werden verworfen. Die unterschiedlichen chromatographischen Ergebnisse der drei Metaboliten in verschiedenen Eluierungssystemen sind in Tabelle VII zusammengefaßt
12
Tabelle VIl
RrWerte Gardimycin*)
MeUibolit A
Metabolit C
Papierchromatographie auf Whatman-Papier Nr. 1; die Flecke werden durch Bioautographie mit Staphylococcus aureus sichtbar gemacht
Eluierungssystem
1) Butanol, gesättigt mit M/15 Phosphatpuffer (pH 6,0)
2) Butanol, gesättigt mit Wasser, das 2% p-Toluolsulfonsäure enthält
3) Butanol, gesättigt mit Wasser, das 2% Ammoniak enthält
4) M/15 Phosphatpuffer (pH 6,0), gesättigt mit Butanol
5) 20%ige wäßrige Natriumchloridlösung
6) Butanol zu Methanol zu Wasser = 40 : 10 : 20 mit 0,75% Methylorange
7) Butanol zu Methanol zu Wasser = 40 : 10 : 20
8) Aceton zu Wasser =1:1
9) Äthylacetat, gesättigt mit Wasser
Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel; die Flecke werden durch Schwefelsäure, Vanillin und Bioautographie mit Staphylococcus aureus sichtbar gemacht
Eluierungssystem
Ammoniak zu Äthanol zu Wasser =1:8:1
*) Der MeUibolit B wird als Monomitriumsalz untersucht.
0,15 0,00 0,85
0,80 0,75 0,95
0,10 0.15 0.85
0,80 0,65 0,00
0,80 0,00 0,00
0,65 0,70 0,90
0,60 0,85 0,90
0,80 0,80 0,65
0,00 0,00 0,75
0,70
0,30
0,00
Beispiel 2
Der Stamm Actinoplanes liguriae ATCC 31048 wird gemäß Beispiel 1 aerob 130 bis 170 Stunden bei Temperaturen von etwa 28 bis 300C gezüchtet. Es werden 1,4 g des Metabolitengemisch.es A und B (Gardimycin) erhalten. Das Vorliegen der beiden Metaboliten wird mit Hilfe der gleichen in Beispiel 1 angeführten chromatographischen Untersuchungen entdeckt. Die Reinigung und Trennung der beiden Metaboliten wird gemäß beispiel 1 durchgeführt. Es werden 0,2 g Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes erhalten. Der Metabolit A wird verworfen.
Physikochemische Eigenschaften des Gardimycins in Form seines Mononatriumsalzes:
Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes ist ein amorphes weißes Pulver mit amphoterem Charakter und einem isoelektrischen Punkt von 4,2, der durch Elektrofokussierung in Ampholin bestimmt wird. Nach starker 16stündiger Hydrolyse in 6 N-Salzsäure bei 1200C im Bombenrohr können folgende Aminosäuren nachgewiesen werden:
Valin, Serin, Glycin, Glutaminsäure, Isoleucin, Leucin, Alanin, Lanthionin und ß-Methyllanthionin. Nach 15stündiger Hydrolyse mit 5 N-Bariumhydroxid bei 1100C im Bombenrohr und chromatographischer Analyse der Hydrolyseprodukte kann Tryptophan nachgewiesen werden. Die vorstehend genannten Aminosäuren liegen in folgendem Verhältnis vor:
Isoleucin Leucin
Alanin
Lanthionin j3-Methyllanthionin Tryptophan
55 Weiterhin ist Gardimycin in Form seines Mononatriumsalzes durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:
1) Schmelzpunkt: 260°C(Zers.)
2) Äquivalentgewicht (bestimmt durch potentiometrische Titration):
2005-2168
3) Elementaranalyse: C 48,7-48,6% H 6,7- 6,6%
11,8-12,2% 5,3- 5,5% 1,1%
N
S
Na
H2O 3,6- 33%
4) UV-Absorptionsbanden in folgenden Lösungsmitteln:
Lösungsmittel
E\]
2 65 Methanol 273 (Schulter) 26
Verhältnis von Aminosäuren 1 280 24
Valin 2 299
Serin 1 0,1 N-Natronlauge 273 (Schulter) 26
Glycin 279
Glutaminsäure 288
Fortsetzung
Lösungsmittel
/,„„Λ (nm)
0,1 N-Salzsäure
Phosphatpuffer
(pH 7,38)
273 (Schulter)
279
288
273 (Schulter)
279
288
26
22
24 20
Die vollständigen UV-Spektren sind in Fig. 2 wiedergegeben.
5) Infrarotspektrum:
Charakteristische Banden werden in Nujol bei foigenden Wellenzahlen beobachtet:
3280, 2920-2840 (Nujol), 1650, 1520, 1455 (Nujol), 1375 (Nujol), 1260,1045,990 und 720.
Das IR-Spektrum ist in F i g. 3 wiedergegeben.
6) Spezifischer Drehwert:
[«]«= -44° (c=0,5% in Dimethylformamid)
7) Löslichkeit:
Löslich in Wasser, wäßriger Natriumbicarbonatlösung, verdünnten wäßrigen Lösungen von Alkalihydroxiden, heißem Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Eisessig; unlöslich in verdünnten Mineralsäuren, Benzol, Aceton, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Alkanolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und Tetrahydrofuran
8) Charakteristische Reaktionen:
Fehling positiv
Tollens positiv
KMnO4 positiv
H2SO4 konz. positiv
Ninhydrin negativ
FeCU negativ
Millon negativ
Schiff negativ
Maltol negativ
9) pKa-Werte:
Die pKa-Werte (potentiometrisch bestimmt) in Wasser 7,1 und in Äthylenglykolmonomethyläther zu Wasser (16:4) 8,5.
10) Ausgehend vom Mononatriumsalz des Gardimycins kann Gardimycin in Form der freien Säure hergestellt werden:
1 g des Gardimycinmononatriumsalzes werden in 150 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit lOprozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und dann zweimal mit 75 ml wassergesättigtem Butanol extrahiert.
Die Butanol-Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei 45° C auf ein Volumen entsprechend V20 des Ausgangsvolum«:ns eingeengt. Nach 12stündigem Stehen bei 4° C wird die entstandene Fällung abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und bei 40 bis 45° C unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0,95 g Produkt erhalten, das sich beim Erhitzen auf etwa 250 bis 3000C zersetzt.
Gardimycin in Form der freien Säure ist durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:
1) Äquivalentgewicht (bestimmt durch potentiometrische Titration):
1980-2145:
2) Elementaranalyse:
C 49,88%, H 6,91%, N 13,88%, S 6,45%
3) U.V.-Absorptionsbanden in folgenden Lösungsmitteln:
Lösungsmittel 273 (Schulter)
280
299		 t-\ cm
Methanol 273 (Schulter)
279
288		 26
24
0,1 N-Natronlauge 273 (Schulter)
279
288		 26
22
0,1 N-Salzsäure 273 (Schulter)
279		 26
22
Phosphatpuffer
(pH 7,38)		 24
288 20
Die vollständigen UV-Spektren entsprechen denen des Mononatriumsalzes;
4) Infrarotspektrum:
Charakteristische Banden werden in Nujol bei folgenden \ Zeilenzahlen beobachtet:
3300, 3060, 2920-2850 (Nujol), 1660, 1525, 1450
(Nujol), 1375 (Nujol), 1235 und 975.
Das IR-Spektrum entspricht im wesentlichen dem IR-Spektrum des Mononatriumsalzes.
5) Spezifischer Drehwert:
[λ] ·,.'= -67° (C= 0,5% in Dimethylformamid). Der Unterschied zwischen diesem Wert und dem des Mononatriumsalzes läßt sich aus der höheren Reinheit der getesteten Probe der freien Säure erklären. Kleine Unreinheiten können den Drehwert erheblich beeinflussen, wenn auch nicht die anderen Parameter;
6) Löslichkeit:
Löslich in Phosphatpuffer pH 7,4, Boratpuffer pH 9,90, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid; unlöslich in Acetatpuffer pH 1,79, Benzol, Hexan, Cyclohexan, Chloroform, Aceton, Alkanolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und Tetrachlorwasserstoff;
7) Charakteristische Reaktionen: positiv
Fehling positiv
Tollens positiv
KMnO4 positiv
H2SO4 konz. negativ
Ninhydrin negativ
FeCl3 negativ
Millon negativ
Schiff negativ
Maltol
8) pKa-Werte:
Zwei pKa-Werte wurden in Wasser potentiometrisch bestimmt: 6,8 und 4,2;
9) isoelektrischer Punkt (bestimmt durch Elektrofokussierung in Ampholin): 4,2;
10) Aminosäure Verhältnis: wie das Mononatriumsalz.
Weitere Angaben über Gardimycin wurden in Journal of Antibiotics, Bd. 29 (1976), S. 507-510 und Annali die b5 Chimica, Bd. 67 (1977), S. 691-697 veröffentlicht, wo sich auch nähere Angaben über die Summenformel und die Aminosäuren Lanthionin und j3-Methyllanthionin finden.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Peptidantibiotikum Gardimycin mit einer basischen und zwei sauren Funktionen, g e k e η η zeichnet durch folgende Eigenschaften:
Schmelzpunkt« 250—300° C (Zers.);
Äquivalentgewicht (bestimmt durch potentio-
metrische Titration) 1980—2145;
IR-Absorptionsspektrum in Nujol gemäß Fig. 1;
UV-Absorptionsspektrum gemäß F i g. 2;
spezifischer Drehwert [α] « =-67° (c=0,5°k
in Dimethylformamid);
löslich in Phosphatpuffer pH 7,4, Boratpuffer
pH 9,90, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid;
unlöslich in Acetatpuffer pH 1,79, Benzol, Hexan, Cyclohexan, Chloroform, Aceton, Alkanolen mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und Tetrachlorkohlenstoff;
pKa-Werte (potentiometrisch bestimmt) 6,8 und 4,2 in Wasser;
isoelektrischer Punkt (bestimmt durch Elektrofokussierung in Ampholin) 4,2;
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