DE2527064C3 - Verfahren zur Herstellung eines intravenösen Nativ-Human-Immunglobulin-Präparates mit natürlicher Halbwertszeit und gegenüber dem Ausgangsmaterial unveränderten Antikörperaktivität - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein für die intravenöse Anwendung geeignetes Gammaglobulin aus Humanplasma, das ohne modifizierende Verfahren erhalten werden kann.

Es ist bekannt, daß man durch Fraktionierung ein Gammagiobulin herstellen kann, das die Eigenschaft hat, unspezifisch Komplement zu fixieren (Barandur., S. »Die Gammaglobulin-Therapie«, S. Karger-Verlag, Basel 1963). Diese antikomplementäre Aktivität wird mit dem Entstehen von Aggregaten in Beziehung gebracht. Unspezifisch Komplement-fixierendes Gammaglobulin ist für eine intravenöse Anwendung nicht geeignet, sondern lediglich für eine antramuskuläre Anwendung. Da die Antikörper-Wirksamkeit aber bei einer intravenösen Anwendung vollständiger ist und vor allem sofort eintritt, hat es nicht an Versuchen gefehlt, intravenös verträgliche Gammaglobulin-Präparate herzustellen.

Bekanntlich besteht die biologische Funktion der Antikörper in der Elemination von Bakterien und Viren sowie in der Neutralisation von Toxinen. Der Antigenbindende Teil (Fab-Teil) des Antikörpermoleküls sorgt dabei zunächst für die Erkennung und Neutralisation von Erregern. Der entstehende Antigen-Antikörper-Komplex bewirkt eine Aktivierung des Komplementbindenden Teils (Fc-Teil) des Moleküls. Dadurch werden eine Reihe von immunologischen Folgereaktionen in Gang gesetzt, deren wesentlichste die Phagozytose und die spezifische Aktivierung des Komplementsystems sind. Die spezifische Aktivierung des Komplementsystems, die man klar von der unspezifischen (antikomplementäre Wirkung) unterscheiden muß, bewirkt bei bakteriellen Infektionen eine Bakteriolyse. Als weitere Folge der Komplementaktivierung werden Anaphylatoxine und chemotaktische Faktoren »dosiert« freigesetzt. Die Anaphylatoxine sorgen durch Erhöhung der Gewebodurchlässigkeit für eine gesteigerte Antikörperkonzentration am Ort der Infektion, während die chemotaktischen Faktoren die Phagozytose unterstützen. Somit kommt bei der Infektabwehr dem Fc-Teil des Immunglobulin-G-Moleküls eine überragende Bedeutung zu. Klinisch von besonderer Bedeutung ist die in vivo Halbwertszeit der in intravenösem Gammaglobulin enthaltenen Antikörper. Je länger die in vivo Halbwertszeit ist, umso langer kreisen die zugeführten Antikörper im Blut und umso länger stehen sie für eine prophylaktische Wirksamkeit zur Verfügung. Dies ist von entscheidender Bedeutung bei Krankheiten, in deren Verlauf der Organismus nicht in der Lage ist, Antikörper zu bilden. Man ist hier gezwungen, die Antikörper laufend zuzuführen. Je weniger ofi dies notwendig ist, umso einfacher ist insbesondere eine ambulante Behandlung durchzuführen.
Es sind auch bereits Verfahren bekannt, um aus unspezifisch Komplement-fixierendem Human-Standard-Gammaglobulin ein intravenös verträgliches Präparat herzustellen. Diese Verfahren beruhen darauf, daß das durch herkömmliche Fraktionierverfahren wie die Cohnsche Alkoholfraktionierung oder die Rivanol-Ammonsulfat-Fraktionierung gewonnene, unspezifisch Komplement-fixierende Human-Standard-Gammaglobulin hydrolytisch bzw. enzymatisch in die einzelnen Fragmente gespalten und so die unspezifische Komplementfixierung beseitigt bzw. die antikomplementäre Aktivität durch chemische Modifizierung durch β-Ρτο-piolacton beseitigt wird. Es sind dies im einzelnen folgende Verfahren:

Pepsin-Abbau (Schultze, H.E und Sch wick, G.:

Dtsch. med. Wochenschrift, 87,1643/1962/).
Papain-Abbau (Barandun, S. et al.: Vox Sang. 28,

157/1975/).
HCl-Behandlung (Barandun, S. et al.: Vox Sang. 7, 187/1962/).

0-Propiolacton-Behandlung (Stephan, W.:Z.klin. Chem. klin. Biochemie 7,282/1969/).

Betrachtet man die Halbwertszeiten, so liegen die Halbwertszeiten aller bekannten Präparate unter der natürlichen Halbwertszeit von 18-22 Tagen. Dies liegt

jo an der drastischen Molekülveränderung durch den enzymatischen Abbau: Es entstehen Antikörper-Bruchstücke, die eine hohe Elirninationsgeschindigkeit haben. Die gezielte chemische Modifizierung durch 0-Propiolacton liefert ein deutlich besseres Produkt mit einer

j5 Halbwertszeit von 15 Tagen. Das erfindungsgemäße Ziel wird dadurch jedoch noch immer nicht erreicht: Die Isolierung und Ankonzentrierung menschlicher Immunglobuline mit natürlicher, unveränderter Halbwertszeit von 18 — 22 Tagen, frei von antikomplementärer Aktivität und daher intravenös anwendbar.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich ein intravenöses Immunglobulin mit natürlicher Halbwertszeit und frei von antikomplementärer Aktivität aus Humanplasma oder -serum herstellen läßt.

Dieses Produkt ist insbesondere frei von antikomplementärer Aktivität. Es läßt sich in der Immunelektrophorese, bei der Gelfiltration und in der Ultrazentrifuge nicht von Nativ-Immunglobulin G im Serum und Plasma unterscheiden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von Nativ-Human-lmmunglobulin mit natürlicher Halbwertszeit und gegenüber dem Ausgangsmaterial unveränderter Antikörperaktivität aus Humanplasma oder -serum, daß dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Ausgangsmaterial '/2—4 Stunden auf 50-60° C, vorzugsweise etwa 2 Stunden auf 56⁰C, erhitzt und dann in bekannter Weise eine Fraktionierung durchführt.
Die günstigen Eigenschaften des erfindungsgemäßen

bo Produktes wurden durch die nachfolgend beschriebenen Untersuchungen belegt, die mit einer 5%igen Lösung durchgeführt wurden.

1. Klinische Verträglichkeit

_b5 Es wurden 20 Patienten jeweils einmal mit einer Dosis von 0,1 -0,5 ml/kg behandelt. Davon hatten 2 Patienten das Antikörpermangelsyndrom, Typ Bruton. Solche Patienten sind bekanntlich gegenüber intravenösem

Gammaglobulin besonders empfindlich. Das Präparat wurde in allen Fällen reaktionslos vertragen.

2. Antikomplementäre Aktivität

Der antikomplementäre Titer ist nicht höher als maximal 1 :5, verglichen mit der NaCl-Kontrolle beim Hämolysetest nach K ab at und Mayer, und entspricht weitgehend dem handelsüblichen intravenösen Immunglobulin verschiedener Herstellung.

Auszug aus einem Protokoll über eine Komplementbestimmung:

Probe ml Kompl. je 10 ml Probe

2 4 6

12

16

18

Plasma

IgGI

IgGJI

Erläuterung:

- totale Hämolyse: keine antikomplementäre Aktivität ++++ keine Hämolyse: antikomplementäre Aktivität

++ 50% Hämolyse

IgG I: Cohn-Fraktion Il aus Nativ-Plasma (Reinheitsgrad über 95%) IgG II: Cohn-Fraktion 11 aus erhitztem Plasma (Reinheitsgrad über 95% Immunglobulin G).

3.) Antikörper-Aktivität

Röteln

Masern

(reziproke Titer im
Hämagglutinationslest)

Plasma

Immunglobulin
gemäß Erfindung

64
512

32
128

Ankonzentrierungsfaktor etwa 4-8 (wie rechnerisch ermittelt).

4. Halbwertszeit

Halbwertszeitbestimmung nach der Doppel-Markierungsmethode mit ¹²⁵J und ¹³¹J im Vergleich mit intramuskulärem Standard-lmmunglobin (McFarlan e, A. S.: Nature, London 182,53/1958/).
Es wurde ein Wert von 20 Tagen gefunden (natürlicher Bereich 18-22 Tage).

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert:

Beispiel 1

1 Liter Human-Citratplasma aus einem 1000-Spender-Pool wurde 2 Stunden auf 56⁰C erhitzt. Anschlie-Bend wurde abkühlen gelassen und dann durch übliche Fraktionierverfahren wie z. B. die Cohnsche Alkohol-Fraktionierung (Kistier, P. et al: Vox Sang. 7, 414/1962/) oder die Rivanol-Ammon-Sulfat-Fraktionierung (Horejsi, J. et al.: Acta med.Scand. 155,

to 65/1956/) die Gammaglobulin-Fraktion abgetrennt und eine 5%ige Lösung in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt.

Beispiel 2

D Anstelle von Citratplasma wurde ACD-Plasma, das einen dextrosehaltigen Citratstabilisator enthält, oder Serum als Ausgangsmaterial verwendet und wie in Beispiel 1 gearbeitet.

B e i s ρ i e I 3

Es wurden Reihenversuche durchgeführt, bei denen die Erhitzungszeit zwischen '/2 und 4 Stunden und die Temperaturen zwischen 50 und 60° C verändert wurden,

α r-, mit den Ausgangsmaterialien der Beispiele 1 und 2. Dabei zeigte sich, daß für kleine Laboransätze unter 1 Liter kurze Erhitzungszeiten bei niedriger Temperatur, bei Ansätzen im technischen Maßstab, d. h. etwa von 10 bis 1000 Liter, eine längere Erhitzungszeit bei höherer

--,ο Temperatur aus Gründen des volumenabhängigen Wärmeausgleichs optimal sind.

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   ί. Verfahren zur Herstellung von Nativ-Human-Immunglobulin mit natürlicher Halbwertszeit und gegenüber dem Ausgangsmaterial unveränderter Antikörperaktivität aus Humanplasma oder -serum, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ausgangsmaterial '/2-4 Stunden auf 50-60⁰C, vorzugsweise 2 Stunden auf 56° C, erhitzt und dann in bekannter Weise eine Fraktionierung durchführt
2. 2. Verwendung des nach Anspruch 1 hergestellten Nativ-Human-lmmunglobulins zur intravenösen Applikation bei der Bekämpfung von bakteriellen Infektionen.