DE2262501A1

DE2262501A1 - Neue antibiotica, ihre herstellung und ihre verwendung in wiederkaeuerfutter

Info

Publication number: DE2262501A1
Application number: DE2262501A
Authority: DE
Inventors: Robert L Hamill; Marvin Martin Hoehn
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1971-12-23
Filing date: 1972-12-20
Publication date: 1973-07-05
Also published as: NO138400C; DD111281A5; NL7217622A; EG11085A; FR2164792B1; IT1056029B; BE793177A; NO136981B; SE390540B; IE36990B1; AR202693A1; DD107072A5; GB1388878A; JPS4868795A; IL41021A; US3856940A; DK133622B; SE7608016L; CA1015297A; IL41021A0

Description

2252501

PATENTANWÄLTE
DR. I. MAAS *
DR. F. VgiTHENLEITNER
8 MÜNCHEN 40

SCHLEISSHEIMER STR. 299-TEL 3592201/205

X-3519 A

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A. Neue Antibiotica, ihre Herstellung und ihre Verwendung

in Wiederkäuerfutter

Die Erfindung bezieht sich auf neue Antibiotica und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Insbesondere betrifft die Verbindung neue saure stickstoffreie Antibiotica und deren Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze.

Die hierin beschriebenen Antibiotica werden willkürlich mit A28695A und A28695B bezeichnet. Sie werden zusammen mit anderen nichtidentifizierten antibiotischen Substanzen durch Züchten des Mikroorganismus Streptomyces albus NRRL 3883 in einem wässrigen Nährkulturmedium unter submersaeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer beträchtlichen Konzentration an antibiotischer Aktivität erzeugt. Der antibiotische Faktor A28695A wird in reichlicherem Maße gebildet'als Antibioticum A28695B. Die anderen antibiotischen Substanzen, die bei der Fermentation enstehen, kommen in so kleinen Mengen vor, daß sich ihre Gewinnung nicht lohnt.

309827/1133

Antibioticum A28695A, wie es aus der Antibioticamischung A28695 isoliert wird, wird als weißes kristallines gemischtes Natrium-Kalium-Salz mit einem Schmelzpunkt von 161 - 165 ⁰C erhalten.

Das gemischte Natrium-Kalium-Salz von Antibioticum A28695A ist unlöslich in Wasser, wenig löslich in Methanol, löslich in Äther und löslich in Estern wie Methylacetat, Äthylacetat und dergleichen, Ketonen wie Aceton und Methyläthylketon, den halogenierten Kohlenwasserstoffen wie Chloroform und den aromatischen Kohlenwasserstoffen wie Benzol und Toluol. Antibioticum A28695A ist in Lösung bei pH-Werten oberhalb 4,0 bei Temperaturen bis zu 27 ⁰C stabil.

25 Der spezifische optische Drehwert, /alpha/_D , des gemischten Natrium-Kalium-Salzes von Antibioticum A28695 beträgt +14,07° (C=1, Methanol).

Das Infrarotabsorptionsspektrum von Antibioticum A28695A als gemischtes Natrium-Kalium-Salz in Chloroformlösung zeigt Figur 1 der beigefügten Zeichnungen. Im Bereich von 2,0 bis 15,0 Mikron lassen sich die folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima im Spektrum feststellen: 3,1-3,3, 3,4, 3,47, 6,24, 6,84, 7,00, 7,25, 7,37, 7,49, 7,68, 7,78, 8,1, 8,47, 8,61, 8,95, 9,11, 9,20, 9,42, 9,5, 9,80, 9,98, 10,24, 10,54, 10,87, 11,09, 11,5 und 11,66 Mikron. Das Antibioticum weist kein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsmuster auf.

Ein Pulver-Röntgenbeugungsdiagramm des kristallinen gemischten Natrium-Kalium-Salzes von Antibioticum A28695A, für das vanadiumgefilterte Chromstrahlung und ein Wellenlängenwert von 2,28968 zur Berechnung der Netzebenenabstände verwendet wird, liefert folgende Werte:

309827/1139

a . . , i/ii

18,23 1,00

14,75 1,00

13,26 0,40

12,05 0,60

9,53 0,40

9.01 . 0_f50 8,27 0,30

8.02 . 0,30 7,61 0,30 7,36 0,50

6.93 0,02 6,69 0,60 6,02 ' 0,40 5,92 0,30 5,59 0,10 5,43 0,40 5,24 0,10 5,09 0,20

4.94 0,40 4,76 0,05 4,57 0,10 4,35 0,05 4,16 0,02 4,09 0,10 3,98 0,05

Die freie Säure von A28695A ist eine weiße kristalline Festsubstanz mit einem Schmelzpunkt von etwa 97-99 C. Die Elementaranalyse der freien Säure von Antibioticum A28695A liefert folgende Zusammensetzung: 63,31 % Kohlenstoff, 8,83 % Wasserstoff und 28,03 % Sauerstoff. Eine massenspektroskopische Analyse von Antibioticum A28695A ergibt ein ungefähres Molekulargewicht von 834. Die

3090*7/1139

— A «ν

elektrometrische Titration des Natriumsalzes von Antibioticum A28695A in 66-prozentigem wässrigen Äthanol ergibt die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 5,91. Das Molekulargewicht des Natriumsalzes, wie es aus den Titrationswerten ermittelt wird, beträgt etwa 874. Das Molekulargewicht der freien Säure würde also etwa 852 betragen. Dieser Wert ist höher als der massenspektroskopisch ermittelte Wert. Der aus den massenspektroskopischen Ergebnissen berechnete Wert ist wahrscheinlich wegen der Grenzen der Titrationsmethode der genauere. Das Kernresonanzspektrum zeigt die Anwesenheit von 4 Methoxygruppen in dem Antibioticum A28695A.

Das gemischte Natrium-Kalium-Salz von Antibioticum A28695B ist eine weiße kristalline Verbindung vom Schmelzpunkt 170 - 172 ⁰C. Löslichkeit und Stabilität des Antibioticums sind denen des gemischten Natrium-Kalium-Salzes von Antibioticum A28695A ähnlich.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von A28695B als gemischtes Natrium-Kalium-Salz in Chloroformlösung zeigt Figur 2 der beigefügten Zeichnungen. Im Bereich von 2,0 bis 15,0 Mikron lassen sich folgende unterscheidbare Banden im Infrarotspektrum feststellen: 3,0, 3,4, 3,47, 6,24, 6,85, 7,01, 7,26, 7,3, 7,68, 7,78, 8,1, 8,58, 8,82, 8,95, 9,11, 9,19, 9,45, 9,59, 9,82, 10,04, 10,28, 10,55, 11,10, 11,24 und 11,65 Mikron.

Das Antibioticum weist kein charakteristisches Ultravlolettabsorptionsmuster auf.

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_ ε; „

Der optische Drehwert, /alpha./ , des gemischten Natrium-Kalium-Salzes von Antibioticum A28695B beträgt +10,1° (C= 1,Methanol).

Die freie Säure von Antibioticum Ä28695B ist eine weiße kristalline Festsubstanz mit einem Schmelzpunkt von 122 - 124 ⁰C. Die Mikroanalyse liefert folgende EIementarzusairmensetzung für die Säureform von A28695B in Prozent: 60,49 % Kohlenstoff, 9,15 % Wasserstoff und 31,32 % Sauerstoff. Das Kernresonanzspektrum zeigt, daß Antibioticum A28695B drei Methoxygruppen enthält. Die massenspektroskopische Analyse von Antibioticum A28695B ergibt ein ungefähres Molekulargewicht von 846. Die elektrometrische Itration von Antibioticum A28695B als Natriumsalz in 66-prozentigem wässrigem Äthanol ergibt die Anwesenheit einer titrierbaren Gruppe mit einem pKa-Wert von 5,9. Das aus den Titrationswerten berechnete Molekulargewicht des Natriumsalzes von Antibioticum A28695B beträgt etwa 877. Das Molekulargewicht der freien Säure von Antibioticum A28695B würde also etwa 855 betragen.

Ein Pulver-Röntgenbeugungsdiagramm der kristallinen Säure von Antibioticum A28695B, für das vanadiumgefilterte Chromstrahlung und ein Wellenlängenwert von 2,2895 R zur Berechnung der Netzebenenabstände verwendet wird, liefert folgende Werte:

3ÖÖÖ27VH39

"" 6 —

£ I/Il

13,54 0,50

12,63 0,05

11,52 0,15

9,96 0,02

9,39 0,60

7,88 0,20

7,52 0,20

7.08 0,30 6,66 1,00 6,46 0,20

6.28 0,20 6,05 0,30 5,81 0,50 5,57 0,20 5,33 0,70 4,92 ' 0,60 4,63 0,60 4,51 0,20

4.29 0,30

4.14 0,30 3,98 0,10 3,84 0,60 3,73 0,05 3,66 0,05 3,57 0,05 3,48 0,05 3,22 0,15 3,07 0,10 3,05 0,02 2,94 0,02 2,84 0,02 2,72 0,10 2,56 0,02 2,33 0,02 2,27 0,02

2.15 0,05

2.09 0,02 2,07 0,02 2,03 0,02

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226250V

Das papierchromatographische Verhalten der gemischten Natrium-Kalium-Salze von A28695A und A28695B zeigen die Rf-Werte in der folgenden Tabelle I. Die Werte werden, in den angegebenen Lösungsmittelsystemen jeweils mit Whatman-Papier Nr. 1 erhalten. Die Lage der Antibiotica auf dem Chromatogramm wird durch Bioautographie mit Bacillus subtilis als Nachweisorganismus festgestellt.

Tabelle I ■

Papierchromatographie der Antibiotica A28695A und A28695B

Rf-Wert¹⁾

Lösungsmittelsystem A28695A A28695B

mit Butanoi gestättigtes Wasser 0,53 0,83

mit Butanoi gesättigtes Wasser/ 2 % p-Toluolsulfonsäure/

1 % Piperidin 0,64 0,76

mit Methylisobutylketon gesättigtes Wasser/2 % Toluolsulfonsäure/1 % Piperidin

Wasser/Methanol/Aceton (12 :3:1)² * mit Wasser gesättigtes Benzol

Der Rf-Wert ist als das Verhältnis der Strecke, welche das Antibioticum von der Ursprungsstelle aus zurückgelegt hat, zu der Strecke, welche die Lösungsmittelfront von der Ursprungsstelle aus zurückgelegt hat, definiert.

2)
'Diese Lösung wird mit NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt und

dann wird der pH-Wert mit H₃PO₄ auf 7,5 vermindert.

0,58	0,74
0,25	0,54
0,57	0,48

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Zur Identifizierung und Trennung der Antibiotica A28695A und B wird ferner eine DünnschichtChromatographie auf Kieselgelplatten mit einer Vanillinsprühung als Nachweismittel durchgeführt. Das chromatographische Verhalten auf Kieselgel zeigt die folgende Tabelle.

Tabelle II

Dünnschichtchromatographie der Antibiotica A28695A und A28695B

	,71	-Wert	,61
Rf-	,69		,61
A28695A	,29	A28695B	,20
O	O
O	O
O	O

Lösungsmittelsytem

Benzol/Äthylacetat (1:1)
Chloroforra/Xthylacetat (2:3)
Benzol/Aceton (9:1)

Die neuen Antibiotica nach der Erfindung weisen hemmende Wirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen und zwar sowohl Bakterien als auch Pilze auf, die für Tiere und Pflanzen pathogen sind, und sind daher zur Unterdrückung des Wachstums solcher Mikroorganismen vorteilhaft. Die minimalen Hemmkonzentrationen der gemischten Natrium-Kalium-Salze der Antibiotica A28695A und A28695B, wie sie mit dem Agar-Verdünnungstest für beispielhafte Mikroorganismen ermittelt werden, zeigt die folgende Tabelle III.

7/1139

Tabelle

III

Mikrobiologische Aktivität der Antibiotica A28695A und A28695B

Testorganismus

Staphylococcus aureus Streptococcus faecalis Botrytis cinerea

minimale Hemmkonzentration (meg./ml)

A28695A

< 1.56 < 1 ,56 25,00

A28695B

6	,25
. 12	,50
25	,00

Bei Prüfung in einem Scheibentest zeigen beide Antibiotica A28695A und A28695B unterscheidbare Hemmzonen gegen die Mikroorganismen Bacillus subtilis, Mycobacterium avium und Sarcina lutea.

Das Antibioticum A28695B zeigt bei Prüfung in einer Virus-Gewebekultur Aktivität gegen folgende Viren: Vaccinia-Virus, Poliovirus III, Semliki-Forest-Virus, Herpes-Virus und Influenza-Vlrus Japan 305.

Die erfindungsgemäßen Antibiotica verhüten bei Prüfung in Pflanzen die Entwicklung bestimmter Pflanzenkrankheiten. Ein Präparat einer Mischung der Antibiotica A28695A und B ist bei Auftrag als, Sprühmittel gegen den pulverigen Meltau bei Bohnenpflanzen und die Kronengallenkrankheit von Tomatenpflanzen wirksam. Eine Mischung der Antibiotica A28695Ä und B ist ferner beim Auftrag auf infizierte Pflanzen als Sprühmittel oder Tränkmittel gegen die pathogenen Pflanzenviren südlicher Bohnenmosaikvirus und Zwergmaisvirus wirksam.

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Ausser den vorhergenannten Wirkungen weisen die Antibiotica A28695 auch insekticide Aktivität auf. Beispielsweise beträgt die Tötungsrate von Hausfliegen bei Kontakt mit einer Lösung von Antibioticum A28695A oder Antibioticum A28695B mit einer Konzentration von 100 ppm 88 %. Bei einer Konzentration von 250 ppm beträgt die Tötungsrate 99 %.

Eine weitere wichtige Eigenschaft der Antibiotica Λ28695 ist ihre Fähigkeit, die Entwicklung von Coccidiose bei Geflügel zu verhindern. Die Ergebnisse, die bei Zusatz jedes Antibioticums zu dem Futter von Küken, die mit einer Kombination von Eimeria tenella, Eimeria necatrix, Eimeria maxima und Eimeria acervulina infiziert sind, erhalten werden, zeigt die folgende Tabelle.

Tabelle

IV

Aktivität	der Antibiotica A28695	Morta lität, %	gegen Coccidiose bei Küken	Abnahme von Schädi gungen , % Intestium Caecum	100
Test- cjruppe	Konzentra tion im Fut ter ,Gew.-%	0	Gewichts-¹ ⁾ zunähme %	100	66
A28695A	0,01	0	76	100	<40
	0,005	O	100	90	96
	0,0025	0	80	100	0
A28695B	0,02	15	90	0
Infizierte Kontroll tiere		0	36
Kormale Kontroll tiere		100

bei normalen Kontrolltieren mit 100 % angenommen

im Vergleich zu infizierten Kontrolltieren.

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Die Ergebnisse, die bei Küken, die mit E. tenella infiziert sind, festgestellt werden, zeigt Tabelle V.

Tabelle

Wirksamkeit der Antibiotica A28695A und A28695B gegen Eimeria tenella bei Küken

Test gruppe	Konzentra tion im Futter Gew.-%	Mortali tät, %	Gewichts- ' zunähme, %	2) Abnahme von Schädigungen, S
A28695A	0,005	0	100	90
	0,0025	0	100	33
	0,00125	0	80	0
A28695B	0,03	0	93	100
	0,02	0	100	100
infizierte Kontroll tiere		20	72	0
normale Kontroll tiere		0	100

bei normalen Kontrolltieren mit 100 % angenommen im Vergleich zu infizierten Kontrolltieren.

Die akute Toxizität von Antibioticum A28695A bei Mäusen, angegeben als LD₅₀~Wert, beträgt etwa 41,1 mg/kg Körpergewicht, wenn das Antibioticum oral verabreicht wird. Der LD,-_O-Wert von"Antibioticum A28695B bei oraler Verabreichung an Mäuse beträgt etwa 43,5 mg/kg Körpergewicht.

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Wie noch ausführlich erläutert wird, verbessern die einzelner Antibiotica A28695 und Mischungen davon die Kohlenhydratverwertung bei Wiederkäuern und führen dadurch zu einer verbesserten Futterverwertung bei solchen Tieren. Wie in vitro Tests mit Pansenflüssigkeit zeigen, beeinflussen die Antibiotica die Zusammensetzung flüchtiger freier Fettsäuren im Pansen. Insbesondere erhöhen die Antibiotica bei Wiederkäuern die für den Stoffwechsel verfügbare Menge an Propionat. Propionat wird wirksamer genutzt als Acetat, das in unbehandelten Tieren reichlicher vorkommt.

Eine weitere charakteristische Eigenschaft der Antibiotica A28695 ist ihre Fähigkeit, Komplexe mit einwertigen Kationen zu bilden. In Versuchen zur Bestimmung der Ionenspezifizität zeigte Antibioticum A28695A Spezifizität für Kaliumionen und Rubidiumionen, während Antibioticum A28695B Spezifizität für Natrium- und Kaliumionen zeigte. Bei vielen chemischen Analysen ist die Verwendung von ionenspezifischen Elektroden von Bedeutung. Wegen ihrer besonderen Eigenschaften sind die Antibiotica A28695A und B als Komponenten von ionenspezifischen Elektroden geeignet.

Die Komplexe, die von den Antibiotica A28695 mit einwertigen Kationen gebildet werden, sind lipidlöslich und erleichtern daher den Transport von Ionen durch Membranen. Antibiotica, die solche Eigenschaften zeigen, werden allgemein als Ionophore bezeichnet.

Die Auswirkung der Antibiotica A28695 auf den Ionentransport kann in einem System mit Rattenlebermitochondrien und dem Antibioticum Valinomycin gemessen werden. Beide Antibiotica A28695A und A28695B machen die stimulierende Wirkung von Valinomycin auf die Hydrolyse von Adenosintriphosphat in Rattenlebermitochondrien rückgängig.

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Die neuen Antibiotica nach der Erfindung werden durch Züchten eines neu aufgefundenen Stamms eines Actinomyces-Mikro-Organismus unter submers-aeroben Bedingungen in einem Nährkulturmedium bis zu einem beträchtlichen Gehalt des Kulturmediums an antibiotischer Aktivität erzeugt. Die Antibiotica können aus dem Fermentationsmedium nach verschiedenen bekannten Methoden für die Isolierung und Reinigung gewonnen werden.

Der Actinomyces-Mikroorganismus,, der bei der Produktion der erfindungsgemäßen Antibiotica verwendet wird, ist als Stamm von . Streptomyces albus (Rossi-Doris) Waksman und Henriei identifiziert worden. Der Mikroorganismus ist ohne Abgabebeschränkung bei der ständigen Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois hinterlegt worden und erhielt in dieser Sammlung die Nummer NRRL 3883. Der Stamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die aus Curacao (Holländische Antillen) stammte. Anteile der Bodenprobe wurden in sterilem deionisiertem Wasser suspendiert und die Suspensionen wurden in Streifen auf Nähragar in Petrischalen aufgestrichen. Nach Incubation bei 25 - 35 ⁰C, bis Wachstum erfolgte, wurden Kolonien der Antibioticum A28695 produzierenden Mikroorganismen mit einer sterilen Platinschlinge auf Schrägagar überführt. Die Röhrchen mit Schrägagar wurden daün incubiert, um ein geeignetes Inoculum für die Produktion von A28695 zu erzeugen.

Bei den taxonomischen Untersuchungen der A286.95 produzierenden Kultur NRRL 3883 wurden die Methoden, die von dem Internationalen Streptomyces Projekt /Shirling und Gottlieb* Intern. Bull. Systematic Bacteriol., 16:313-340 (1966)_/ empfohlen wurden, zusammen mit einigen ergänzenden Tests

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angewandt. Die Ergebnisse der taxonomischeri Untersuchungen sind in den folgenden Abschnitten zusammengefaßt. Farbnamen wurden nach der Methode des Inter-Society Color Council National Bureau of Standards (ISCC-NBS) (Kelly und Judd, The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names, U.S. Dept. of Commerce Circ. 553, Washington, D.C. 1955) zugeordnet. In runden Klammern angegebene Buchstaben beziehen sich auf Farbblocks und unterstrichene Buchstaben und Nummern auf Farbplättchen der Farbreihe nach Tresner und Backus /Appl. Microbiol. 11:335-338 (19632./. ^D:*-^e Farbblockbezeichnungen nach Maerz und Paul /Dictionary of Color, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York (195O)_/ sind in eckigen Klammern angegeben. ISP-Nummern bezeichnen Medien des Internationalen Streptomyces Projekts, Shirling und Gottlieb (von Difco Laboratories, Detroit, Michigan beziehbar). Die Beobachtungen erfolgten nach 14 Tage langer Incubation bei 30 C, wenn nichts anderes angegeben ist.

Microskopische. Morphologie, Kulturmerkmale und Physiologie Microskopische Morphologie:

Sporophoren bilden Spiralen, Sporen sind oval (1,0-1,25#u χ 0,5-1,0,u) und treten in Ketten von 10 bis 50 auf.

Kulturmerkmale ι ISP-Medium Nr. 2

reichliches Wachstum; Rückseite hellgelb-braun /11E5/; gutes Luftmycel uiid gute Sporulation, weiß (W)a; kein lösliches Pigment.

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ISP-Medium Nr. 3 ISP-Medium Nr. 4

- 15 -

mittleres Wachstum; Rückseite weiß; mittleres Luftmycel und mittlere Sporulation weiß (W) a, mit verstreuten hellgelben Gebieten, (Y)1 1/2 fb.

reichliches Wachstum; Rückseite blaßgelb, /1OF3/; reichliches Luftmycel und reichliche Sporulation, weiß (W)a ; hellbraunes lösliches Pigment.

ISP-Medium Nr. 5 gutes bis reichliches Wachstum; Rückseite hellgelb /1OJ2/; Luftmycel und Sporen gut bis reichlich, blaßgelb (Y)2ba; kein lösliches Pigment.

Calciummalat gutes Wachstum, Rückseite hellgelb ΙΛΟΈΖ/; mäßiges Luftmycel und mäßige Sporulation, blaßgelb (Y) lba; kein bis geringes gelbes lösliches Pigment.

C ζ apek-Medium Tomatenpaste-Hafermehl

gutes Wachstum; Rückseite hellgelb /.9J2/; gutes Luftmycel und gute Sporulation, blaßgelb (Y)2ba; kein lösliches Pigment.

reichliches Wachstum; Rückseite blaßgelb /1O-B2/;gutes Luftmycel und gute Sporulation, gelblichgrau (G)2dc; kein lösliches Pigment.

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Physiologie:

Temperaturerfordernisse gutes Wachstum und gute Sporu-

lation bei 26° - 37°C; kein Wachstum bei 43°C, 49°C oder 55°C.

entrahmte Milch

keine Gerinnung oder Klärung nach 21 Tagen; ringförmiges Wachstum an der Oberfläche; Sediment.

Gelatine

vollständige Verflüssigung nach 21 Tagen.

Nitrat-Reduktion

Geringe Reduktion nach 21 Tagen

In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse der KohlenstoffVerwertungstests zusammgefaßt, die mit der A28695 produzierenden Kultur NRRL 3883 durchgeführt wurden. Die in der Tabelle verwendeten Symbole haben folgende Bedeutung :

+ = positive Verwertung
(+) « wahrscheinliche Verwertung (-) = fragliche Verwertung
« keine Verwertung

309ÖII/113I

Tabelle VI

Kohlenstoffverwertung von NRRL 3883 Substrat Reaktion

Inosit .

Mannit

Cellulose

Cellobiose

Fructose

Arabinose

Rhamnose

Raffinose

Xylose

Dextrose

Die A28685 produzierende Kultur (NRRL 3883) ist anscheinend dem Stamm von Streptomyces albus ATTC 3004, wie er von Lyons und Pridham, J. Bacteriol., 83:370-380 (1962) beschrieben wurde, sehr ähnlich. Unterschiede treten bei der Verwertung von 4 Kohlenstoffquellen und im Wachstum oberhalb 37 ⁰C auf. Die erfindungsgemäß verwendete Kultur NRRL 3883 ist ferner der Kultur NRRL 3384 ähnlich, welche Antibioticum A2O4 produziert (BE-PS 728 382). Beobachtete Unterschiede zeigen, daß NRRL 3384 etwas längere Sporen bildet, Gelatine nicht verflüssigt und bei etwas höheren Temperaturen wächst.

Als Kulturmedium für die Produktion der Antibiotica A28695A und B durch Züchtung des oben beschriebenen Mikroorganismus können verschiedene Medien verwendet werden,,da der Microorganismus, wie die oben beschriebenen Verwertungstests zeigen, verschiedene Energiequellen zu verwerten vermag. Um jedoch eine wirtschaftliche Produktion, eine maximale Ausbeute an

Antibioticum und eine leichte Isolierung des Antibioticum zu erreichen, sind bestimmte Kulturmedien vorzuziehen, die verhältnismäßig einfache Nährquellen enthalten. Beispielsweise enthalten die Medien, die für die Produktion der Antibiotica A28695A und B vorteilhaft sind, eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff wie Glucose, Mannit, Fructose, lösliche Stärke, Dextrin, Melasse, braunen Zucker und dergleichen. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose und Dextrin. Brauchbare Medien enthalten zusätzlich eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff wie Hafermehl, Rindfleischextrakt, hydrolysiertes Casein, Maisquellwasser, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Peptone (aus Fleisch oder Sojabohnen) und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl und säurehydrolysiertes Casein.

In die Medien können Mineralsalze, zum Beispiel solche, die Kalzium-, Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Kobalt-, Chlorid-, Sulfat- und Carbonationen liefern, und eine Quelle für Wuchsfaktoren, zum Beispiel Hefe oder Hefeextrakt, mit günstigen Ergebnissen eingebracht werden.

Wie bei vielen Mikroorganismen ist es als zweckmäßig anzusehen, wenn das Kulturmedium für die Züchtung des Actinomyces-Stamms NRRL-3883 die sogenannten "Spurenelemente" enthält. Solche Spurenelemente werden gewöhnlich als Verunreinigungen mit dem Zusatz der anderen Bestandteile des Mediums zugeführt.

Die Produktion der erfindungsgemäßen Antibiotica kann bei jeder Temperatur erfolgen, die zu einem brauchbaren Wachstum des Mikroorganismus führt, z.B. zwischen etwa 26 und 40 ⁰C und vorzugsweise zwischen etwa 26 und 30 C. Gewöhnlich wird eine optimale Produktion der Antibiotica in etwa 2 bis 5 Tagen erreicht.· .■ .. ... .■■.■ ,. . ■■ .■■:..-::■■<:■: ■:.-,: ■ ■ ■'■.■■■.

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Der pH-Wert des Kulturmediums zu Beginn kann in weiten Grenzen schwanken. Es hat sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, wenn am Anfang der pH-Wert des Mediums zwischen 6,5 und 7,2 liegt. Wie auch bei anderen Actinomyceten beobachtet wurde, steigt der pH-Wert des Mediums während der Wachstumsphase des Mikroorganismus allmählich an und kann einen Wert von etwa 7,0 bis etwa 8,0 oder darüber erreichen, wobei der pH-Wert am Ende wenigstens zum Teil von dem Anfangs-pH-Wert des Mediums, den in dem Medium enthaltenen Puffern und der Zeitdauer abhängt, für die der Mikroorgarnismus wachsen gelassen wird. Kleine Mengen des Antibioticums werden zweckmäßig in Schüttelkolben und durch Oberflächenkultur in Flaschen erzeugt. Für die Produktion beträchtlicher Mengen an Antibioticum A28695 wird jedoch vorzugsweise eine submers-aerobe Kultur in großen Tanks durchgeführt.

Um eine ausgeprägte Verzögerung bei der Produktion des Antibioticums mit der damit verbundenen unzureichenden Ausnutzung der Vorrichtung zu vermeiden, wird vorzugsweise die vegetative Form statt der Sporenform des Mikroorganismus für die Inoculierung des Mediums in den Produktionstanks verwendet. Dementsprechend wird zuerst ein vegetatives Inoculum des Mikroorganismus durch Inoculieren einer verhältnismäßig kleinen Menge des Kulturmediums mit der Sporenform des Mikroorganismus erzeugt und das so erhaltene junge aktive vegetative Inoculum wird dann aseptisch in die großen Produktionstanks tiberführt, Das Medium, in dem das vegetative Inoculum erzeugt wird, kann das gleiche Medium sein, wie es für die Produktion des Antibioticums verwendet wird, jedoch können mit Vorteil auch andere Medien yer-? wendet werden.

Wie es bei submers-aeroben Kulturverfahren üblich ist, wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Zur Erzielung eines brauchbaren Wachstums des Mikroorganismus und einer wirksamen Antibioticumproduktion wird vorzugsweise bei der Tankproduktion der Antibiotica A28695A und A28695B ein

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Luftvolumen von 0,1 Volumenteilen pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium aufwärts angewandt. Ein vorteilhaftes Wachstum und optimale Ausbeuten der Antibiotica A28695A und A28695B werden erzielt, wenn das angewandte Luftvolumen wenigstens 3/10 Volumenteile Luft pro Minute und pro Volumenteil Kulturmedium beträgt.

Die Konzentration an antibiotischer Aktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer leicht durch Prüfung von Proben des Kulturmediums auf ihre hemmende Wirkung auf das Wachstum eines Mikroorganismus, dessen Wachstum in Gegenwart der Antibiotica A28695A und A28695B bekanntermaßen gehemmt wird, verfolgt werden. Es wurde gefunden, daß sich der Mikroorganismus Bacillus subtilis vorteilhaft für diesen Zweck verwenden läßt. Die Prüfung kann nach der bekannten turbidometrisehen Methode oder der bekannten Scheiben-Test-Methode erfolgen.

Zur Isolierung und Reinigung der Antibiotica A28695A und A28695B können verschiedene Methoden angewandt werden, beispielsweise Lösungsmittelextraktion, die Verwendung von Adsorbentien und Chromatographiersäulen. Die Methoden der Lösungsmittelextraktion werden für die industrielle Produktion bevorzugt, da sie weniger zeitraubend und weniger aufwendig sind und da damit höhere Ausbeuten erzielt werden.

Die antibiotische Aktivität kommt im Mycel sowie in der Fermentationsflüssigkeit vor. Das Mycel kann von der Fermentationsflüssigkeit durch Filtration unter Verwendung einer Filterhilfe getrennt werden, worauf sowohl der Mycelkuchen als auch das filtrierte Fermentationsmedium mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel zur Gewinnung der A28695-Aktivität extrahiert werden. Alternativ kann

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die unfiltrierte Fermentationsmischung mit einem organischen Lösungsmittel zur Gewinnung der antibiotischen Aktivität extrahiert werden. Zu geeigneten Extraktionslösungsmitteln gehören beispielsweise Äthylacetat, Allylacetat, Butanol, Pentanol, Äthanol, Methanol oder Chloroform. Die antibiotischen Extrakte werden unter vermindertem Druck eingedampft, wodurch eine unreine Mischung der Antibiotica A28695 als öliger Rückstand erhalten wird. Die so gewonnenen Antibiotica liegen in Form ihrer gemischten Natrium-Kalium-Salze vor. Eine weitere Reinigung der Antibioticum-Mischung kann durch Chromatographieren des öligen Rückstands an einem geeigneten Adsorbens wie Aktivkohle oder Kieselgel erfolgen. Ein bevorzugtes Adsorbens zur Reinigung, der Antibioticum-Mischung A28695 ist ein Aktivkohleadsorbens wie Pittsburgh-Aktivkohle.

Aus der Mischung können durch weiteres Chromatographieren die einzelnen Antibiotica abgetrennt werden. So können beispielsweise die Natrium-Kalium-Salze von A28695A und B in einem Losungsmittelsystem aus Benzol und Äthylacetat (9:1) gelöst und die so erhaltene Lösung an einer mit Kieselgel gefüllten Säule chromatographiert werden. Die Säule wird dann mit der gleichen Lösungsmittelmischung eluiert und es werden zahlreiche Fraktionen aufgefangen. Der Fortgang der Fraktionierung wird durch Prüfen der einzelnen Fraktionen auf Dünnschichtchromatogrammen oder Papierchromatogrammen verfolgt. Die Fraktionen, die jeweils eines der einzelnen Antibiotica enthalten, werden vereinigt und das Lösungsmittel wird durch Verdampfung entfernt, wodurch die getrennten Antibiotica als gemischte Natrium-Kalium-Salze in praktisch reiner Form erhalten werden.

Die erfindungsgemäßen Antibiotica sind besonders für Wiederkäuer mit entwickelter, Pansenfunktion vorteilhaft. Junge Wiederkäuer, im wesentlichen solche, die noch nicht entwöhnt

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sind, verdauen wie Tiere mit einem Magen. Sie verwerten ihr einfaches flüssige^ Futter ebenso wie Tiere mit einem Magen. Sobald die jungen Wiederkäuer festes Futter, das Cellulose, Stärke und andere Kohlenhydrate enthält, zu fressen beginnen, beginnt sich die Funktion des Pansens zu entwickeln und die mikrobiologische Population des Pansens beginnt zuzunehmen. Nachdem das Tier einige Zeit festes Futter gefressen hat, erreicht seine Pansenfunktion ihre vollständige Entwicklung und setzt ihre Arbeit während der Lebensdauer des Tieres fort.

Die erfindungsgemäßen Antibiotica sind für alle Wiederkäuer vorteilhaft, d.h.für Tiere, die mehrere Mägen aufweisen, von denen einer ein Pansenmagen ist. Die wirtschaftlich wichtigsten Wiederkäuer sind Rinder, Schafe und Ziegen.

Es ist zu beachten, daß die Anwendbarkeit dieser Methode nicht auf Tiere, die gemästet werden, oder auf junge wachsende Tiere begrenzt ist. Wenn die Methode auf ausgewachsene Tiere, zum Beispiel Milchkühe oder Zuchttiere, angewandt wird, zeigen sich ihre Vorteile an einem verminderten Futterverbrauch.

Damit die Vorteile der genannten Methode erzielt werden, muß den Tieren eine pansenwirksame Menge des Antibioticums verabreicht werden. Die pansenwirksame Mindestmenge hängt von dem Futter, dem Zustand und dem Alter der Tiere ab. Brauchbare Mengen liegen im Bereich von etwa 0,02 mg/kg/Tag bis etwa 2,0 mg/kg/Tag. Der bevorzugte Bereich beträgt etwa 0,05 mg/kg/Tag bis etwa 1

Die folgenden Beispiele erläutern die Produktion von
A28695.

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Beispiel 1 Schüttelkolbenfermentation von A28695

Die A28695 produzierende Kultur wird auf einem Schrägagarmedium mit folgender Zusammensetzung erzeugt und gehalten:

Dextrin 7OO¹⁾ 10,0 g

N-Z Amin A²⁾ . 2,0 g

Rinderfleischextrakt 1,0 g

Hefeextrakt 1,0 g

Agar 20,0 g

deionisiertes Wasser 1 Liter

aus Holland importiertes Kartoffeldextrin

Sheffield Chemical Co., Division of National Dairy Products Corp., Norwich, N.Y.,

Das Schrägagar wird mit der A28695 produzierenden Kultur NRRL 3883 inoculiert und 4 bis 6 q?age bei 30 ⁰C incubiert. Die sporentragende Schrägkulutur wird mit einer kleinen Menge sterilem deionisiertem Wasser bedeckt und gelinde abgeschabt, um eine wässrige Sporensuspension zu erhalten.

1 ml der erhaltenen Sporensuspension wird zum Inoculieren von 100 ml sterilem vegetativem Medium mit folgender Zusammensetzung verwendet:

Glucose 15,0 g

Sojabohnenmehl 15,0 g Maisquellwasserfeststoffe 5,0 g CaCO₃ 2,0 g

NaCl , 5,0 g

Leitungswasser 1 Liter

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Das inoculierte vegetative Medium wird bei 30 C 24 bis 48 Stunden auf einer Pendelschütte!vorrichtung mit einem Ausschlag von 5 cm (2") , die. mit 108 Ausschlägen pro Minute betrieben wird, incubiert. Dann wird ein Anteil der erhaltenen Kultur von 5 ml zum Inoculieren von 100 ml sterilisiertem Produktionsmedium verwendet, das in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolbeh enthalten ist und folgende Zusammensetzung aufweist:

Sojabohnenmehl 15,0 g Casein 1,0 g

NaNO₃ 3,0 g

Glucosesirup 20,0 g Leitungswasser 1 Liter

Das inoculierte Medium wird 42 bis 72 Stunden bei 25 bis 30 ⁰C auf einer Rotationsschtitte!vorrichtung, die mit 250 UpM betrieben wird, fermentieren gelassen. Der am Ende beobachtete pH-Wert beträgt etwa 7,0.

Beispiel 2 Tankfermentation von A28695

Dextrin	10,0 g
Hefeextrakt	1,0 g
enzym-hydrolysiertes Casein	2,0 g
Rinderflei schextrakt	1,0 g
CoCl₂.6H₂O	0,01 g
Agar	20,0 g
deionisiertes Wasser	1 Liter

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Der pH-Wert des Mediums wird mit Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Nach Sterilisieren mit Wasserdampf durch 30 Minuten lange Behandlung im Autoklaven bei einem Druck von 1,05 bis 1,41 ;
pH-Wert des Mediums 6,9.

Druck von 1,05 bis 1,41 kg/cm (15 bis 20 psi) beträgt der

Das Schrägagarmediüm wird mit der A28695 produzierenden Kultur NRRL 3883 inoculiert und 10 Tage bei 30 ⁰C incubiert. Die sporentragende Schrägkultur wird mit einer kleinen Menge sterilem deionisiertem Wasser bedeckt und gelinde abgeschabt, um eine wässrige Sporensuspension zu erhalten.

Jede Suspension wird zum Inoculieren von sechs 250 ml Kolben verwendet, die jeweils 50 ml steriles vegetatives Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung enthalten:

Glucose 15,0 g

Sojabohnenschrot 15,0 g

Maisquellwasser 10,0 g.

NaCl ' 5,0 g CaCO₃ 2,0 g

Leitungswasser 1,1 Liter

Der pH-Wert des Mediums wird mit Natriumhydroxidlösung auf 6,5 eingestellt und bleibt bei 30 Minuten langem Sterilisieren im Autoklaven bei einem Druck von 1,05 bis 1,41 kg/cm (15 bis 20 psi) unverändert.

Das inoculierte Medium wird 72 Stunden bei 30 ⁰C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung, die mit 250 UpM betrieben wird, fermentieren gelassen. Ein Anteil der erhaltenen Kultur von 10 ml wird zum Inoculieren von 200 ml sterilisiertem Zweitstufenwuchsmedium verwendet, das in einem 1 Liter-Kolben enthalten ist und die gleiche Zusammensetzung wie das vorher beschriebene Medium hat.

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Das inoculierte Medium wird 30 Stunden bei 30 ⁰C auf einer PendelschütteIvorrichtung, die mit 250 UpM betrieben wird, fermentieren gelassen. Ein Anteil der erhaltenen Kultur von 200 ml wird zum Inoculieren von 25 1 des folgenden Mediums in einem 40 1 Fermenter verwendet:

Bestandteil %

Glucose	2,5
Soj abohnenschrot	1,5
sMure-hydrolysiertes Casein	0,1
Melasse	0,3
CaCO,	0,25

Leitungswasser 95,35

Der pH-Wert des Mediums beträgt nach 30 Minuten langem Sterilisieren im Autoklaven bei einem Druck von 1,05 bis 1,41 kg/cm² (15 bis 20 psi) 7,2.

Das inoculierte Medium wird mit einer Geschwindigkeit von 3/10 Volumenteilen Luft pro Volumenteil Kulturmedium pro Minute belüftet und mit üblichen Rühreinrichtungen mit 350 UpM gerührt.

Die Fermentation wird 5 Tage bei 30 ⁰C durchgeführt.

Beispiel 3 Isolierung der Antibioticum-Mischung

92 1 Fermentationsvollmaische aus einer A28695-Fermentation werden mit Hilfe einer handelsüblichen Filterhilfe filtriert. Der Mycelkuchen wird in 25 1 Methanol suspendiert und die Mischung wird 30 bis 60 Minuten kräftig gerührt.

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Die Mischung wird filtriert und das Filtrat wird zur Entfernung des Methanols eingeengt. Die so erhaltene wässrige Phase wird mit dem Filtrat der ursprünglichen Fermentationsmaische vereinigt.

Der extrahierte Mycelkuchen wird dann in 25 1 Äthylacetat suspendiert und die Suspension wird 30 bis 60 Minuten lang gerührt. Die Mischung wird filtriert und der Mycelkuchen wird verworfen.

Die filtrierte Flüssigkeit wird dann zweimal mit der Hälfte des Volumens Äthylacetat extrahiert. Die erschöpfte Flüssigkeit wird verworfen. Die Äthylacetatextrakte werden mit dem Äthylacetatextrakt des Mycelkuchens vereinigt.

Alternativ wird die A28695-Aktivität aus dem unfiltrierten Fermentationsmedium nach folgender Methode extrahiert:

92 1 des gesamten Fermentationsmediums werden mit einem gleichen Volumen Äthylacetat gerührt. Die Mischung wird filtriert und das erhaltene Filtrat wird in die Äthylacetatphase und die wässrige Phase getrennt. Die wässrige Phase wird verworfen und die Äthylacetatphase wird zur Vereinigung mit einem zweiten Extrakt aufbewahrt.

Dann wird die extrahierte Mycelmasse ein zweitesmal mit Äthylacetat extrahiert. Die Mycelmasse wird verworfen. Der Äthylacetatextrakt wird mit dem ursprünglichen Extrakt vereinigt.

Die vereinigten Extrakte werden zu einem öligen Rückstand eingeengt. Das erhaltene öl wird in 1 1 Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird durch etne 5,5 cm χ 100 cm Säule mit in Chloroform eingefüllter Aktivkohle (Pittsburgh Carbon) mit einer Körnung von 1,68 χ 0,42 mm ( 12 χ 40 mesh)

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geleitet. Die Kolonne wird mit 20 Γ Chloroform nachgewaschen. Das zunächst abströmende Chloroform und das zum Waschen verwendete Chloroform werden vereinigt und zu einem trockenen Rückstand eingeengt. Es werden 70,4 g A28695-Aktivität gewonnen.

Beispiel 4 Trennung der Antlbiotica A28695A und A28695B

30 g der rohen Antibioticum-Mischung A28695, die nach der im vorhergehenden Beispiel beschriebenen Arbeitsweise erhalten wurden, werden in einer 9:1-Mischung von Benzol und Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird durch eine 5,5 cm χ 115 cm Säule mit Kieselgel (Sorte Grace Mummer 62, Davison Chemical, Baltimore, Maryland 21226) geleitet. Das Adsorbens wurde vorher mit Benzol/Äthylacetat (9:1) gewaschen. Die Kolonne wird mit 6 1 Benzol/Äthylacetat (9:1) gewaschen und der Abfluß und die Waschflüssigkeit werden verworfen* Dann wird die Säule mit Benzol/Äthylacetat (4:1) eluiert. Das Eluat wird in mehreren Fraktionen aufgefangen. Antibioticum A28695A verläßt die Kolonne in den früheren Fraktionen, während Antibioticum A28695B in späteren Fraktionen aufgefangen wird. Die Identität des Antibioticums in den betreffenden Säulenfraktionen wird durch Papierchromatographie und Dünnechichtchromatographie bestimmt. Die Säulenfraktionen, die das gleiche Antibioticum enthalten, werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, wodurch die betreffenden einzelnen Antibiotica in praktisch reiner Form erhalten werden.

Antibioticum A28695A wird durch Auflösen des amorphen Antibioticums in warmem Äther kristallisiert. Das Antibioticum kristallisiert als gemischtes Natriuiti-Kalitin-Salz mit einem Schmelzpunkt von etwa 163 - 165 ⁰C. Ausbeute 11,8 g.

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Antibioticum A28695B wird ebenfalls aus Äther als gemischtes Natrium-Kalium-Salz mit einem Schmelzpunkt von etwa 170 - 172 ⁰C kristallisiert. Ausbeute 5/3 g.

B e i s ρ i e 1 5 Herstellung der Säureform von Antibioticum A28695A

5 g des gemischten Natrium-Kalium-Salzes von Antibioticum A28695A werden in 105 ml Dioxan gelöst. Die Lösung wird mit 40 ml Wasser versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit Salzsäure auf 4 eingestellt. Die Lösung wird zur Entfernung des Dioxans eingedampft. Die erhaltene wässrige Lösung wird zweimal mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert und die erschöpfte wässrige Phase wird verworfen. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Der getrocknete Rückstand wird in warmem Äthyläther gelöst. Die Ätherlösung wird über Nacht gekühlt, um Antibioticum A28695A zu kristallisieren. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 4,5 g, Schmelzpunkt etwa 97 - 99 ⁰C.

Beispiel 6. Herstellung der Säureform von Antibioticum A28695B

100 mg A28695B als gemischtes Natrium-Kalium-Salz werden in 25 ml Dioxan gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 20 ml Wasser versetzt und der pH-Wert wird mit Salzsaure auf 4,0 eingestellt. Die Lösung wird zur Entfernung des

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2262S01

Dioxane im Vakuum eingeengt. Die erhaltene wässrige Lösung wird mit einem gleichen Volumen Äthylacetat extrahiert und die verbrauchte wässrige Phase wird verworfen. Der Äthylacetatextrakt wird zur Trockne eingeengt. Der getrocknete Rückstand wird in einer Mindestmenge warmem Äthyläther gelöst. Die Ätherlösung wird in der Kälte gehalten, um A28695B zu kristallisieren. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 87 mg. Schmelzpunkt etwa 122 - 124 °C.

A28695A und A28695B haben die gemeinsame Eigenschaft organischer Säuren, Salze zu bilden. Beispielhaft für die anorganischen Basen, die mit den Antibiotica physiologisch annehmbare Salze bilden, sind die Alkalimetallhydroxide wie Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, die Alkalimetallcarbonate und -bicarbonate wie Lithiumcarbonat und Natriumbicarbonat, die Erdalkalimetallhydroxide und -carbonate wie Kalziumhydroxid und Magnesiumcarbonat und ähnliche anorganische Basen.

Beispielhaft für die organischen Basen, die mit den Antibiotica physiologisch annehmbare Salze bilden, sind die primären,sekundären und tertiären C.-C.-Niederalkyl- und -Niederhydroxyalkylamine wie Äthylamin, Isopropylamin, Diäthylamin, Methyl-n-butylamin, Äthanolamln und Dläthanolamin.

Die Ammoniumsalze von A28695A und A28695B werden mit Ammoniak oder Ammoniumhydroxid hergestellt.

Die Salze der Antibiotica werden nach üblichen Methoden zur Herstellung von kationischen Salzen erzeugt. Beispielsweise wird die freie Säure des Antibioticums In einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und die Antibioticumlösung mit einer Lösung der gewünschten Base in Wasser oder einem

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organischen Lösungsmittel versetzt. Die kationischen Antibioticumsalze können durch Filtration und Umkristallisieren oder durch Verdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch Umkristallisieren isoliert werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Salzen der Antibiotica A28695A und A28695B.

Beispiel 7 Herstellung des Natriumsalzes von A28695A

200 mg A28695A-Säure (nach der in Beispiel 5 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt) werden in 10 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit 5 ml Wasser versetzt und der pH-Wert der Lösung wird mit 1 η Natriumhydroxidlösung auf 9,0 eingestellt. Durch Durchleiten eines StickstoffStroms durch die Lösung wird das Aceton langsam verdampft. Es bildet sich ein Niederschlag, der gewonnen und in einer möglichst kleinen Menge Diäthyläther gelöst wird. Die Lösung wird auf ein kleines Volumen eingedampft und über Nacht auf 5 ⁰C gekühlt. Die entstandenen Kristalle werden abfiltriert und getrocknet, wodurch 133 mg A28695A-Natriumsalz mit einem Schmelzpunkt von etwa 159 - 160 ⁰C erhalten werden.

Beispiel 8 Herstellung von A28695A - Ammoniumsalz

200 mg A28695A-Säure (nach der in Beispiel 5 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt) werden in 10 ml Aceton gelöst und die Lösung wird mit 5 ml Wasser versetzt. Der pH-Wert

der Lösung wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 9,0 eingestellt. Das Aceton wird durch Durchleiten eines StickstoffStroms durch die Lösung langsam verdampft. Nachdem das Aceton aus der Lösung verdampft ist, bildet sich ein nichtkristalliner Niederschlag. Die Suspension wird mit einem gleichen Volumen DiäthylSther extrahiert und die erhaltene Ätherlösung wird in einem Stickstoffstrom auf ein kleines Volumen eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird über !lacht bei 5 C stehengelassen. Der entstandene kristalline Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet, wodurch 120 mg Produkt mit einem Schmelzpunkt von etwa 124 bis 125 ⁰C erhalten werden.

Beispiel 9 Herstellung des Natriumsalzes von A28695B

200 mg der Säureform von A28695B {nach der in Beispiel 6 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt) werden in 10 ml Aceton gelöst und die erhaltene Lösung wird unter Rühren langsam mit 5 ml Wasser versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit 1 η NaOH auf 9,0 eingestellt. Das Aceton wird in einem Stickstoffstrom langsam verdampft. Nachdem das Aceton aus der Lösung verdampft ist, beginnt sich ein kristalliner Niederschlag zu bilden. Die Suspension wird über ilacht bei 5 ⁰C stehengelassen, um vollständige Kristallisation zu erzielen. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet, wodurch 150 mg A28695B~Natriumsalz mit einem Schmelzpunkt von etwa 161 - 162 ⁰C erhalten werden*

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Beispiel 10 Herstellung des Ammoniumsalzes von A28695B

200 rag der freien Säure von A28695B (nach der in Beispiel 6 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt) werden in 10 ml Aceton gelöst und die erhaltene Lösung wird langsam unter Rühren mit 5 ml Wasser versetzt. Der pH-Wert der Lösung wird mit konzentrierter Ämmoniumhydroxidlösung auf 9,0 eingestellt. Das Aceton wird in einem Stickstoffstrom, aus der Lösung verdampft. Nachdem das Aceton aus der Lösung verdampft ist, beginnt sich ein kristalliner Niederschlag zu bilden. Die Suspension wird bei 5 ⁰C stehengelassen, um die Kristallisation zu vervollständigen. Die Kristalle des Ammoniumsalzes von A28695B werden abfiltriert und getrocknet, wodurch 138 mg Produkt mit einem Schmelzpunkt von etwa 124 - 125 ⁰C erhalten werden.

Es ist auf dem Gebiet der Veterinärpharmazie bekannt',daß die Salzform eines Antibioticums für die Behandlung eines Tiers mit dem Antibioticum ohne wesentliche Bedeutung ist. Häufig findet in dem Tier eine Umwandlung des Wirkstoffs in eine andere chemische Form als die verabreichte statt. Deshalb ist die Form des Wirkstoffs (Säure oder Salz), in der er verabreicht wird, für die Behandlungsmethode unerheblich und kann nach Wirtschaftlichkeit, Zweckmäßigkeit und Toxizität gewählt werden.

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Behandlung zur Modifizierung des Verhältnisses von flüchtigen Fettsäuren, die im Pansen gebildet werden, wurde durch wissenschaftliche Tests nachgewiesen. Die angewandte Testmethode wird im folgenden beschrieben.

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Beispiel 11

Pansenflüssigkeit wird von einem Jungstier gewonnen, dem operativ eine sich in den Pansen öffnende Fistel angelegt wurde. Der Jungstier wird auf ein Futter mit hohem Kornanteil gesetzt, das folgende Zusammensetzung aufweist:

69,95 % grober gemahlener Mals

10 % gemahlene Maiskolben

8 S Sojabohnenmehl (50 % Protein)

5 % Luzernemehl

5 % Melasse

0,6 % Harnstoff

0,5 % Dikalziumphosphat

0,5 % Kaliumcarbonat

0,3 5 Salz

0,07 % Vitamin A und D~-Vormischung

0,05 % Vitamin E-Vormischung

0,03 % Spurenminerale-Vormischung

Eine Probe von Pansenflüssigkeit wird durch 4 Lagen Mulltuch gepreßt und das Eluat wird in einer Vakuumflasche aufgefangen. Das teilchenförmige Material, das von dem Mulltuch zurückgehalten wird, wird in soviel physiologischer Pufferlösung resuspendiert, daß das ursprüngliche Volumen der Pansenflüssigkeit wieder hergestellt wird, und das Eluat wird erneut abgepreßt. Der verwendete Puffer ist nachstehend beschrieben.

309827/1139 ,

	g/Liter	2262501	Na₃IIPO₄
0,316	g/Liter	KH₂PO₄
0,152	.g/Liter	NaHCO₃
2,260	g/Liter	KCl
0,375	g/Liter	NaCl
0,375	g/Liter	MgSO₄
0,112	g/Liter	CaCl₂
0,038	g/Liter	FeSO₄.7H₂O
0,008	g/Liter	MnSO₄
0,004	g/Liter	ZnSO₄.7H₂O
0,004	g/Liter	CuSO..5H-O ^x £*
0,002	g/Liter	CoCl₀
0,001

Cheng et al., J. Dairy Sei. 38, 1225, (1955).

Die beiden Eluate werden in einem Scheidetrichter vereinigt und stehengelassen, bis sich oben teilchenförnulges Material abtrennt. Die klare Schicht wird dann mit dem gleichen Puffer im Verhältnis 1:1 verdünnt und auf pH 7,0 eingestellt.

1O ml der verdünnten Pansenflüssigkeit werden in einen 25 ml-Kolben mit 40 mg des gleichen Futters v/ie oben gegeben, Ferner werden pro Kolben 5 mg Sojabohnenprotein zugesetzt. Die zu prüfende Verbindung wird' in jeden Testkolben eingevjogen. Pro Behandlung werden 4 gleiche Kolben verwendet .

Außerdem werden 2 Sätze von jeweils 4 unbehandelten Kontrollkolben vorbereitet. Ein Satz von 4 Kolben wird zusammen mit den Testkolbe,n 16 »Stunden bei 38 C incubiert.

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Der andere Satz von 4 unbehandelten Kontrollkolben dient als Nullzeitkontrollen, denen 2 ml 2i>-prozentige Metaphosphorsäure zugesetzt werden, sobald die Kolben vorbereitet sind, um die Fermentation zu stoppen.

Die Fermentation in den incubierten Test- und Kontrollkolben wird nach 16 Stunden durch Zugabe von 2 ml 25-prozentiger Metaphosphorsäure in jeden Kolben abgebrochen.

Alle Proben werden absitzen gelassen und die überstehende Flüssigkeit wird durch gaschromatographische Methoden auf Acetat, Propionat und Butyrat analysiert.

Der Analysenwert für jede flüchtige Fettsäure (VFA), der in den Nullzeitkontrollen ermittelt wird, wird von den Analysenwerten bei den unbehandelten Kontrollkolben und bei den Testkolben abgezogen. Die erhaltenen Werte geben jeweils die Menge an VFA wieder, die während der 16 Stunden langen Fermentationsdauer erzeugt wird. Die Ergebnisse, die für die 4 gleichen Kolben in jeder Behänd lungs gruppe erhalten werden, werden gemittelt.

Die nachstehenden Ergebnisse sind als Werte für das Verhältnis von VFA-Mengen, die in behandelten Kolben erzeugt werden, zu VFA-Mengen, die in unbehandelten Kontrollkolben erzeugt werden, angegeben. Diese Art der Darstellung der Werte zeigt am deutlichsten die Ergebnisse der Änderungen in den chemischen Verhältnissen des Pansens, die mit der erfindungsgemäßen Methode zur Verbesserung der Futterverwertung herbeigeführt werden.

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Verbindung	•	Dosis	Acetat	Propionat	Butyrat
A28695A, ge		25 mcg/ml	1,03	1 ,58	0,48
mischtes Na		10	O,87	1,58	0,65
trium-Kalium-		5	1,07	1,46	0,53
Salz		5	0,90	1 ,90	0,72
		1	1,07	1 ,30	0,64
		1	O,92	1 ,59	0,78
	1'	0,90	1 ,34	1,OO
	1	O,3 8	1,10	0,87
	1	0,96	1,23	0,82
	1	0,98	1,41	0,66
	1	0,85	1 ,32	0,88
	1	0,95	1,38	0,80
	0,50	O,97	1 ,07	O,96
	0,50	0,97	1,19	0,85
	0,50	1,04	1,28	O,68
A28695B, ge	0,50	O,92	1,21	O,90
mischtes Na	0,25	0,96	1,15	O,99
trium-Kalium-	0,25	1,01	1 ,02	O,91
Salz	0,25	0,86	1,29	O,94
	0,25	1,04	1 ,21	O,74
	0,25	1,02	1 ,05	0,94
	0,20	0,94	1,27	0,87
25	1,21	1,18	0,61
10	0,53	1,76	0,85
5	1,14	1,27	0,65
5	0,95	1,81	0,70
1	1,23	1 ,05	0,67
1	0,98	1,51	O,76
0,2	0,98	1,17	O,88

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-3U-

Die vorstehenden Werte, bei denen mehrere Tests bei einer bestimmten Dosis durchgeführt wurden, können zu folgenden Durchschnittsergebnissen zusammengezogen werden.

Verbindung	5	Dosis	Acetat	Propionat	Butyrc
A28695A, gemischtes	1	mcg/ml	0,98	1,68	0,62
Natrium-Kalium-Salz	O		0,95	1,33	0,81
	O	,50	0,98	1,19	0,85
	5	,25	0,98	1,14	0,90
A28695B, gemischtes	1		1 ,04	1,54	0,68
Natrium-Kalium-Salz		1 ,10	1 ,28	0,72

Die vorstehenden Werte zeigen, daß bei jedem Einzeltest die Propionatkonzentration gegenüber dem Kontrollwert erhöht wird. Von den 29 beschriebenen Tests wird bei 19 der Acetatwert im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle vermindert. Die.Zunahme an Propionat im Verhältnis zu Acetat läßt sich besonders an den Durchschnittsergebnissen erkennen, bei denen die natürliche Schwankungsbreite biologischer Daten ausgeglichen ist. Diese Werte zeigen, daß die Behandlung mit A28695 bei allen angewandten Dosierungen die Menge an Propionat im Verhältnis zu Acetat verglichen mit Kontrollwerten beträchlieh erhöht.

Die Butyratwerte werden im Verhältnis zu den Kontrollwerten gleichmäßig verringert. Da, wie erklärt wurde, Butyrat vom Pansen aus dem nutzlos produzierten Acetat erzeugt wird, ist die Verminderung der Butyratmengen für die Futterverwertung nicht nachteilig.

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Es wurde gefunden, daß die antibiotisehen Verbindungen erfindungsgemäß die Bildung von Propionaten im Verhältnis zur Bildung von Acetaten in Wiederkäuern erhöhen, wenn sie. den Tieren oral verabreicht werden. Der einfachste Weg zur Ver-^- abreichimg der Antibiotica besteht darin, sie dem Futter für die Tiere beizumisphen.

Die antibiotisehen Verbindungen können aber auch auf anderen Wegen mit Erfolg verabreicht werden. Beispielsweise können sie in Tabletten, Tränkmittel, Boluse oder Kapseln eingebracht und so den Tieren dosiert gegeben werden. Die Zubereitung der antibiotisehen Verbindungen in solchen Dosierungsforrcen kann nach Methoden erfolgen, die auf dem Gebiet der Veterinärpharmazie allgemein bekannt sind. Kapseln können leicht durch Füllen von Gelatinekapseln mit jeder gewünschten Form des Antibiotieums erzeugt werden. Gewünschtenfall-s kann das Antibioticum mit einem inerten pulverförmigen Verdünnungsmittels, zum Beispiel einem Zucker, Stärke oder gereinigter kristalliner Cellulose, verdünnt werden, um sein Volumen zum einfacheren Füllen von Kapseln zu erhöhen.

Tabletten werden mit den erfindungsgemäß verwendeten Antibiotica nach üblichen pharmazeutischen Methoden hergestellt. Die Herstellung von Tabletten ist eine wohl bekannte und hochentwickelte Technik» Ausser dem aktiven Bestandteil enthält eine Tablette gewöhnlich einen Grundstoff, ein Spreng- oder Quellmittel, ein Absorbens, ein Bindemittel und ein Gleitmittel. Zu typischen Grundstoffen gehören Lactose, Puderzucker, Natriumchlorid, Stärke und Mannit. Stärke ist auch ein gutes Sprengmittel ebenso wie Alginsäure. Manchmal werden auch oberflächenaktive Mittel wie Natriumlaurylsulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinät verwendet. Su den gewöhnlich verwendeten Absorbentien gehören

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wiederum Stärke und Lactose, während Magnesiumcarbonat auch für ölige Substanzen geeignet ist. Häufig verwendete Bindemittel sind Gelatine, Guinmen, Stärke, Dextrin und verschiedene Cellulosederivate. Zu den üblichen Gleitmitteln gehören Magneslumstearat, Talkum, Paraffinwachs, verschiedene Metallseifen und Polyäthylenglycol.

Die erfindungsgemäßen Zwecke können auch durch Verabreichung der antibiotisehen Verbindung als Bolus, der den Wirkstoff langsam abgibt, erreicht werden. Solche Bolusse werden wie Tabletten hergestellt, mit der Ausnahme, daß Maßnahmen getroffen werden, um die Auflösung des'Antibioticums zu verzögern. Bolusse werden zur Freisetzung über längere Zeitdauer zubereitet. Die langsame Auflösung wird durch Wahl einer Form des Antibioticums unterstützt, die in Wasser in hohem Maße unlöslich ist. Um die Dichte des Bolus zu erhöhen und damit er unten im Pansen ruhen bleibt, wird ein Bestandteil wie Eisenfeile zugesetzt.

Die Auflösung des Antibioticums wird durch Verwendung einer Matrix aus unlöslichen Stoffen, in der der Wirkstoff eingebettet ist, verzögert. Geeignet sind beispielsweise Substanzen wie pflanzliche Wachse, gereinigte Mineralwachse und wasserunlösliche polymere Stoffe.

Tränkmittel der erfindungsgemäß verwendeten Antibiotica werden am besten aus einer wasserlöslichen Form des Antibioticums hergestellt. Wenn aus einem bestimmten Grund eine unlösliche Form gewünscht wird, kann eine Suspension bereitet werden. Alternativ kann ein Tränkmittel als Lösung in einem physiologisch annehmbaren Lösungsmittel, zum Beispiel einem Polyäthylenglycol, zubereitet werden.

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Suspensionen von unlöslichen Formen der erfindungsgemäß verwendeten Antibiotica können je nach der Form des gewählten Antibioticums in nichtlösenden Mitteln, zum Beispiel pflanzlichen ölen, wie Erdnuß-, Mais- oder Sesamöl, in einem Glycol wie Propylenglycol oder einem Polyäthylenglycol oder in Wasser bereitet werden.

Um die Antibiotica in Suspension zu halten, sind geeignete physiologisch annehmbare Hilfsstoffe erforderlich. Als Hilfsstoffe können die Verdickungsmittel, zum Beispiel Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und die Alginate gewählt werden. Ferner können oberflächenaktive Mittel aus vielen Klassen zum Suspendieren von Antibiotica dienen. Beispielsweise sind Lecithin, Alkylphenolpolyäthylenoxidaddukte, Naphthalensulfonate, Alkylbenzolsulfonate und die Polyoxyäthylensorbitanester zur Erzeugung von Suspensionen in flüssigen nichtlösenden Mitteln geeignet.

Außerdem können viele Stoffe, welche die Hydrophilie, Dichte und Oberflächenspannung der Flüssigkeit beeinflussen, in einzelnen Fällen die Erzeugung von Suspensionen fördern. Beispielsweise können Siliconentschäumer, Glycole, Sorbit und Zucker vorteilhafte Suspendiermittel sein.

Das suspendierbare Antibioticum kann dem Abnehmer als Suspension oder als Trockenmischung aus dem Antibioticum und Hilfsstoffen, die vor dem Gebrauch zu verdünnen sind, geliefert werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Antibiotica können auch im Trinkwasser der Wiederkäuer verabreicht werden. Das Einbringen in Trinkwasser erfolgt durch Zusatz einer wasserlöslichen oder in Wasser suspendierbaren Form des gewünschten

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Antibioticums in der richtigen Menge zu dem Wasser. Die Zubereitung des Antibioticums für den Zusatz zu Trinkwasser erfolgt nach den gleichen Grundsätzen wie die Zubereitung von Tränkmitteln.

Die größten Erfolge der erfindungsgemäßen Behandlung werden durch kontinuierliche Verabreichung von A28695 an die Tiere erzielt. Deshalb ist es am praktischsten, es in Form der verbesserten Futtermittel nach der Erfindung, die A28695 enthalten, zu verabreichen.

Die erfindungsgemäßen Futtermittel sind wegen ihres Gehalts an A28695 neu. Die Grundlage für die erfindungsgemäßen Futtermittel kann jedes Futter sein, das für die Ernährung von Wiederkäuern mit einer entwickelten Pansenfunktion geeignet ist.

Die richtige Zubereitung von Tierfuttermitteln, welche den Nährstoffbedarf von Wiederkäuern erfüllen, ist eine wohlbekannte und entwickelte Technik. Die Fachleute sind in der Zubereitung von Futtermitteln erfahren, welche die Tiere ernähren und die wirtschaftliche Situation in dem betreffenden Gebiet vorteilhaft nutzen, und sind durchaus in der Lage, Futtermittel ohne weitere Belehrung zuzubereiten. Solche Futtermittel bestehen im allgemeinen aus Kohlehydraten, Proteinen, Rauhfutteranteilen und anorganischen Salzen. In manchen Fällen werden dem Futter auch kleine Mengen von wuchsfördernden Substanzen, zum Beispiel Vitamine und Spurenminerale, zugesetzt.

Die folgenden Beispiele für Wiederkäuer-FutterZubereitungen sollen lediglich typische Zubereitungen erläutern.

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B e i s ρ i e 1 12
Lämmermastfutter', 45 % Rauhfutteranteil

gelber Hais 39,00

Luzerneheu 45,00

Zuckerrohrme1as se 10,00

Sojabohnenölmehl 5,00

Dikalziumphosphat 0,50

Salz 0,35

Spurenmineral- und Vitaminvormischungen 0,15

100,00

Beispiel 13
Lämmermastfutter, 20 % Rauhfutteranteil

gelber Mais 50,00

Zuckerrübentrester 15,00

Luzerneheu 20,00

Zuckerrohrmelasse 9,00

Sojabohnenölmehl 5,00

Dikalziumphosphat 0,50

Salz 0,35

Spurenmineral- und Vitaminvormischungen 0,15

100,00

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68,00	(% Trocken Substanz)
20,00
ΙΟ,00
0,75
0,50
Ο,5Ο
0,25

Beispiel 14
Rinderaufzucht- oder -winterfutter, hoher Rauhfutterantei1

Maissilage, gut bestockt, 50 % Trockensubstanz

gemahlenes Weizenstroh Soj abohnenölmehl Dikalziumphosphat gemahlener Kalkstein Salz

Spurenmineral- und Vitaminvormischungen

100,00

Beispiel 15
Rindermastfutter, 10 % Rauhfutteranteil

Gerste 76,OO

Baumwollsamenhülsen 10,00

Baumwollsamenmehl 8,00

tierisches Fett 4,00

Dikalziumphosphat 0,50

gemahlener Kalkstein 0,75

Salz 0,50

Spurenmineral- und Vitamiηvormischungen 0,25

100,00

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Die verbesserten Futtermittel nach der Erfindung enthalten wenigstens eine pansenwirksame Konzentration an A28695. Pansenwirksam ist eine Konzentration, die dem Tier eine pansenwirksame Dosis zuführt, wenn es seine reguläre tägliche Futterration verbraucht. Die pansenwirksamen Konzentrationen hängen selbstverständlich von dem Gewicht des Tiers und der Futtermenge, die es täglich verbraucht, ab. Gewöhnlich liegt die pansenwirksame Konzentration im Bereich von etwa 2,2 g A28695 pro Tonne Futter (2 g per ton) bis^j etwa 220 g pro Tonne (200 g per ton) . Der bevorzugte Bereich für die Konzentration an A28695 beträgt etwa 5,5 g pro Tonne (ig per ton) bis etwa 110 g pro Tonne Futter (100g per ton). Bei Konzentrationen an A28695 innerhalb dieser Bereiche erhalten die behandelten Tiere im allgemeinen wirksame Dosen von A28695. Wie jedoch für den Fachmann ersichtlich ist, können in besonderen Fällen, zum' Beispiel wenn die zu behandelnden Tiere außerordentlich kleine oder außerordentlich große Futtermengen im Verhältnis zu ihrem Gewicht verbrauchen, Konzentrationen außerhalb der angegebenen Bereiche angemessen sein.

Die Methoden zum Einbringen von Antibiotica in Tierfuttermittel sind allgemein bekannt. Es ist üblich, eine konzentrierte Wirkstoffvormischung als Rohmaterial für wirkstoffhaltige Futtermittel zu bereiten. Die Eigenschaften der Vormischung gehen in den Eigenschaften des Futters auf, das aus der Vormischung erzeugt wird. Deshalb wird die Zubereitung der Vormischung allein von der Zweckmäßigkeit der Erzeugung von Futtermittel aus der Vormischung und von wirtschaftlichen Faktoren bestimmt. Die Natur des aktiven Bestandteils der Vormischung und die biologische Wirkung des aktiven Bestandteils sind für die Zubereitung der Vormischung unmaßgeblich. Die Vormischung

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kann je nachdem, wie sich das Futter, das die gewünschte Konzentration an A28695 enthält, am zweckmäßigsten zusammenmischen läßt, etwa 2,2 bis 880 g A28695/kg (1 - 400 g/pound) enthalten. Die Vormischungen können entweder flüssig oder fest sein.

Die verbesserten Futtervormischungen nach der Erfindung, welche aufgrund ihres Gehalts an Antibioticum A28695 neu sind, werden in einem der üblicherweise verwendeten physiologisch annehmbaren Träger zubereitet. Zu flüssigen Trägern, die zur Verwendung für die Vormischung geeignet sind, gehören Glycole, zum Beispiel Polyäthylenglycole mit verschiedenem Molekulargewicht und Propylenglycol, inerte öle einschließlich pflanzlicher öle und hochraffinierter Mineralöle und physiologisch annehmbare Alkohole, zum Beispiel Äthanol. Wasser oder wässriger Alkohol 1st ein wirksamer flüssiger Vormischungsträger für viele der Formen von A28695. Zu festen Vormischungsträgern gehören beispielsweise Vermiculit, Diatomeenerde, physiologisch annehmbare Tone wie Attapulgit und Montmorillonit und granulierte oder gepulverte Futterkomponenten wie geschroteter Mais, Sojabohnenmehl, Luzernemehl, Reiskleie, Maiskolben, geschroteter Weizen und Hafer und Abfälle der Kornverarbeitung.

Alle Methoden der Zubereitung, des Mischens und des Pelletisieren von Futtermitteln, welche normalerweise für Wiederkäuerfutter angewandt werden, sind zur Herstellung von Futtermitteln, welche die erfindungsgemäß verwendeten antibiotisehen Verbindungen enthalten, völlig angemessen.

Es ist üblich, Nutztiere, einschließlich Wiederkäuer, während ihrer Lebenszeit mit verschiedenen wuchsförderndeη Mitteln, krankheitsverhütenden Mitteln und Mitteln gegen Erkrankungen zu behandeln. Solche Wirkstoffe werden

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häufig in Kombination angewandt. Die erfindungsgemäße Methode kann in Kombination mit anderen Behandlungen durchgeführt werden. '

Wie gezeigt wurde, wird durch orale Verabreichung von A28695 die Produktion von Propionaten im Verhältnis zur Produktion von Acetaten im Pansen vorteilhaft verändert. Die gleiche Behandlung nützt auch Tieren mit einem Magen, bei denen im Cäcum faseriges pflanzliches Material fermentiert wird. Die Tiere mit einem Magen, die damit gemeint sind, sind solche, welche faserige pflanzliche Nahrung verzehren und sie wenigstens teilweise durch mikrobiologische Fermentation im Cäcum verdauen. Die Fermentation im Cäcum verläuft chemisch ähnlich wie die Fermentation im Pansen.

Pferde, Schweine und Kaninchen sind beispielhaft für Tiere, die einen Teil ihres Futters durch Fermentation im Cäcum verdauen, Die Gesamtfutterverwertung solcher Tiere wird bei oraler Verabreichung von A28695 aufgrund einer vorteilhaften Änderung im Propionat/Acetat-Verhältnis verbessert. Pferde und Kaninchen sind beispielhaft für Tiere, bei denen die Fermentation in Cäsum einen wichtigen Teil des gesamten Verdauungsprozesses bildet und bei denen sich deshalb A28695 besonders günstig auswirkt.

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Claims

Patentansprüche

1. Antibioticum A28695A, eine weiße kristalline Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 97-99 ⁰C, einem durch Massenspektrometrie bestimmten ungefähren Molekulargewicht von 834, einer ungefähren Eleraentarzusammensetzung von 63,31 % Kohlenstoff, 8,83 % Wasserstoff und 28,03 % Sauerstoff, das in Form seines Natriumsalzes eine titrierbare Gruppe mit einem pKa-Wert von 5,51, bestimmt durch elektrometrische Titration in 66-prozentigem wässrigem Äthanol, hat, das in Form seines gemischten Natrium-Kalium-Salzes eine weiße kristalline Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 161 - 165 ⁰C ist, die unlöslich in Wasser, wenig löslich in Methanol und löslich in Dläthylather, Äthylacetat, Aceton, Chloroform und Benzol ist, einen spezifischen Drehwert /alpha/£⁵von +14,0 ° (C=1, Methanol) hat, als Lösung in Chloroform folgende unterscheidbare Banden im Infrarötabsorptionsspektrum aufweist: 3,1-3,3, 3,4, 3,47, 6,24, 6,84, 7,OO, 7,25, 7,37, 7,49, 7,68, 7,78, 8,1, 8,47, 8,61, 8,95, 9,11, 9,20, 9,42, 9,5, 9,80, 9,98, 10,24, 10,54». 10,87, 11,09, 11,5 und 11,66 Mikron und keine bezeichnende Absorption im Ultraviolettgebiet des Spektrums zeigt.

2. Antibioticum A28695B, eine weiße kristalline Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 122- 124 ⁰C, einem durch Massenspektrometrie bestimmten ungefähren Molekulargewicht von 846, einer ungefähren Elernentarzusammensetzung von 60,49 % Kohlenstoff, 9,15 % Wasserstoff und 31,32 % Sauerstoff, das in Form seines Natriumsalzes eine titrierbare Gruppe mit

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einen pKa-Wert von 5,9, bestimmt durch elektrometrische Titration in 66-prozentigem wässrigem Äthanol, hat, das in Form seines gemischten Natrium-Kalium-Salzes eine weiße kristalline Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 170 - 172 ⁰C ist, die unlöslich in Wasser, wenig löslich in Methanol und löslich in Diäthylather, Äthylacetat, Aceton, Chloroform und Benzol ist, einen spezifischen Drehwert /alpha/^ von +10,1 ° (C=1, 95-prozentiges wässriges Äthanol) hat, als Lösung in Chloroform folgende unterscheidbare Banden in ihrem Infrarotspektrum aufweist: 3,0, 3,4, 3,47, 6,24, 6,85, 7,01, 7,26, 7,3, 7,68, 7,78, 8,1, 8,58, 8,82, 8,95, 9,11, 9,19, 9,45, 9,59, 9,82, 10,04, 10,28, 10,55, 11,10, 11,24 und 11,65 Mikron und keine bezeichnende Absorption im Ultraviolettgebiet des Spektrums zeigt.

3. Verfahren zur Herstellung des Antibioticums Λ28695Α nach Anspruch 1 und des Antibioticums A28695B nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces albus NRRL 3883 in einem Nährkulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers-aeroben Fermentationsbedingungen gezüchtet wird, bis eine beträchtliche Menge der Antibiotica A2.8695A und A28695B von dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium gebildet worden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Kulturmedium eine Mischung der Antibiotica gewonnen wird und die gewonnene Antibioticum-Mischung in die einzelnen Antibiotica A28695A und A28695B getrennt wird,

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5. Verfahren zur Erhöhung der Produktion an Propionaten im Verhältnis zu der Produktion an Acetaten im Pansen von Wiederkäuern mit entwickelter Pansenfunktion, dadurch gekennzeichnet, daß den Tieren auf oralem Wege eine pansenwirksame Menge an Antibioticum A28695A und/oder A28695B bzw. ihrer physiologisch annehmbaren Salze verabreicht wird,

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibioticum in einer Menge von etwa 0,02 mg/kg/Tag bis etwa 2 mg/kg/Tag verabreicht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Antibioticum das gemischte Natrium-Kalium-Salz von A28695A an Rinder als Wiederkäuer verabreicht wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Antibioticum das gemischte Natrium-Kalium-SaIz von A28695B an Rinder als Wiederkäuer verabreicht wird.

9. Futter zur Ernähung von Wiederkäuern mit entwickelter Pansenfunktion, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Kohlehydraten, Proteinen, Rauhfutterbestandteilen, anorganischen Salzen und einer pansenwirksamen Konzentration an Antibioticum A28659A und/oder A28695B bezw. ihrer physiologisch annehmbaren Salze besteht.

10. Futter nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibioticum in einer Menge von etwa 2,2 bis etwa 220 g pro Tonne Futter (2 g per ton bis 200 g per ton) vorliegt.

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11. Futter nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibioticum das gemischte Natrium-Kalium-Salz von A28695A ist.

12. Futter nach Anspruch -9 oder 10, dadurch gekennzeichnet,, daß das Antibioticum das gemischte Natrium-Kalium-Salz von A23695B ist.

13. Futtervormischung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem physiologisch annehmbaren Träger und Antibioticum A28695A und/oder A28695B bezw. ihren physiologisch annehmbaren Salzen besteht.

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