DE2301501B2 - Verfahren zur gewinnung eines stabilen, von hypotensiven stoffen freien plasmaproteins - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines stabilen Plasmaproteins, das frei von jeder hypotensiven Substanz ist, als keinerlei depressive >o Wirkung zeigt und für eine Schnellinfusion verwendet werden kann.

In der letzten Zeit gewinnt die Infusion von Plasmaprotein als wirksame Mittel für die medizinische Behandlung anstelle der Bluttransfusion zunehmend an 2> Interesse. Insbesondere werden bemerkenswerte therapeutische Wirksamkeiten bei der intravenösen Tropfinfusion von stabilem Plasmaprotein beobachtet, das frei von aktiven Hepatitisviren ist und bei Schock, Hypoproteinämie und übermäßigen Blutverlusten durch so Operation angewandt wird.

Eines der Ziele der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Erzeugung eines stabilen Plasmaproteins, das keinerlei depressive Wirkung zeigt und für eine Schnellinfusion verwendet werden kann.

Grundsätzlich wird dieses Ziel gemäß der Erfindung durch Abtrennung eines als Verunreinigung in einem von menschlichem Blut oder Placenta erhaltenen stabilen Plasmaprotein enthaltenen hypotensiven Peptids durch Adsorption an einem Kationenaustauscherharz oder an einem anorganischen Adsorptionsmittel oder durch Abtrennung des hypotensiven Peptids durch Gelfiltrations- oder Ultrafiltrationsverfahrens erreicht.

Weitere Besonderheiten der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der Ausgangssituation v> sowie der Entwicklung und Eigenart der Erfindung hervorgehen, wobei auf die Zeichnungen Bezug genommen wird; es zeigt

Fig. la eine bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein beobachtete Blutdruckkurve; das Plasmaprotein stammte von menschli chem Plasmaprotein und wurde vor der lOstündigen Erwärmung auf 6O⁰C verwendet; Drucksenkung: 0%,

Fig. Ib eine bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein beobachtete Blutdruckkurve; das Plasmaprotein stammte von menschlichem Plasmaprotein und wurde nach der lOstündigen Erwärmung auf 6O⁰C verwendet; Drucksenkung: 11,5%,

Fig. Ic eine bei intravenöser Injektion von einem stabilen Plasmaprotein aus menschlichem Plasmaprotein beobachtete Blutdruckkurve; (Protein nach lOstündiger Erwärmung auf 6O⁰C; behandelt mit Silicagel); Drucksenkung: 0%,

Fig. Id eine bei Verarbreichung von 188 mg/kg menschlichem Serum-Albumin gemessene Kurve; (,5 Drucksenkung: 0%,

Fig. Ie eine Kurve zum Vergleich der bei der glatten Muskulatur mit 10 ng Bradykinin (a), 5%iger stabiler Plasmaproteinlösung aus menschlichem Plasmyproicin (b) und 5%iger Lösung, die durch Behandlung der vorstehenden Lösung mit Silicagel erhalten worden war (c), beobachteten Kontraktionen,

F i g. 2a eine Blutdruckkurve nach bzw. bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg Plasmaprotein aus der Placenta unmittelbar vor einer einstündigen Erwärmung auf 6O⁰C in Gegnwart von Buttersäure; Drucksenkung: 0%,

Fig.2b eine bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta beobachtete Kurve; Drucksenkung: 19,1%,

Fig. 2c eine bei Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta, das mit Silicagel behandelt worden war, gemessene Kurve; Drucksenkung: 0%,

Fig. 2d eine Vergleichskurve für die Kontraktionen am glatten Muskel, die mit 5%iger stabiler Plasmaproteinlösung (aus menschlicher Placenta; behandelt mil Silicagel) (d), mit der gleichen aber nicht behandelten Lösung (e) mit 5%iger Humanserumalbumin-Lösung (f) und mit 20 ng (g), 10 ng (h) und 5 ng (i) Bradykinin beobachtet werden.

(Bei allen diesen Kurvenbildern bezeichnen »Λ« und »ß« ein Intervall, innerhalb dessen die Verabreichung vorgenommen wurde.)

Fig. 3 eine Verteilung der Fraktionen bei der Gelfiltration von stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta unter Verwendung von hydrophilem unlöslichem Molekularsieb für chromatographische Zwecke aus vernetztem Dextran von Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Schweden (Scphadex G-50®).
Daten für die Gelfiltration:

Säulengröße:	5 χ 50 cm
Packungsvolumen:	1 1
aufgegebene Lösung:	stabile Plasma
	proteinlösung
Volumen derselben:	70 ml
Volumen von 1 Prüfglas:	10 ml
Effluent:	0,5 M NaCI
Elutionsgesch windigkeit:	4 ml/min

Das stabile Plasmaprotein besteht zur Hauptmenge aus Albumin und geringeren Anteilen an α-Globulin und j3-Globulin. Thermisch stabiles «-Globulin und ^-Globulin wird durch Ultrazentrifugalanalyse vom Albumin nicht unterschieden. Demgemäß wird das stabile Plasmaprotein bei Prüfung durch elektrophoretische Verfahren nicht als reines Albumin identifiziert; es wird jedoch durch das Vorligen eines einzigen dem Albumin entsprechenden Peaks beim Ultrazentrifugieren gekennzeichnet.

Verfahren zur Herstellung von Protein mit thermischer Beständigkeit aus von frischem menschlichen Blut abgetrenntem Plasma wurden bereits praktisch angewandt, jedoch bestehen erhebliche Schwierigkeiten bei der Aufsammlung großer Mengen von frischem Plasma gesunder Personen. Menschliche Placenta dagegen, die erhebliche Mengen Blut enthält, wird allgemein als Abfall betrachtet und ist daher leicht zu erhalten, jedoch haben bislang Versuche zur Erzeugung von stabilem Plasmaprotein durch Extraktion von Plasma aus der Placenta zu keiner praktischen Anwendung geführt.

Typischerweise werden für die Gewinnung von stabilem Plasmaprotein aus Plasma im wesentlichen folgende Verfahren angegeben:

(1) Eine Abwandlung des Verfahrens von Cohn zur Plasmaproteinfraktionierung (6. Verfahren, siehe japa-

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iiische Paientpublikalion Nr. 5297/60). Diese Frakiionierungsvcrfahren besteht in der Behandlung eines von Fibrinogen und y-Globulin freien Plasmas mit Äthanol von 25- bis 38%iger Konzentration unier Btdingungen wie pH-Werten von 4,3-4,7. Temperaturen im Bereich ί von -2 bis 20"C und einer lonenstärke von 1,2 oder weniger zur Ausfällung einer Mischung von Albumin, (X-Globulin und /J-Globulin und Gewinnung des stabilen Plasniaproteins mit nachfolgender lOstündiger Erwärmung desselben auf 60⁰C zur Inaktivierung von in Hepatitisviren, die als Verunreinigungen im Plasmaprolein vorhanden sein könnten. Das auf diese Weise erhaltene Plasmaprotein zeigt jedoch eine depressive Wirkung (siehe Fig. Ib). Diese depressive Wirkung zeigt sich allerdings noch nicht bei der noch nicht r> wärmebehandelten Lösung dieses Plasmaproteins (siehe I-'ig. la).

Eine Gewinnung von stabilem Plasmaprotein aus Plasma- oder Gewebeextrakten mit einer großen Menge an Hämoglobin erfolgt (2) nach einem Verfahren ->u (siehe japanische Patentpublikation Nr. 16 041/68), bei dem stabiles Plasmaprotein durch Zugabe von Buttersäure zu Plasmaprotein- oder Gewebsextrakt mit einer großen Menge an Hämoglobin und nachfolgende Erwärmung auf 57 bis 60⁰C bei pH-Werten von 4,5 bis >"> 5,5 zur Ausscheidung und Entfernung von instabilem Globin gewonnen wird.

Dieses Verfahren besieht in der Gewinnung eines stabilen Plasmaproteins aus Albumin, «-Globulin und /i-Globulin aus der überstehenden Flüssigkeit bei der j< > Abtrennung einer y-Globulin enthaltgenden Fraktion als Niederschlag vom Plasma- oder Pacentaextrakt mit einer großen Menge an Hämoglobin; zu der (abgetrennten) überstehenden Flüssigkeit wird Buttersäure in solcher Menge zugegeben, daß ihre Endkonzentration 2 r> bis 6% ausmacht, der pH-Wert dann auf 4,5 bis 5,5 eingestellt und die Lösung zur Entfernung von wärmeinstabilem Globin als Niederschlag auf 57 bis 60⁰C erwärmt.

Das nach diesem Verfahren erhaltene stabile Plasmaprotein zeigt ebenfalls depressive Wirkung (siehe Fig. 2b). Die nach dem gleichen Verfahren erhaltene Proteinlösung zeigt allerdings vor der Erwärmung auf 57 bis 60°C keinerlei depressive Wirkung (siehe Fig. 2a). 4^Γ>

Bland u.a. beobachteten eine drucksenkende Wirkung bei Injektion von zumindest 100 ml 5%iger Lösung des nach obigem Verfahren (1) erhaltenen stabilen Plasmaproteins bei der Chirurgie am offenen Herzen innerhalb von 4 Minuten [J. H.L Bland, N.B. >o Laver und E. Lowenstein, »Hypotension infolge 5%iger Plasmaproteinfraktionen«, New England J. Med. 286,109(1972)].

Harrison u.a. berichteten ebenfalls, daß eine Schnellinfusion von stabilem Plasmaprotein, das nach obenerwähntem Verfahren (1) erhalten worden war, beim Patienten eine Drucksenkung auslöste. [G.A. Harrison, M. Robinson, R.V. Stacey, CH. M c C u 11 ο c h, T.A.T ο r d a und J.S. W r i g h l, »Hypotensive Effects of Stable Plasma Protein Solution, — a Preliminary Communication« Medical J. Australia 1040 Vol. 2 [1971]; G.A. Harrison, T.A. Torda und P. Schiff, »Hypotensive Effects of Stable Plasma Protein Solution, a Preliminary Communication« Medical J. Australia 1308 Vol.2[1971].)

Zur Zeit ist die klinische Anwendung des nach obenerwähntem Verfahren (i) erhaltenen stabilen Plasmaproteins allein auf die intravenöse TroDfinfusion beschränkt, da bei der Schnellinfusion beim Patienten die Gefahr einer Hypotension besteht. Der rasche Forlschritt in der operativen Praxis macht jedoch eine .Schnellinfusion von stabilem Plasmaprotein in zunehmendem Maße notwendig.

Die Erfinder haben daher die Möglichkeiten zur Ausschaltung der hypotensiven Wirkung der bei den nach den obenerwähnten Verfahren (1) und (2) erhaltenen stabilen Plasmaproteinlösungen untersucht und dabei festgestellt, daß als hypotensive Substanz ein Peptid mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10 000 in Frage kommt, das als Nebenprodukt bei der Erwärmung auf 56 bis 6O⁰C im Rahmen der bekannten Verfahren gebildet wird. Dieses hypotensiv wirksame Peptid besitzt auch eine Kontraktionswirkung gegenüber der glatten Muskulatur; es wird jedoch durch die Wirkung von Carboxypeptidase B inaktiviert.

Es wurde nun gefunden, daß dieses hypotensive Peptid vom stabilen Plasmaprotein durch Gelfiltrationsoder Ulirafillraiionsverfahren abgetrennt werden kann, wobei die Tatsache ausgenutzt wird, daß das Molekulargewicht des Peptids geringer ist als dasjenige des stabilen Plasmaproteins. Darüber hinaus wurde als Ergebnis einer Untersuchung der Adsorptionseigenschaften des besagten hypotensiven Peptids an allen Arten von Adorptionsmitteln gefunden, das dieses Peptid von Kationenaustauschern und anorganischen Adsorbentien adsorbiert wird, während das stabile Plasmaprotein, ohne an diesen Adsorptionsmitteln absorbiert zu werden, gewonnen wird.

Wenn dieses als Nebenprodukt nach lOstündiger Erwärmung von stabilem Plasmaprotein gemäß Verfahren (1) auf 6O⁰C gebildete hypotensive Peptid nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entfernt worden ist, wird es nicht mehr gebildet, selbst wenn die Wärmebehandlung bei 6O⁰C nachfolgend fortgesetzt wird.

Darüber hinaus wird das hypotensive Peptid ebenfalls nicht mehr gebildet, selbst wenn das stabile Plasmaprotein einer lOstündigen Erwärmung auf 6O⁰C zur Inaktivierung von Hepatitisviren unterworfen wird, nachdem das hypotensive Peptid durch das erfindungsgemäße Verfahren von dem nach Verfahren (2) erzeugten stabilen Plasmaprotein entfernt worden ist (siehe F i g. 2c).

Gegenstand der Erfindung ist das nach dem Anspruch charakterisierte Verfahren. Es basiert auf der Feststellung, daß stabiles Plasmaprotein, das keinerlei depressive Wirkung zeigt und für die Schnellinfusion verwendet werden kann, aus menschlichem Blut und Placentaextrakt herstellbar ist. Das heißt, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein stabiles Plasmaprotein ohne depressive Wirkung durch Abtrennung von hypotensiver peptidischer Substanz mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10 000 von dem Protein erhalten, das durch Fraktionierung von menschlichem Blut oder Placenta und Erwärmung auf 57 bis 6O⁰C während oder nach der Fraktionierung erhalten wurde und laut e[ektrophoretischem Befund im wesentlichen aus Albumin besteht.

Das das stabile Plasmaprotein, das gemäß der Erfindung erzeugt wird, keinerlei hypotensives Peptid enthält, besteht keine Gefahr einer Blutdrucksenkung beim Patienten, selbst wenn nicht nur eine intravenöse Tropfinfusion sondern eine Schnellinfusion vorgenommen wird. Damit wird der klinische Anwendungsbereich bedeutend erweitert. Ferner kommen als Materialien für die Gewinnung des stabilen Plasmaproteins gemäß der Erfindung nicht nur reines Plasma, sondern auch Plasma- oder Placentaextrakte in Betracht, die eine

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große Menge Hämoglobin enthalten, was einen erheblichen wirtschaftlichen Gewinn bedeutet.

Das Verfahren zur Abtrennung des gemäß der Erfindung zu verwendenden Plasmaproteins vom Blut erfolgt nach dem obenerwähnten abgewandelten Verfahren der Plasmaproteinfraktionierung nach Co h η (6. Verfahren; ein Verfahren, bei dem Zinkionen bei einem Tieftemperaturäthanolfraktionierungsvcrfahren eingeführt werden, siehe Daglas M. Sarge η er u. a.: Vox. Sunginis, Bd. 5 [1960] S. 272) oder nach einem Verfahren, bei dem die lonenstärke des Plasmas durch ein lonenaustauscherharz erniedrigt wird zur Entfernung von instabilem Globulin als Niederschlag (siehe Hans N ich man u.a. Vox. Sunginis, Bd. 3 [1956] S. 184).

Zur Erzielung von Plasmaprotein aus Plasma- oder Placentaextrakten mit einem hohen Hämoglobingehall kann das oben beschriebene Verfahren (japanische Pa tent Publikation Nr. 16 041/68) angewandt werden.

Bei einem konkreten Beispiel für das Verfahren zur Erzielung von Plasmaprotcin aus Placenta wird wie folgt vorgegangen:

Eine auf niedrige Temperatur eingefrorene Placenta wird mit einer Eisquetschc grob zerquetscht und weiter mit einem Fleischschneider geschnitzelt. Zu 100 Gewichlsteilen dieser zerschnitzelten Placenta werden 200 ml 1%ige Salzlösung hinzugefügt, die Blutanteile durch 30 Minuten lange Extraktion extrahiert und die überstehende Flüssigkeit (P'acentaextrakt) durch Zentrifugieren abgesondert. Zu dem erhaltenen Placentaextrakt wird Ammoniumsulfat in einer Menge hinzugegeben, die innerhalb eines Bereichs frei wählbar ist, der zu einer Konzentration von 35 bis 40% (nach der Zugabe) führt und der erzeugte Niederschlag abgetrennt.

Wenn irgendeine Vorrichtung zur Verfügung steht, mit welcher der Placentaextrakt bei einer ausreichend niedrigen Temperatur gehalten werden kann, ist es alternativ möglich, den Placentaextrakt mit Äthanol in solchen Mengen zu versetzen, daß 25 Gewichtsicilc pro 100 Gewichtsteile Placentaextrakt enthalten sind und den erzeugten Niederschlag abzutrennen.

Der Hauptteil des Hämoglobins bleibt in der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit. Diese kann der nachfolgenden Behandlung, d.h. einer Behandlung mit organischer Säure unterworfen werden, vorzuziehen für die nachfolgende Behandlung ist jedoch eine Zugabe von Ammoniumsulfat zu dieser Lösung und Aufsammlung einer rohen Albuminfraktion als Niederschlag, da die Proteinkonzentration der überstehenden Flüssigkeit gering ist.

Der durch Filtrieren erhaltene Niederschlag wird durch Zugabe von Wasser (3 bis 4 1 zu ] kg Niederschlag) gelöst. Fxistenz und Menge des in der rohen Albuminfraktion enthaltenen Ammoniumsulfats hai keinerlei Einfluß auf das Ergebnis der danach auszuführenden Behandlung mit organischer Säure. Eine das brauchbare· Prolein enthaltende Lösung wird durch Zugabe einer organischen Säure zu der obenerwähnten Albtiminlösung zur Ausfällung und Abtrennung des I liimojilobins durch Filtrieren erhallen. )e mehr organische Säure zugegeben wird, um so mehr Hämoglobin fälll aus und die Absonderung des brauchbaren Protein·- wird besser, jedoch führt jede übermäßige Zugabe /u einer Abnahme tier Ausheule iin stabilem Plasmaproieiii durch Milfällung von Albumin bei der nachfolgenden Wärmebehandlung, und daher isl es günstig, die organische Säure in einer solchen Menge /u/iiL'cben. daß ihre l.mlkon/.enlnilion in besagter Lösung 2 bis 6% ausmacht.

Die Einstellung des pH-Wertes ist ein wirksames Mittel zur vollständigen Abtrennung von Hämoglobin. Die Hämoglobinmcnge in der überstehenden Flüssigkeit nimmt merklich ab, wenn der pH-Wert von neutral auf 5,5 gesenkt wird und das Hämoglobin fällt bei einem pH-Wert von 4,3 vollständig aus. Im allgemeinen ist es jedoch günstig, den pH-Wert innerhalb eines Bereichs von 4,5 bis 5,5 einzustellen, da bei weiterer Absenkung des pH-Wertes die Albuminausbcute abnimmt. Die Flüssigkeit wird allmählich erwärmt. Globulin, das wärmeinstabil ist, beginnt bei 50"C oder darüber auszufallen. Die Temperatur der Lösung wird für eine gewisse Zeitdauer bei 57 bis 60⁰C gehalten. Eine 1 bis 2 Minuten lange Erwärmung auf 60"C isl für die Ausfällung von instabilem Globulin ausreichend, jedoch ist eine 15 bis 30 Minuten lange Wärmeeinwirkung zur Erlangung der Verläßlichkeit der Verfahrensweise günstiger, da das stabile Plasmaprotein wie Albumin stabil ist.

Besagte Flüssigkeit wird nach der Wärmebehandlung auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die durch Abtrennung des nach dem Abkühlen erhaltenen Niederschlags durch Filtrieren erhaltene Flüssigkeit enthält kein Hämoglobin mehr, und es werden 520 g Ammoniumsulfat pro 1 1 Flüssigkeit zur vollständigen Ausfällung von Protein hinzugegeben. Der Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und durch Dialyse in kaltem Wasser in einem Ccllophanrohr von Ammoniumsulfat und organischer Säure befreit.

Auf diese Weise wird die stabile Plasmaproteinlösung erhalten. Die Proteinkonzenlration dieser Lösung liegt bei 5,0 bis 6,5 Gew.-%. Die Lösung wird dann durch eine mit einem Ionenaustauscher oder anorganischen Adsorptionsmitteln gepackte Säule geschickt zur Adsorption der hypotensiven Substanz, die alternativ durch Gclfiltralions- oder Ultrafiltrationsverfahren abgctrcnnl werden kann, und das stabile Plasmaprotcin wird frei von der hypotensiven Substanz erhalten.

Als gemäß der Erfindung zu verwendende Ionenaustauscher werden »kationische Ionenaustauscherharze« verwendet, die allgemein in Gebrauch sind, wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, hydrophile unlösliche Kationenaustauscher aus vernetztem Dextran, und schwach sauren Kationenaustauscher. Als anorganische Adsorptionsmittel sind z. B. Silicagcl oder Aluminiumoxidgcl günstig.

Was die Bedingungen für die Adsorption der innerhalb des stabilen Plasmaproteins enthaltenen hypotensiven Substanz durch die obenerwähnten Ionenaustauscherharze oder anorganischen Adsorptionsmittel betrifft, so ist es günstig, einen Ionenaustauscher oder ein anorganisches Adsorptionsmitlel in eine Säule zu füllen, die zunächst mil 0,25%iger Natriumchloridlösung cquilibricrt und nachfolgend mil besagter Plasmaproteinlösung mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 bis 150 ml/Stcl/cm² beschick! wird. Als Temperatur sind 4 bis 6''C günstig.

Die Gelfiltration erfolgt beim cri'indungsgemäßeii Verfahren nach der allgemein angewandten Verfahrensweise. Beispiele für konkrete Verfahren werden in den nachfolgenden l.ileralurslcllcn angegeben.

1) |.R. W h i ι a k e r »Bestimmung der Molekulargewichte von Proteinen durch Gelfiltration an Sephadcx«, Anal. Chcm. 35(1963) 1950- 1953,

2) P. Andrews »Ermittlung der Molekulargewichte von Proleinen durch Scphadcx-Gclfiltration« Bio ehem. 1.41(1964)222-213,

3) T.C. Laurent,]. Killander »Eine Theorie der Gelfiltration und ihre experimentelle Nachprüfung« J.Chromatog. 14(1964)317-330,

4) P.R. Carnegie »Abschätzung der Molekülgröße von Peptid durch Gelfiltration«, Biochem. J. 95 (1965)9 P.

Die Ultrafiltration erfolgt im Rahmen der Erfindung unter den in den nachfolgenden Literatursiellen angegebenen Verfahrensbedingungen: κι

1) H.). Bixler, R.W. Haussl ein, LM. N eise η »Trennung und Reinigung von biologischen Materialien durch Ultrafiltration« May, 1969, Nat. Meeting. Am. Inst, of Chem. Eng. Cleveland,

2) CJ. Van Oss., P.M. Bronson »Entfernung von IgM von Serum durch Ultrafiltration«, Anal. Biochem., 36 (1970) 464,

D. Baoutin, J. Brodeur »Ultrafiltration von Humanserum; Beweis für neidermolekulare Cholinesterase-Aktivität«, Rev. Can. Biol. 29(2), 187 (Jun. 1970).

I¹J

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Zu dem so erhaltenen von hypotensiver Substanz freien stabilen Plasmaprotein werden Stabilisatoren wie N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat hinzugegeben, so daß die Konzentration besagter Lösung bei 0,0032 bis 0,0046 M liegt, und es wird 10,5 bis 14,5 Stunden lang auf 59 bis 61 °C erwärmt.

Die Messung der depressiven Wirkung erfolgt im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen an einem Hund. Das heißt, ein männlicher angewachsener Hund einer Mischrasse von etwa 8 kg Körpergewicht wurde nach Anästhesierung mit Urethan am Rücken festgebunden und eine Kanüle in die linke Arteria corotis eingeführt und der Carotidarteriendruck mit einem Schreibgerät (polygraph transducer) aufgezeichnet. Die zu prüfende Substanz wurde über ein an der rechten Oberschenkelvene befestigtes Katheter verabreicht. Die Drucksenkung wurde nach folgender Gleichung aus dem mittleren Blutdruck bei dem Minimalpunkt, der bei Absenkung durch Verabreichung der zu untersuchenden Substanz beobachtet wurde sowie aus dem mittleren Blutdruck vor der Verabreichung (der als Standard betrachtet wurde) erhalten.

Drucksenkung (%) = —

mittlerer Blutdruck mittlerer Blutdruck

vor Verabreichung der Probe — nach Verabreichung der Probe

mittlerer Blutdruck vor Verabreichung der Probe

100.

Die Messung der Kontraktionswirkung an der glatten Muskulatur am Uterus der Ratte erfolgte nach der Magnus-Technik jnter Verwendung des Uterus von virginalen Ratten der Wistar-Rasse. Ratten von 150 g Körpergewicht wurden inlraperitoneal 5 mg Diöstradiol 18 Stunden vor Entfernung des Uterus injiziert, und nach 18 Stunden wurden die Ratten durch Decapitation getötet und ausbluten gelassen zur Entfernung des Uterus.

Als Nährlösung diente mit Luft gesättigte de Jalon-Lösung mit 0,1 mg% Atropinsulfat. Das Volumen der Nährlösung im Organbad lag bei 8,6 ml, das Volumen der Probelösung bei 0,4 ml und die Reaktionsdauer betrug 90 Sekunden.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine stabile Plasmaproteinfraktion wurde aus 1001 menschlichem Plasma nach dem modifizierten Verfahren von Cohn zur Plasmaproteinfraktionierung (6. Verfahren; siehe japanische Patentpublikation Nr. 5297/60) gewonnen; Das Plasma wurde auf pH 7,2 eingestellt und mit 53,3% kaltem Äthanol versetzt, so daß die Endkonzentration bei 8% lag und dann zur Entfernung von Fibrinogen bei --2⁰C zentrifugiert. Zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde so viel kalter Äthanol hinzugegeben, daß die Endkonzentration bei 21% lag, der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt und die Temperatur der Lösung allmählich auf —6°C

jo gesenkt; dann wurde zur Entfernung von y-Globulin zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wurde einer kalter Äthanoibehandlung unter Bedingungen wie 25°/c Äthanolkonzentration, pH 4,7, Ionenstärke 0,1 unc

-6°C Temperatur unterworfen, wobei eine aus Albumin, «-Globulin und jS-Globulin bestehende Mi schung ausfiel und gewonnen wurde. Diese stabile Plasmaproteinfraktion wurde anschließend lyophilisieri bzw. gefriergetrocknet, wobei 3,2 kg trockenes Portein

pulver erhalten wurden. Dieses trockene Pulver wurde in destilliertem Wasser gelöst unter Bildung eine: 5%igen Proteinlösung, zu der N-Acelyltryptophari unc Natriumcaprylat als Stabilisatoren in Mengen zugege ben wurden, daß die Endkonzentration bei 0,04 M lag

dann wurde die Lösung 10 Stunden lang bei 6O⁰C wärmebehandelt.

Die wärmebehandelte Plasmaproteinlösung wurdi erfindungsgemäß durch eine Silicagel-Säule geschick unter Gewinnung einer nichtadsorbierten Fraktioi

(Plasmaproteinfraktion). Die hypotensive Substan; wurde an der Silicagel-Säule adsorbiert und dadurcl entfernt. In der nichtadsorbierten.Fraktion wurden etwi 95% des stabilen Plasmaproteins gesammelt. Di( experimentellen Daten sind in Tabelle 1 und in dci

Fi g. la bis Ic wiedergegeben.

Tabelle 1

Ausbeute an stabilem Plasmaprotein vor und nach der Silicagel-Behandlung; Prüfung der drucksenkender Wirkung beim Hund und der Kontraktionswirkung bei der glätten Muskulatur am Rattenuterus.

Gruppe
Nr.

OD

I'rotcinausbcute

Drucksenkung beim
Mund

Kontraklionswirkung beim Rattcnutcrus

Stabile Plusmuprotcinlösung vor
Behandlung mit der Silicagcl-Süulc
Stabile PUismaprotcinlösung nach
Behandlung mil eier Siliaißcl-Säulc

1	30,5	(100%)
2	31,2	(100%)
1	30,0	95,0%
2	30,5	93,5

-W-
-Hl-

Die elektrophoretisch^ Analyse der Preoteinzusaminensetzung des stabilen Plasmaproteins ergab 88,5% Albumin, 7,5% «-Globulin und 4,0% jS-Globulin.

Die erzeugte 5%ige Lösung von stabilem Plasmaprotein kann als stabiles Plasmaprotein-Produkt verwendet werden, das keinerlei depressive Wirkung besitzt und für die Schnellinfusion brauchbar ist.

Beispiel 2

Das nach dem modifizierten Verfahren von Cohn zur Plasmaproteinfraktionierung (6. Verfahren) aus menschlichem Plasma, wie in Beispiel 1 beschrieben, erzeugte

10

stabile Plasmaproteinpulver wurde in destilliertem Wasser gelöst zur Erzeugung einer 5%igen Proteinlösung, zu der N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat in solchen Mengen hinzugegeben wurden, daß die Fndkonzentration bei 0,04 Μ lag. Die Lösung wurde dann 10 Stunden lang bei 60°C wärmebehandelt. Die erwärmte Plasmaproteinlösung wurde durch Ultrafiltrationsmethoden unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran filtriert. Das hypotensive Peptid wurde dabei abfiltriert und vom Plasmaprotein getrennt.

Experimentelle Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Depressive Wirksamkeit und Kontraktionswirkung auf die glatte Muskulatur von stabiler

Plasmaproteinlösung vor und nach der Ultrafiltration.

	Gruppe	Protein	Druck	Kontraktions
	Nr.	ausbeute	senkung beim	wirkung bei
			Hund	der glatten
				Muskulatur
				der Ratte
Stabile Plasmaproteinlösung	3	100%	-H-	-Hf
vor der Ultrafiltration	4	100%	-H-	•ttf
Stabile Plasmaproteinlösung nach	3	99,4%	-	-
der Ultrafiltration	4	98,9%	-	-

Die durch Ultrafiltration von hypotensivem Peptid befreite Plasmaproteinlösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 5% eingestellt und mit N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat derart versetzt, daß die Endkonzentration bei 0,04 M lag, und es wurde so ein stabiles Plasmaproteinprodukt erhalten, das frei von jeglicher hypotensiven Substanz und für Schnellinfusionen verwendbar war.

B e i s ρ i e 1 3

Unmittelbar nach Erhalt eingefrorene und frischhaltend gelagerte Placenta wurde fein zerquetscht, und zu 20 kg Placenta wurden 401 l%ige Natriumchloridlösung hinzugegeben zur Extraktion der Blutkompontnten; eine y-Globulin enthaltende Fraktion wurde ausgefällt und vom Extrakt abgetrennt. Zur überstehenden Flüssigkeit wurde so viel Buttersäure hinzugegeben, daß die Endkonzentration bei 2 bis 6% lag, und der pH-Wert der behandelten Lösung wurde auf 4,5 bis 5,5 eingestellt, die Mischung 1 bis 2 Stunden lang auf 57 bis 60°C erwärmt und der gebildete Niederschlag abge-

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f. ennt.

Zu der nach Zentrifugieren erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde zur Ausfällung des gesamten Proteins so viel Ammoniumsulfat hinzugegeben, daß die Konzentration 75% ausmachte. Die erhaltene Plasmaproteinpaste oder -masse wurde in ein Dailyserohr überführt und bei 4° C 24 Stunden lang gegen fließendes Wasser dialysiert (bis zu diesem Schritt ist die Behandlung die gleiche wie bei dem Verfahren nach der japanischen Patentpublikation Nr. 16 041/68).

Die auf pH 7,0 eingestellte Plasmaproteinlösung wurde in eine mit Carboxymethyl-Sephadex® gepackte Säule gegeben, die mit einer Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,1 M enthaltenden 0,05 M Phosphatpufferlösung von pH 6,8 bis 7,0 ins Gleichgewicht gesetzt worden war; die Säule wurde mit obigem Puffer gewaschen und der eluierte Proteinanteil gesammelt. Etwa 90% des in die Säule gegebenen Plasmaproteins wurden wiedergewonnen und das hypotensive Peptid an der Säule adsorbiert und entfernt.

Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 3 und den F i g. 2a bis 2d wiedergegeben.

Tabelle 3

Ausbeute an stabilem Plasmaprotein; beim Hund beobachtete Depressionswirkung und Kontraktionswirkung

auf die glatte Muskulatur beim Rattenutcrus vor und nach Behandlung mit der Carboxymcthyl-Sephadex-Süule.

	Gruppe	O'hw	l'rotein-	Druck	Konlruktions-
	Nr.		uusbcutc	senkung beim	wirkung beim
				Hund	Ratlenuterus
Stabiles Plasmaprotein vor	5	32,8	(100%)	lh	Ht-
Behandlung mit Carboxymethyl-	6	36,7	(100%)	fr	-III-
Sephadex
Stabiles Plusmuprotcin nach	5	32,0	91,0%	-	-
Behandlung mit Carboxymethyl-	6	35,2	89,5%	-	-
Snnhiwinv

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Das mit Carboxymethyl-Sephadex behandelte stabile Plasmaprotein wurde auf 5%ige Proteinkonzentration in einer Lösung eingestellt, zu der N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat in solchen Mengen zugegeben wurden, daß die Endkonzentration bei 0,04 M lag. Diese Mischung wurde 10 Stunden lang auf 60°C erwärmt und ein vom jeglichen hypotensiven Peptid freies stabiles Plasmaprotein erhalten, das für die Schnellinfusion brauchbar war. Das so gewonnene stabile Plasmaprotein bestand zu 95% aus Albumin, α-Globulin und ^-Globulin bei 5%iger Proteinkonzentration.

Die Ausbeute pro 1 Placenta betrug 2,2 g.

Beispiel 4

Unmittelbar nach Erhalt eingefrorene und frischgehaltene Placenta wurde in gleicher Weise wie in Beispiel

3 fraktioniert, d. h. durch Zugabe von Buttersäure und Erwärmung auf 57 bis 60° C und die durch Dialyse der zentrifugierten überstehenden Flüssigkeit erhaltene Plasmaproteinlösung wurde der Gelfiltration unter j Verwendung einer Sephadex-G-50®-Säule unterworfen. Das Plasmaprotein wurde in eine hochmolekulare Fraktion und eine hypotensive Substanz in einer Fraktion mit geringerem Molekulargewicht fraktioniert (siehe F i g. 3).

κι Das erhaltene stabile Plasmaprotein wurde auf eine 5%ige Proteinkonzentration in der Lösung eingestellt, zu der N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat in Mengen zugegeben wurden, daß die Endkonzentration bei 0,04 M lag. Die Mischung wurde 10 Stunden lang auf

1-3 60°C erwärmt und ein von jeglichem hypotensiven Peptid freies stabiles Plasmaprotein erhalten, das für die Schnellinfusion brauchbar war.

Hierzu 10 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung eines von hypotensiver Substanz freien stabilen Plasmaproteins, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem stabilen ϊ Plasmaprotein mit depressiver Wirkung, das elektrophoretisch im wesentlichen aus einer Albuminfraktion besteht und aus menschlichem Blut oder Placenta gewonnen und während der Gewinnung einer Wärmebehandlung bei 57 bis 60⁰C unterwor- in fen worden ist, peptidische Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10 000 durch Ultrafiltration oder Gelfiltration oder durch Adsorptionen Kationenaustauscherharze, Silicagel oder Aluminiumoxidgel, abtrennt. r>