DE2300056A1

DE2300056A1 - Verfahren zur gewinnung von pyridin2,6-dicarbonsaeure auf fermentativem wege

Info

Publication number: DE2300056A1
Application number: DE19732300056
Authority: DE
Inventors: Albert Killinger; Guenter Dipl Chem Dr Peschke
Original assignee: Kali Chemie Pharma GmbH
Current assignee: Abbott Products GmbH
Priority date: 1973-01-02
Filing date: 1973-01-02
Publication date: 1974-07-04

Description

Verfahren zur Gewinnung von Pyridin-2,6-dioarbonsäure auf fermentativem Wege Es ist Seit langem bekannt, daß Pyridin-2,6-dicarbonsäure - im folgenden PdC genannt - Bestandteil der Wand von Dakteriensporen ist (Biochem. J. 54, 210), chne daß bisher versucht worden wäre, dieses Vorkommen für die technische Gewinnung von PdC auszunutzen. Der beträchtliche Zeit- und Apparateaufwand bei relativ geringer Ausbeute machten bisher ein Vergfahren auf fermentativem Wege unwirtschaftlich.
Es wurde nun gefunden, daß eine wirtschaftliche Gewinnung von Pyridin-2,6-dicarbonsäure auf fermentativem Wege möglich ist, wenn als Bacillus Bacillus subtilis N 26 ATCC 21355 für die Kultivierung verwandt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren zur nnung von Pyridin-2,6-dicarbonsäure auf fermentativem Wege durch submerse Kultivierung von Bscillusstämmen, bis das Wachstum beendet und die Zellen zu Sporen geworden sind, ist dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus subtilis N 26 ATCC 21855 in einer Nährlösung submers kultiviert und aus den von der Nährlösung abgetremmten Sporen die Pyridindicarbonsäure isoliert wird.
Bei zahlriechen Versuchen mit verschiedenen Bacillusstämmen zeigte sich, daß Bacillus subtilis N 26 ATCC unter wint@ schaftlichen Bedingungen eine sehr günstige Ausbeute an PdC ergibt. Tabelle 1 zeigt die Ergeonisse mit einer kleinen Auswahl verschiedener Bacillusstämme, die zum Teil in der iterat a's gute PdC-Bildner beschriebcn sind, in Vergleich m.it Bacillus subtilis N 26 ATCC 21855.

Tab. 1 Eignung verschiedener Bacillus-Stämme zur fermentativen Gewinnung von Pyridin-2,6-dicarbonsäure

Bac. subtilis Bac. subtilis Bac. pumilis Bac. megater. Bac. megater.

ATCC 13956 N 26 ATCC 2@855 ATCC 19546 ATCC 7051 DP I

PdC

µg/ml 40 202,6 41,7 170,3 1@7,8

TRGW *

mg/ml 0,54 2,24 1,15 1,75 1,71

%PdC/

TRGW 7,4 9,06 3,98 9,73 9,82

Modium : 1 % Maisstärke - 1% Hefoextrakt - Salzbase -Anzucht : 96 Std. bei 37° C im Schüttelinkubator "TRGW: Trockengewicht ATCC 21855 Bei Bacillus subtilis N 26 /handelt es sich um eine Aminosäurenauxotrophe Mutante, die durch Behandlung des Mutterstammes mit N-Methyl-N'-nitroso-N' -nitroguranidin nach herkömmlichen Methoden hergestellt wurde. Der Mutterstamm wurde nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7. Ausgabe, 1957 Baltimore) als zu Bacillus subtilis gehörend bestimmt.

Das Vergfahren wird durchgeführt, indem man Bacillus subtilis ATCC 21855 N 26/submers in einer geeigneten Nährlösung unter Belüften und Rühren in einem geeigneten Fermenter kultiviert, bis der PdC-Gchalt der Nänr"lösung sein Maximum erreicht hat. Die Temperatur kann zwischen 30 und 450 C liegen, vorzugsweise bei 35 bis 380 C. Der PH-Wert der Nährlösung kann zwischen 6 und 9 liegen, vorzugsweise bei PH7 bis 9. Nach Beendigung der Bildung der Sporen werden diese von der Nährlösung abgetrennt und auf bekannte Weise auf PdC aufgearbeitet. Devorzugt wird das in der DOS 2 222 597 beschriebene Verfahren zur Isolierung der PdC angewandt, wobei die PdC durch Erhitzen der wasserfreien Sporenmasse mit Alkohol in Gegenwart von Säure als Pyridin-2,6-dicarbonsäureester in Lösung gebracht wird, der entstandene Diester nach Abfiltrieren der Sporenmasse isoliert und anschließend in bekannter Weise hydrolysiert wird.
Zur analytischen Bestimmung der PdC, bezogen auf Fernentevolumen, wird ein aliquoter Teil der Kulturlösung zetrifugiert und in einer bestimmten Menge Wasser (PH 7) aufgenommen. Diese Suspension wird eine Stunde bei 121 C im Autoklaven behandelt, wodurch die PdC in Lösung geht; dann wird erneut zentrifugiert. Die PdC kann dann quantitativ im Überstand nach der Methode von Jansser. et al. (Science 127, 26) oder aber dünnschichtchromatographisch bestimmt werden, indem man 1 bis 10'Fl Lösung auf eine Kieselgelplatte aufträgt, mit Methanol - 5 n NH3 (80 + 20) entwickelt, den PdC-Flecken mit Wasser eluiert und die Extinktion des Eluats bei 273 nm mißt. Die dem Meßwert entsprechende Menge PdC wird einer Eichkurve entnomnen. Die in den folgenden Tabellen angegebenen Werte wurden nach dieser Methode bestimmt. Sie stellen nur. Vergleichswerte dar, denn bei späteren Arbeiten wurde gefunden, daß, wenn die Suspension der Trockensubstanz bei ph 12 im Autoklaven behandelt wird, ca. 20 bis 50 5S mehr PdC in Lösung gehen.
Als Kohlenstoffquelle in der Nährlösung kommen u.a. in Frage: Monosaccharide wie Glucose, Galactose, Xylose; Disaccharide wie Saccharose, Lactose, Maltose; Tri- und Polysaccharide wie Raffinose, Dextrin, Stärke.
Daneben sind alle anderen Kohlenstoffquellen geeignet, die ein Wachstum und Versporen von Bacillus subtilis N 26 itTCC'21855 ermöglichen.
Versuche mit verschiedenen Nährmedien haben ergeben, daß Stärke sowohl bezüglich der Ausbeute als auch der Wirtschaftlichkeit die günstigste Kohlenstoffquelle ist, wie aus Tabelle 2 hervorgeht.

Der Einfiuß der C-Quelle auf die PdC-Bildung durch Bacillus subtilis N 26 ATCC 21855.

C-Quelle PdC TRGW % PdC/TRGW

1 % µg/ml mg/ml

Stärke 179,5 2,20 8,16

Maltose 117,0 1,88 6,23

Glueose 105,2 1,67 6,30

Dextrin 113,6 2,37 4,88

Molke 74,3 1,66 4,47

Laetose 92,7 1,66 5,59

Galactose 75,2 1,64 4,58

Sa@charos@ 131,9 2,85 4,63

Raffinose 110,2 1,59 6,95

Xylose 74,8 1,44 5,20

Medi@m: 1 % C-Quelle + 1 % Pepton + Salzbase.

Anzucht: 96 Std. bei 37° C im Schüttelinkuhator Als Stickstoffquellen lommen u.a. in Frage Caseinpepton, Casein, Caseinhydrolysat, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Sojapuder, Sojapepton, Maisquellwasser und alle anderen stielstoffhaltigen Substanzen, die das Wachstum und die Vorsprung von Bacillus subtilis N 26 ATCC 21855 ermöglichen Wie Tabelle 3 zeigt, sind Casein und Caseinderivate die günstigsten Stickstoffquellen.
Bei Verwendung einer anderen Stickstoffquelle als Casein ist es empfehlenswert, noch Caseinhydrolysat oder die darin enthaltenen Aminosäuren, vorzugsweise Lysin und/oder Leucin und/oder Valin, der Nährlösung zuzusetzen, damit der PdC-Gehalt der Sporen erhöht wird, wie aus den Tabellen 4 und 5 hervorgeht.

Der Einfluß der N-Quelle auf die PdC-Bildung durch Bacillus subtilis N. 26. ATCC 21855.

N-Quelle PdC TRGW % PdC/TRGW

1 % µg/ml mg/ml

Pepton 179,5 2,20 8,15

Maisquellwasser 74,3 2,16 3,44

@efeextra@t 129,4 2,37 5,55

Sojapuder * 148,7

Fleischextrakt 145,2 1,96 7,42

Casein * 263,9

Cascinhydrolysat 237,2 2,30 10,3

Sojapepton 214,6 2,12 10,1

Medium: 1 % Stärke + 1 % N-Quelle + Salzbase Anzucht: 96 Std. bei 37° C im Schüttelinkubator * Da sich diese @-Quellen aicht klar in Wasser lösen, wurden keine Trockengewichtsbestimmungen durchgeführt.

Tab. 4 Der Einfluß von Aminosäuren auf die PdC-Bildung durch Baeillus subtilis N 26 ATCC 21855.

Zusatz PdC TRGW % PdC/TRGW

µg/ml mg/ml

ohne 153,7 2,02 7,60

Valin 187,9 2,19 8,57

Lysin 187,0 2,05 9,12

Glutaminsäure 168,7 2,26 7,45

Leucin 182,9 2,26 8,10

Medium: 1 % Stärke + 1 % Pepton + 0,1 % Zusatz + Salzbase Anzucht: 96 Std. bei 37° C im. Schüttelinkubator Tab. 5 Der Einfluß steigender Mengen Bacto-Casamino Acid auf die PdC-Bildung durch Bac llus subtilis N 26 ATCC 21855

PdC TRGW

N-Quelle % PdC/TRGW

µg/ml mg/ml

Hefe extrakt

1 % 98,6 1,83 5,28

Hefeextrakt 1 %

+ 0,1 % Casamino Acids 106,0 1,68 6,30

Hefeextrakt 1 %

+ 0,5 % Casamino Acids 137,7 1,71 8,05

Hefeextrakt 1 % @@@@@ @@@ @@@

+ 1 % Casamino Acids 180,4 2,22 8,1

1 % Casamino Acids 295,6 2,64 11,2

Medium: 1% Stärke + N-Quelle + Salzbase Anzucht: 48 Std. bei 37° C im Schüttelinkubator Caseinhydrolysat der Difco Laboratories Inc., Detroit, USA An anorganischen Nährsalzen haben sich in den Versuchen folgende bewahrt.

Na2HP04 2 H20 0;3 % der Nährlösung (Gewicht/Volumen) KH2PO4 0,3% NaCl 0,3 % 1: MgCl2 . 6 H20 0,01 % ii II Na2SO4 0,011 %" MnCl2 . 4 H20 0,001 % CaCl2 . 2 H20 0,02 ' " " Diese Mischung wird im Folgenden Salzbase genannt; sie hat sich in den Versuchen als geeignet erwiesen. Es ist natürlich möglich, ihre qualitative und quantitative Zusammensetzung zu ändern.
Um die optimale Menge an Calciumionen zu ermitteln, wurden in der obigen Salzmischung die CaCl2-Gehalte variiert und der Einfluß auf die PdC-Bildung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt. Daraus ist zu entnehmen, daß zum optimalen Wachstum und zur Optimalen PdC-Saynthese etwa 0,01 bis 0,05 % Calciumchlorid entsprechend 27 bis 137 ppm Ca2+erforderlich sind.
Für eine maximale Ausbeute ist auch die Konzentration der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle von Bedeutung. Mit steigender Konzentration der C-Quelle nimmt bei gleichbleiDender Konzentration der N-Quelle zwar das Wachstum der Bakterien deutlich zu, nicht jedoch der relative PdC-Gehalt der Sporen, der erst mit steigender Konzentration der Stickstoffquelle zunimmt. Dies verdeutlicht die Bedeutung der Stickstoffquelle für den PdC-Gehalt der Sporen.

Tab. 6 Der Einfluß von Calciumionen auf die PdC Bildung durch Bacillus subtilis N 26 ATCC 2/855

%
CaCl2.2@2O 24 Std. 48 Std. 72 Std. 96 Std.
im Nährmedium
Zellahl PdC Zellzahl PdC Zellzahl PdC Zellzahl PdC
x 108/ml ug/ml x 108/ml ug/ml x 108/ml ug/ml x 108/ml ug/ml
ohne 20,4 - 12,5 108,5 10,3 87,7 10,4 78,5
0,001 22,3 - 14,9 121,9 15,3 101,0 11,6 93,6
0,01 28,9 - 24,1 237,2 22,8 192,9 14,9 160,4
0,05 19,2 - 18,3 194,6 19,4 150,3 15,1 162,0
0,1 17,5 - 13,6 140,3 17,8 128,6 18,4 112,8

Medium: 1 % Stärke + 1 % Pepton + Salzbase Anzucht: bei 37 °C im Schüttelinkubator.

Die Zeit, in der das Maximum an PdC gebildet wird, hängt außer von der Zusammensetzung der Nährlösung von dem verwendeten Kulturgefäß ab. Sie liegt im Durchschnitt zwischen 24 und 48 Stunden, wobei in der Regel bereits nach 24 Stunden eine optimale Ausbeute erzielt wird. Aus Tabelle 7 ist zu entnehmen, daß im Fermenter erheblich höhere Ausbeuten erzielt werden als im Schuttelkolben.
Die vorangegangenen Versuchsergebnisse zeigen, daß bei Ver-ATCC 21855 wendung von Bacillus subtilis N 26/in relativ Kurzer Zeit Sporen in einer solchen Anzahl und mit einem derart hohen Gehalt an PdC gebildet werden, daß de fermentative Geazinnung von PdC wirtschaftlich interessant wird. Außerdem hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß die PdC ohne weitere Reinigungsaktionen absolut isomerenfrei anfällt, was bei synthetischen Verfahren nicht der Fall ist.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens aber ist, daß es kontinuierlich durchgeführt werden kann.
Bei der kontinuierlichen Kultivierung von. Bacillus subtilis TCC 285 N 26 wird in den ersten Fermenter laufend frische Nährlösung eingeleitet, und die zellhaltige Kulturlösung wird in gleicher Menge wie' der Zufluß in einen zweiten Fermenter geleitet, in dem dann die Zellen PdC bilden und versporen. Um die zeitlichen Unterschiede zwischen der Generationszeit der vegetativen Zellen und der Sporulationsdauer auszugleichen, sollte der zweite Fermenter größer sein, mindestens doppelt so groß wie der erste. Noch günstiger ist es, dreistufig zu fermentieren, indem der überlauf des zweiten Fermenters in einen dritten Fermenter geleitet wird.
Tab. 7 Abhängigkeit der PdC-Bildung vom Kulturgefäß Schüttelkolben Fermenter nach Std.
100 ml 8 1 PdC µg/ml 164,5 248,8 24 TRGW mg/ml 4,07 3,76 So PdC/TRGW 4,04 6,63 PdC µg/ml 189,5 48 TRGW mg/ml- 2,68 unverändert %PdC/TRGW 7,07 Medium : 1 Vo Stärke + 1 % Pepton + Salzbase, pH 7,5 Anzucht: bei 370 C Zur Gewinnung der Sporen kann der Überlauf der letzten Fermenterstufe in einen geschlossenen selbstaustragenden Separator geleitet werden. Der überstand kann zur Bereitung frischer Nährlösung verwendet werden. In unseren ATCC 21855 Versuchen mit Bacillus subtilis N 26 Konnten wir keine signifikante Abnahme des \fachstums und insbesondere der Versporung feststellen, wenn zwei Teile Überstand mit einem Teil frischem iCasser gemischt und frische C- und N-Quelle und Calcium hinzugefügt wurden.
Die in Tabelle 8 zusammengestellten Vergleichsversuche zeigen deutlich die höheren Ausbeuten bei Anwendung der kontinuierlichen Kultur.
Tab. 8 Ausbeuten bei verschiedenen Fermentationsarten a) kontinuierliche Fermentation

Auslauf 2. Stufe Auslauf 3. Stufe Ausbeute 1)

2)

Durchlauf PdC TRGW PdC TRGW PdC

h-1 µg/ml mg/ml µg/ml mg/ml mg/STD/1

0,200 334 6,36 - - 66,8

0,280 258,2 6,46 300,4 5,92 84,11

b) Batch Fermentation nach 24 Std. 248,8 3,76 1,05 Kontinuierliche Fermentation : Volumenverhältnis der 1. : 2. : 3. Stufe = 1:2:2 Medium : 1 % Maisstärke + 1 % Hefeextrakt + Salzbase 1) bezogen auf ein Liter frische Nährlösung = ein Liter Auslauf = Gesamtausbeute 2) Durchlauf = Zulauf pro Fermentervolumen pro Zeit Beispiel 1 200 ml Standard-Bouillon-Medium (Oxoid) in 2 Erlènmeyerkolben werden mit Bacillus subtilis N 26 SeimpfQ und die Kulturen 16 Stunden im Horizontalschüttler bei 37? C inkubiert. Mit diesen Kulturen werden 8 1 Medium (2 ,G Maisstärke + 1 % Casein + Salzbase, PH 7,5) im Fermenter beimpft. Der Fermenter wird belüftet, gerührt und bei 370 C gehalten. Nach 48 Stunden sind in der Kultur 434,2 µg PdC/ml enthalten. Aus 8 1 Kultur können durch Zentrifugieren 51,8 g sporenhaltige Trockensubstanz gewonnen werden.
Die wasserfreie Sporenmasse wird mit 230 ml Äthanol -und 20 ml konzentrierter Schwefelsäure'versetzt und 1 Stunde unter Rühren zum Rückfluß erhitzt. Anschließend wird filtriert und das Filtrat auf etwa 100 ml eingeengt. Mit einer wäßrigen Aufschlämmung von Calciumcarbonat wird neutralisiert. Danach wird mit Benzol extrahiert, dieorganische Phase mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat geklärt und das Benzol im Rotationsverdampfer abdestilliert.
Der verbleibende kristallisierende Rückstand wird durch Kugelrohrdestillation bei reduziertem Druck gereinigt.
Erhalten werden 4,43 g Pyridin-2,6-dicarbonsäurediäthylester, aus dem durch Verseifung mit Kalilauge 3,32 g Pyridin-2,6-dicarbonsäure in reiner Form gewonnen werden.
Beispiel 2 tin 1 Liter Glasfermenter und ein 2 Liter Glasfermenter werden zu einer 2-stufigen Fermentereinheit verbunden dergestalt, daß der Auslauf des ersten Fermenters in den 2. Fermenter einläuft.
Der erste Fermenter wird mit Nährlösung (1% Stärke + 1 % Hefe- -extrakt + Salzbase, pH 7,5) gefüllt und mit Bacillus subtilis N 26 beimpft. Während der logarithmischen Wachstumsphase wird damit begonnen, mit Hilfe einer Pumpe frische sterile Nährlösung aus einem Vorratstank kontinuierlich in den ersten Fercenter mit einer Durchlaufrate von 0,2 h @ zu pumpen. Befindet sich die Kultur in beiden Fermentern im Gleichgewicht, können in 5 Std. aus einem Liter Auslauf der zweiten Stufe 6,36 g Trockensubstanz gewonnen werden, aus der, wie in Beispiel 1 beschrieben, 334 mg Pyridin-2,6-dicarbonsäure isoliert werden.
Beispiel 3 Ein 1 Liter Glasfermenter und zwei 2 Liter Glasfermenter werden zu einer 3-stufigen Fermentereinheit verbunden. Der 1. Fermenter wird mit Nährlösung gefüllt (1 c Stärke + 1 5'o Hefeextrakt + Salzbase, pH 7,5) und mit Bacillus subtilis N 26 beimpft. Während der logarithmischen Wachstumsphase wird damit begonnen, mit Hilfe einer Pumpe frische sterile' Nährlösung aus einem Vorratstank kontinuierlich in den ersten Fermenter mit einer Durchlaufrate von 0,28 h-1 zu pumpen. Befindet sich die Kultur in allen drei Fermentern im Gleichgewicht, können in 3,57 Std. aus einem Liter Auslauf des dritten Fermenters 5,92 g Trockensubstanz gewonnen werden, aus der, wie Beispiel 1 beschrieben, 300,4 mg Pyridin-2,6-dicarbonsäure isoliert werden.

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Pyridin-2,6-dicarbonsäure durch submerse Kultivierung von Bacillusstämmen bis das Wachstum beendet ist und die Zellen zu Sporen geworden sind, aus denen die Pyridin-2,6-dicarbonsäure gewonnen wird, dadurch gekennzeichnet, daß Bacillus subtilis N 26 ATCC 21855in einer Nährlösung summers kultiviert und aus den von der Nährlösung abgetrennten Sporen die Pyridin-2,6-dicarbonsäure isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Nährlösung Calciumionen, vorzugsweise 27 bis 137 ppm, zugesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation bei 30 bis 400 C, vorzugsweise bei 35 bis 380 C, und bei einem pH-Wert von 6bis 9, vorzugsweise bei pH 7-bis 8, durchgeführt wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als C-Quelle Stärke und als N-Quelle Casein oder Caseinhydrolysat verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung einer anderen Stickstoffquelle als Casein-oder Caseinhydrolysat zusätzlich eine Aminosäure, vorzugsweise Valin, Leucin oder Lysin, zugesetzt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5,dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung kontinuierlich durchgeführt wird, indem in die wachsende Bacilluskultur kontinuierlich frische Nährlösung geleitet und im gleichen Maße bakterienhaltige Kultur abgeleitet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6,dadurch gekennzeichnet, daß die kontinuierliche Kultivierung in mehreren, vorzugsweise in 2 Stufen geschieht, indem in dem ersten Fermenter zu der wachsenden Bacilluskultur kontinuierlich frische Nährlösung geleitet wird und im gleichen Maße bakterienhaltige Kultur vom ersten in den zweiten Fermenter und vom zweiten in den dritten und so weiter abgeleitet wird, wobei im zweiten und in den folgenden Fermentern die Sporen gebildet und aus dem Überlauf des letzten Fermenters geerntet werden, aus'denen die Pyridin-2, 6-dicarbonsäure isoliert wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7,dadurch gekennzeichnet, daß die Fermenterbrühe nach dem Ernten der Sporen zur Bereitung frischer Nährlösung benutzt wird.