DE2658563C2

DE2658563C2 -

Info

Publication number: DE2658563C2
Application number: DE2658563A
Authority: DE
Inventors: Werner Prof. Dr. Frommer; Lutz Dipl.-Chem. Dr. Mueller; Delf Dipl.-Chem. Dr. Schmidt; Walter Dr. Puls; Hans-Peter Dipl.-Biochem. Dr. 5600 Wuppertal De Krause; Ulrich Prof. Dr. 4006 Erkrath De Heber
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1976-12-23
Filing date: 1976-12-23
Publication date: 1993-07-15
Also published as: SE442874B; BE862165A; SE8901456D0; DE2658563A1; SE461101B; JPS62155290A; JPH0119877B2; JPS62143683A; SE7714661L

Description

Es ist bekannt, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem Actinoplanaceen, Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme, des Verdauungstraktes bilden (DT-OS 20 64 092).

Weiterhin weiß man, daß Nojirimycin, ein bakteriostatisch wirkendes Antibioticum aus Stämmen der Gattung Streptomyces, gewisse mikrobielle α-Glucosidasen hemmt [T. Niwa et al., Agr. Biol. Chem. 34, 966 (1970)].

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Saccharase- Inhibitoren, die im Verdauungstrakt wirksam werden. Diese Inhibitoren werden von bestimmten Stämmen der Gattung Bacillus gebildet. Die so isolierten Inhibitoren eignen sich für pharmazeutische Zusammensetzungen sowie für Verfahren zur Kontrolle und Beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels von Menschen und Tieren durch Hemmung von Saccharasen.

Zur Auffindung geeigneter Stämme bedient man sich der nachstehend beschriebenen Methode.

Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der Familie Bacillaceae, insbesondere solche der Gattung Bacillus. Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit Nährlösungen, die das Wachstum dieser Stämme ermöglichen. Man kann z. B. eine Nährlösung verwenden, die 5 g Pepton und 3 g Fleischextrakt pro Liter enthält, jedoch sind grundsätzlich viele andere Typen von Nährlösungen, die geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Nährsalze enthalten, einsetzbar. Der pH-Wert der Nährlösungen kann in weiten Grenzen variieren; bevorzugt wird ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0 und 8,0 gewählt.

Als Kohlenstofflieferant für die Nährlösung kommen die verschiedenartigsten organischen Substanzen in Frage. Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole seien beispielhaft genannt.

Als Stickstoffquelle können Hefeextrakt, Sojamehl, Peptone, Fleischextrakt und viele andere organische Substanzen Verwendung finden.

Die Konzentrationen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie der Nährsalze, von denen FeSO₄, CaCO₃ und MgSO₄ beispielhaft erwähnt seien, können in weiten Grenzen schwanken. Auf den gesonderten Zusatz von Nährsalzen kann in manchen Fällen ganz verzichtet werden, da sie oftmals in den komplexen Stickstoffquellen als Beimengungen enthalten sind.

Da die Bildung von Inhibitoren oft stark von der Zusammensetzung der Nährböden abhängig ist, empfiehlt es sich, die Stämme zur Optimierung der Produktionsleistung in verschiedenen Nährlösungen zu kultivieren. Entsprechende Vorschläge können den Beispielen entnommen werden.

Von der Nährlösung füllt man z. B. 100-200 ml in einen 1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, sterilisiert in bekannter Weise, beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet den Kolben bei 15-80°C, vorzugsweise bei 24-40°C bzw. 50-70°C bei thermophilen Bacillen, auf Schüttelmaschinen. Zeigt die Kultur Wachstum, was im allgemeinen nach 1-10 Tagen, meist nach 1-5 Tagen sichtbar wird, so entnimmt man eine Probe von z. B. 5 ml und trennt in dieser Probe die Zellen durch Filtration oder Zentrifugation ab. Von den Kulturbrühen werden 1-100 µl in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt und die Hemmkapazität pro ml berechnet.

Die Zellen werden zweimal mit je 5 Volumina (bezogen auf das Zellvolumen) Aceton und anschließend einmal mit 5 Volumina Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zur Trockene eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Die Lyophilisate werden in Konzentrationen von 10-1000 µg/ml in dem nachfolgend beschriebenen Test eingesetzt.

Saccharasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibiert. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbindungen 1 µMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die µMol gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet. Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung [solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12 (1958), Seite 1977. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.] mit 1-20 µg Inhibitor oder 1-20 µl der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt. Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten bei 35°C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe von 1 ml Glucoseoxidasereagens [Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase (Fa. Boehringer, Reinheitsgrad I) in 100 ml 0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton×100+8 g 95% Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin · 2 HCl in 20 ml H₂O) und 0,5 ml 0,1%iger wäßriger Peroxidaselösung (Fa. Boehringer, Lyophilisat, Reinheitsgrad II) hergestellt.] ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35°C. Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50%-Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

Nach der oben beschriebenen Methode wurde eine ganze Reihe von Stämmen der Familie Bacillaceae geprüft. Dabei wurden bei Stämmen der Gattung Bacillus deutliche Saccharase inhibierende Aktivitäten gefunden. Am günstigsten hinsichtlich der Ausbeute erwiesen sich die Arten B. subtilis, B. subtilis var. niger, B. amyloliquefaciens, B. longisporus, B. polymyxa sowie B. coagulans.

Die Häufigkeit, mit der nach der angegebenen Methode Stämme gefunden wurden, die sich in den Tests als aktive Inhibitoren erwiesen, lag über 5%. Beispiele besonders wirksamer Stämme werden in Tabelle 1 aufgeführt:

Bacillus-Stämme mit Saccharase-Inhibitor-Wirkung
Art
Stamm-Nr.
B. subtilis
DSM 704
B. subtilis var. niger	DSM 675 (ATCC 9372)
B. amyloliquefaciens	DSM 7 (ATCC 23 350)
B. coagulans	DSM 1 (ATCC 7050)
B. longisporus	DSM 479
B. polymyxa	DSM 365
B. polymyxa	DSM 372
B. polymyxa	DSM 742
B. polymyxa	DSM 292
B. polymyxa	DSM 356 (ATCC 8523)
B. polymyxa	DSM 36 (ATCC 842)
B. polymyxa	DSM 740
B. polymyxa	DSM 741

Die aufgeführten Stämme sind unter den angegebenen DSM- Nummern bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM), Göttingen, hinterlegt und von dort zu beziehen.

Die Stämme DSM 704, 740, 741 und 742 werden in Tabelle 2 beschrieben; die restlichen Stämme sind aus der Literatur bekannt und werden im "Catalogue of Strains 1974" der DSM aufgeführt.

Zur Gewinnung der Saccharase-Inhibitoren werden die oben aufgeführten Stämme in den oben beschriebenen Nährlösungen kultiviert. Dabei ist zu beachten, daß praktisch jeder Stamm zur optimalen Produktion eine andere, qualitativ und quantitativ anders zusammengesetzte Nährlösung benötigt.

Nach 1-10tägiger Bebrütung bei 15-80°C, vorzugsweise 24-40°C bzw. bei Thermophilen 50-70°C, in Schüttelkolben oder in Fermentern verschiedener Größe werden die Zellen von der Kulturlösung abgetrennt und je nach dem Auftreten der Inhibitoren das wirksame Prinzip aus der Kulturlösung und/oder aus den Zellen angereichert.

Aus den Kulturbrühen gewinnt man die Inhibitoren durch Lyophilisation oder Fällung mit Salzen oder wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln (wie z. B. niedere Alkohole und Ketone) oder durch Adsorption der Wirkstoffe an Ionenaustauschern.

Aus den Zellen gewinnt man die Inhibitoren durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen, Ketonen, Äthern, Estern und Sulfoxiden.

Dazu wird der Fermentationsansatz bei 3000-20 000 UpM, vorzugsweise 6-10 000 UpM 10-60 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten zentrifugiert oder filtriert, vorzugsweise mit Druck und unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmitteln, und derart in Kulturbrühe und Zellrückstand getrennt.

Tabelle 2

Die Stämme DSM 740, DSM 741, DSM 742 und DSM 704 sind aufgrund von Sporenbildung und aerobem Wachstum der Gattung Bacillus zuzuordnen. Die ermittelten morphologischen und physiologischen Merkmale der Stämme DSM 740, DSM 741 und DSM 742 entsprechen denjenigen von Bacillus polymyxa, während der Stamm DSM 704 der Art Bacillus subtilis zuzuordnen ist.

Die Identifizierung erfolgte nach den Angaben von R. E. Gordon, W. C. Haynes, C. Nor-Nay Pong: The Genus Bacillus, Washington 1973.

Die Isolierung des Inhibitors aus der jeweiligen Kulturbrühe kann auf verschiedene Weise erfolgen:

a) Einengen der Kulturbrühen bei vermindertem Druck (10- 50 Torr) bei Bad-Temperaturen von 20-100°C, vorzugsweise 40-80°C auf ca. ¹/₅-¹/₅₀ des Ausgangsvolumens. Der eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentrifugiert und ds klare Filtrat (der klare Überstand) eventuell nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.
b) Ausfällung der Inhibitoren aus der Kulturbrühe [oder den nach a) eingeengten Kulturbrühen] durch Zusatz von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Äthanol, Aceton, bis zu einem Gehalt von 60-90%. Da bei niederer Konzentration an Lösungsmittel inaktive Begleitsubstanzen gefällt werden, eignet sich dieses Fällungsverfahren besonders gut zur fraktionierenden Fällung zur Abtrennung von unerwünschten Begleitstoffen.
c) Aussalzen der Inhibitoren aus den Extrakten [oder den nach a) eingeengten Extrakten], z. B. mit Ammonsulfat, Kochsalz usw. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt und entweder direkt mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet oder nach Rücklösen in Wasser dialysiert und lyophilisiert.
d) Adsorption der Inhibitoren an Ionenaustauscher. Dieses Verfahren eignet sich zur Isolierung von solchen Inhibitoren, die auf Grund ihrer chemischen Natur Ladungen tragen. Die Desorption des Inhibitors geschieht durch Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes des Elutionsmediums.

Neben dem Inhibitor finden sich in den Kulturbrühen häufig unerwünschte Begleitsubstanzen. Die Abtrennung dieser Begleitstoffe kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B. durch Hitzedenaturierung der Begleitstoffe bei Inhibitoren, die hitzestabil sind oder durch Dialyse durch entsprechende Membranen bei niedermolekularen Inhibitoren, wobei die ungewünschten Begleitstoffe von der Membran zurückgehalten werden oder durch fraktionierende Fällung [vgl. b)] oder durch Adsorption der Begleitstoffe an Ionenaustauscher.

Die Gewinnung von Inhibitoren aus den Zellen geschieht durch mehrmalige Extraktion der Zellen mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise zweimaliger, 10-20minütiger Extraktion mit 3-5 Vol. Aceton (bezogen auf das Zellfeuchtvolumen) und anschließend einmaliger, 5-10minütiger Extraktion mit Äther. Die Aceton- und Äther-Extrakte werden im Vakuum zur Trockne eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.

Die neuen Substanzen lösen sich gut in Wasser. Eine Gruppe der Inhibitoren ist bei neutralen pH-Werten hitzestabil, säurestabil (pH 2), alkalistabil (pH 12) und dialysierbar. Diese Inhibitoren werden durch Trypsin und Pepsin nicht inaktiviert, sie hemmen ihrerseits die genannten Enzyme nicht. Sie sind mit den typischen Proteinfärbestoffen nicht anfärbbar. Nach Abschätzungen aus der Gelfiltration liegt das Molekulargewicht dieser Inhibitoren über 100, aber unter 2000.

Die besten Inhibitoren dieser Gruppen zeichnen sich durch eine extrem hohe, auch alle bisher bekannten Saccharase-Inhibitoren übertreffende Hemmaktivität gegenüber Saccharase aus.

Bei Fermentation des Stammes DSM 7 in einer Nährlösung der Zusammensetzung A werden nach viertätiger Fermentation über 400 000 SIE/l, bei einer Kultivierung dieses Stammes in Nährlösung S₃ werden nach sechstägiger Fermentation über 300 000 SIE/l gewonnen.

Durch Adsorption an stark sauren Kationenaustauschern in der H⊕-Form und anschließende Desorption mit wäßriger NH₃-Lösung sowie Einengen und Lyophilisation des Desorbats wird ein Rohinhibitor mit etwa 40 000 SIE/g erhalten .Extraktion des Rohinhibitors mit Methanol, Einengen des Extraktes zur Trockene, Rücklösen in Wasser und Chromatographie der wäßrigen Lösung an schwach sauren Austauschern auf Dextran- oder Cellulose-Basis, insbesondere Carboxymethylcellulose, Desorption mit verdünnten Mineralsäuren, vorzugsweise 10^-3-10^-1 N Salzsäure, Einengen der saccharase-inhibitorisch aktiven Fraktionen und Lyophilisation dieser Fraktionen führt zu einem angereicherten Rohprodukt mit etwa 250 000 SIE/g. Chromatographie des angereicherten Rohproduktes an modifiziertem Dextran (Sephadex® LH 20) in Methanol, Einengen der saccharase-inhibitorisch aktiven Fraktionen und Zusatz von konzentrierten Mineralsäuren, vorzugsweise konzentrierte Salzsäure, bis zu einem pH-Wert von 1-3 liefert ein kristallines Produkt mit 540 000 SIE/g. Diese Substanz ist chromatographisch rein. Als Summenformel wurde C₆H₁₃O₄N bzw. C₆H₁₄O₄NCl für das Hydrochlorid ermittelt. Auf Grund ihrer physikalischen Parameter (IR-, NMR-, UV-Spektren; Schmelzpunkt; spezifischer Drehwert) und den chemischen Eigenschaften (Perjodat-Oxidation, Elementaranalyse) ist sie identisch mit einer von S. Inoye et al. [Tetrahedron 23, 2125, (1968)] beschriebenen Verbindung der Summenformel C₆H₁₃O₄N bzw. C₆H₁₄O₄NCl für das Hydrochlorid, welcher von den Autoren die Strukturformel

zugeordnet und für die der Name "1-Desoxynojirimycin" vorgeschlagen wurde.

Diese Verbindung wurde von den Autoren auf chemischem Weg durch Hydrierung des Antibioticums Nojirimycin erhalten. Das Ausgangsprodukt Nojirimycin wird nach T. Niida et al. [J. Antibiotics, Ser. A. 20, 62 (1967)] durch Fermentation von Organismen der Gattung Streptomyces erhalten.

Es ist außerordentlich überraschend und war nicht vorherzusehen, daß diese Verbindungen von Organismen der Gattung Bacillus produziert werden, da sich diese Mikroorganismen im allgemeinen als Sekundärstoff-Produzenten weniger eignen und allenfalls im wesentlichen peptidartige Sekundärstoffe bilden.

Darüber hinaus werden von einzelnen Stämmen, z. B. DSM 372, Saccharase-Inhibitoren gebildet, die im Gemisch neben Desoxynojirimycin und/oder Nojirimycin noch andere, im Dünnschicht- Chromatogramm deutlich unterscheidbare saccharase-inhibitorisch aktive Komponenten produzieren.

Andere Stämme, z. B. DSM 741, bilden Inhibitoren, die im Dünnschicht-Chromatogramm kein Desoxynojirimycin oder Nojirimycin erkennen lassen und die somit chemisch von anderer Struktur sind.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und Getränken (z. B. Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier, Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glycosidhydrolasen (z. B. Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen) nach folgendem Schema

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oder begünstigt.

Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.

Malabsorption von Kohlenhydraten, z. B. infolge intestinalen Saccharasemangels, bewirkt eine Diarrhoe. Geeignete Dosen eines Glucosidase-Inhibitors bewirken eine künstliche Malabsorption und sind deshalb geeignet, einer Obstipation entgegenzuwirken.

Die erfindungsgemäß hergestellten Inhibitoren eignen sich deshalb als Therapeutica für folgende Indikationen: Adipositas, Hyperlipoproteinämie, Atherosklerose, Diabetes, Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies.

Näheres zu Arzneimitteln und Arzneimittelpräparationen beschreibt die DE-PS 26 61 012.

Beispiel 1

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung

2,0% Maisstärke,
1,0% Glucose,
0,5% Kaseinhydrolysat,
1,0% Hefeextrakt,
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt,
+0,4% CaCO₃,
Sterilisation 30′ bei 121°C,

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 70 SIE/ml.

Beispiel 2

7,5% Malzextrakt,
0,3% Kaseinhydrolysat,
0,7% Hefeextrakt,
0,3% CaCO₃,
0,3% K₂HPO₄,
Leitungswasser, Sterilisation 30′ sbei 121°C,
pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt,

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 197 SIE/ml.

Beispiel 3

Beimpft man einen 140-l-Fermenter, der 100 l Nährlösung der Zusammensetzung

7,5% Malzextrakt,
0,3% Kaseinhydrolysat,
0,7% Hefeextrakt,
0,3% CaCO₃,
0,3% K₂HPO₄,
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C,
pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt,

enthält, mit 1,2 l Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10 1-l-Erlenmeyer-Schüttelkolben mit je 120 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 704 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 28°C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 260 SIE/ml enthält.

Beispiel 4

3,0% Sojamehl,
3,0% Glycerin,
0,2% CaCO₃,
Leitungswasser,
Sterilisation 30′ bei 121°C,

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 437 SIE/ml.

Beispiel 5

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 162 SIE/ml.

Beispiel 6

1,0% Glucose,
1,0% Stärke lösl.,
0,5% Kaseinhydrolysat,
0,75% Fleischextrakt,
0,75% Peptone,
0,5% Hefeextrakt,
0,1% K₂HPO₄,
0,3% NaCl,
0,1% MgSO₄ · 7 H₂O,
Leitungswasser, pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingesteellt,
Sterilisation 30′ bei 121°C,

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 36,4 SIE/ml.

Beispiel 7

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 200 ml einer Nährlösung nach Beispiel 3 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von 224 SIE/ml.

Beispiel 8

Beimpft man einen 140-l-Fermenter, der 100 l Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit 1,2 l Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10 1-l-Erlenmeyer-Schüttelkolben mit je 120 ml Nährlösung derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 7 und bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 28°C, so erhält man eine Kulturbrühe, die 286 SIE/ml enthält.

Beispiel 9

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 1 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von 28,4 SIE/ml.

Beispiel 10

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 15,6 SIE/ml.

Beispiel 11

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 25,8 SIE/ml.

Beispiel 12

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 3,2 SIE/ml.

Beispiel 13

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 26,4 SIE/ml.

Beispiel 14

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 24,0 SIE/ml.

Beispiel 15

2,0% Maisstärke,
0,5% Glucose,
0,3% Kaseinhydrolysat,
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt,
+0,4% CaCO₃,
Sterilisation 30′ bei 121°C,

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 2 Tagen eine Aktivität von 81,7 SIE/ml und nach 3 Tagen eine Aktivität von 121 SIE/ml.

Beispiel 16

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 8,6 SIE/ml.

Beispiel 17

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 53,0 SIE/ml.

Beispiel 18

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 17,8 SIE/ml.

Beispiel 19

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 4 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von 6,0 SIE/ml.

Beispiel 20

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 21,6 SIE/ml.

Beispiel 21

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 200 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 26,8 SIE/ml.

Beispiel 22

2,0% Maisstärke,
1,0% Glucose,
0,5% Kaseinhydrolysat,
0,5% Hefeextrakt,
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt,
+0,4% CaCO₃,
Sterilisation 30′ bei 121°C,

enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 26,5 SIE/ml.

Beispiel 23

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 22 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 479 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 7,9 SIE/ml.

Beispiel 24

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 6 enthält, mit einer Sporensuspension de Stammes DSM 36 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 5,4 SIE/ml.

Beispiel 25

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 36 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 5,4 SIE/ml.

Beispiel 26

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 356 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 8,8 SIE/ml.

Beispiel 27

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,0 SIE/ml.

Beispiel 28

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,2 SIE/ml.

Beispiel 29

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 2 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 742 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von 9,8 SIE/ml.

Beispiel 30

Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer Nährlösung nach Beispiel 1 enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 740 und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine, so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von 5,7 SIE/ml.

Beispiel 31

Die Fermentationsbrühe aus einem 100-l-Fermenter nach Beispiel 3 wurde mit halbkonz. HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt und die Bakterienmasse nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt 70 l tiefbraune Kulturlösung mit einem SIE-Gehalt von 220 000 SIE/l. Diese Lösung wurde mit einer Fließrate von 20 l/h über eine mit 12 kg Lewatit® SC 104 in der H⁺-Form gepackte Säule von ⌀ 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine saccharase-inhibitorische Aktivität und wurde verworfen. Die Säule wurde mit 50 l dest. H₂O (Waschwasser I), 20 l 0,01n HCl und anschließend nochmals 20 l dest. H₂O (Waschwasser II) gewaschen. Zur Desorption der Aktivität wurden nun 2,5% Ammoniak angeschlossen. Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des Eluats und der Zunahme der Braunfärbung wird die saccharase- inhibitorische Aktivität eluiert. Der Vorlauf (20 l) bis zum Anstieg der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende Fraktion (35 l) im Rotationsverdampfer eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat, 3 l). Das Konzentrat wurde lyophilisiert. Man erhielt 288 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 38 000 SIE/g.

Beispiel 32

Die Fermentationsbrühe aus einem 100-l-Fermenter nach Beispiel 8 wurde mit halbkonz. HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt und die Bakterienmasse nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt 60 l tiefbraune Kulturlösung mit einem SIE-Gehalt von 240 000 SIE/l. Diese Lösung wurde mit einer Fließrate von 20 l/h über eine mit 12 kg Dowex 50 W×4 in der H⁺-Form gepackte Säule von ⌀ 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine saccharase-inhibitorische Aktivität und wurde verworfen. Die Säule wurde mit 50 l dest. H₂O (Waschwasser I), 20 l 0,01n HCl und anschließend nochmals 20 l dest. H₂O (Waschwasser II) gewaschen. Zur Desorption der Aktivität wurden nun 2,5% Ammoniak angeschlossen. Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeits des Eluats und der Zunahme der Braunfärbung wird die saccharase-inhibitorische Aktivität eluiert. Der Vorlauf (20 l) bis zum Anstieg der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende Fraktion (35 l) im Rotationsverdampfer eingeengt und in wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat, 3 l). Das Konzentrat wurde lyophilisiert. Man erhielt 360 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 24 000 SIE/g.

Beispiel 33

50 g Rohprodukt I aus Beispiel 31 wurden fein zermörsert und anschließend 3× mit je 300 ml techn. Methanol extrahiert. Dazu wurde der Ansatz zunächst 2 Min. im Ultraturraxhomogenisator homogenisiert, dann in ein 40-50°C warmes Wasserbad eingebracht und 20′ gerührt. Nach jeder Extraktion wurde durch ein Faltenfilter abfiltriert. Der nach der 3. Extraktion im Faltenfilter verbleibende Rückstand wurde im Vakuum getrocknet (28,4 g). Da die Testung nur eine geringe spezifische Aktivität dieses Rückstandes ergab, wurde er anschließend verworfen. Die methanolischen Extrakte wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der im Kolben verbleibende aktive Rückstand wurde in 750 ml H₂O gelöst (L=2,8 mS, pH=7,2) und mit einer Fließrate von 500 ml/h über eine 5×50-cm-Säule, gefüllt mit CM-Cellulose in der H⁺-Form (CH-Cellulose der Fa. Whatman, Typ C 52), gegeben. Man wusch mit 5 l Wasser nach und schloß dann zur Elution 20 l 0,002n HCl an. Durchlauf, Waschwasser und Eluat wurden in ca. 0,5-l-Portionen fraktioniert aufgefangen. Die saccharase-inhibitorische Aktivität wurde bestimmt und alle Fraktionen, die mehr als 30 000 SIE/l enthielten, vereinigt: Im Durchlauf die tiefbraun gefärbten Fraktionen 2-4 und im hellgelben Eluat die Fraktionen 16-35. Die vereinigten Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert. Man erhielt 18,2 g der Durchlauffraktionen 2-4 mit einer spezifischen Aktivität von 4000 SIE/g (verworfen) sowie 3,1 g des sogenannten Rohproduktes II mit 250 000 SIE/g (ca. 50-60% rein). Das Rohprodukt II ist stark hygroskopisch und zerfließt an der Luft in kurzer Zeit zu einer klebrigen Masse.

Beispiel 34

2,5 g des Rohproduktes II aus Beispiel 33 werden zur Abtrennung der Hauptmenge der begleitenden Peptide in 15 ml Methanol gelöst und über eine 5×90 cm, mit Sephadex LH 20 in Methanol gefüllte Säule chromatographiert. Bei einer Fließrate von 100 ml/h und einer Temperatur von 4-5°C sammelt man 10-ml-Fraktionen. 10 µl dieser Fraktionen werden auf eine Kieselgelplatte (Fa. Merck) aufgetragen und dünnschichtchromatographisch im System Äthanol/ 25% NH₃/H₂O=80/10/10 untersucht. Die nach DC Inhibitor enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, auf 5-10 ml eingeengt und über die gleiche Säule rechromatographiert. Man analysierte die Fraktionen in der DC und vereinigte die inhibitorhaltigen Fraktionen, wobei nur ein sehr enger Bereich geschnitten wurde. Man engt zur Trockne ein. Derart LH 20 gereinigter Inhibitor ist ca. 90% rein. Zur Abtrennung der letzten verbliebenen Peptidverunreinigungen nimmt man die nach dem Einrotieren als Rückstand verbleibende Substanz in 2-3 ml Methanol auf und versetzt die gelbe methanolische Lösung mit 50 µl konz. HCl. Nach kurzer Zeit, eventuell auch erst nach mehrstündigem Stehen, kristallisiert der Inhibitor in Form leicht gelblicher Würfel oder Quader aus. Die Peptide bleiben in der Mutterlauge. Man zentrifugiert die Kristalle ab, wäscht 1× mit eiskaltem Methanol und löst den gewaschenen Niederschlag anschließend unter Erhitzen in 2 ml Methanol wieder auf. Man setzt 4 ml Butanol hinzu und stellt über Nacht bei 4°C ab. Die am nächsten Morgen ausgefallenen farblosen Kristalle werden abzentrifugiert, 1× mit eiskaltem Methanol, 1mal mit Aceton und 1mal mit Äther gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet. Ausbeute 460 mg des Inhibitors als Hydrochlorid mit 540 000 SIE/g.

Beispiel 35

Zum Nachweis saccharase-inhibitorischer Komponenten in Kulturlösung oder Rohprodukt wurde auch folgendes dünnschichtchromatographische Verfahren mit anschließender Enzymreaktion auf der Platte benutzt, welches den Nachweis inhibitorischer Komponenten direkt auf der Platte gestattet. In dieser Dünnschichtchromatographie trägt man 1-5 µl der Fermentationsbrühen oder 1-5 µg der Präparate auf Kieselgelfertigplatten (Fa. Merck, Typ KG 60 F 254) auf und entwickelt in Äthanol/NH₃/H₂O=8/1/1. Zur direkten Sichtbarmachung der saccharase-inhibitorischen Komponenten besprayt man die entwickelte und gut getrocknete Platte mit Enzymgel (20 ml/20×20-cm-Platte) und läßt das Gel erstarren. Dann wird für 5′ in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorinkubiert und anschließend satt mit Substratgel besprayt. Nach dem Erstarren dieser zweiten Gelschicht bringt man die Platte in eine feuchte Kammer ein und inkubiert bei 40°C. Die Inhibitionsfärbung (helle Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwickelt sich in 60- 90′. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen und die Platte mit den darauf befindlichen Agarschichten am Fön mit Warmluft getrocknet.

Bereitung der Gele

Enzymgel:
1,5 g Agarose (L'Industrie Biologique Francais) wird in 100 ml 0,2m Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und anschließend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird auf 50°C abgekühlt und mit 250 µl Triton-X-100-Lösung (2 g Triton X-100+8 g Äthanol p. a.) und 0,5 ml Dianisidinlösung (20 mg Dianisidin/1 ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor Gebrauch des Gels werden 1 ml GOD/POD-Reagens (12,5 mg Glucoseoxidase, Reinheitsgrad I, Fa. Böhringer, Best.-Nr. 15 423, und 2,5 mg Peroxidase, Reinheitsgrad II, Fa. Böhringer, Best.-Nr. 15 302, gelöst in 5 ml Maleinatpuffer) und 4-5 Einheiten Saccharase aus Schweinedünndarm (Enzympräparation wie auf Seite beschrieben) zugesetzt. Das Gel muß bis zum Versprayen auf 50°C gehalten werden, da es sonst beim Sprayvorgang in den Düsen erstarrt.

Substratgel:
0,5 g Agarose wird in 100 ml Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt anschließend auf 50°C ab, versetzt mit 100 µl Triton (2 g Triton X-100+8 g Äthanol p. a.) und gibt 1 g Saccharose (Serva Nr. 35 579) zu. Nach dem Lösen der Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.

Die Untersuchung der Kulturlösungen der Stämme mit dieser Methode ergaben saccharase-inhibitorische Komponenten mit folgenden R_f-Werten:

Stämme
R_f-Werte
DSM 7\|0,25
DSM 741	0,25; 0,41; 0,50; 0,59; 0,71
DSM 704	0,25
DSM 372	0,25; 0,51; 0,60; 0,71

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Saccharase-Inhibitoren, die im Verdauungstrakt wirksam werden, dadurch gekennzeichnet, daß man Organismen der Arten Bacillus subtilis, Bacillus subtilis var. niger, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus longisporus oder Bacillus polymyxa in üblichen Nährlösungen bei Temperaturen von etwa 15 bis etwa 80°C etwa 1 bis etwa 8 Tage unter Belüftung in üblichen Fermentationsgefäßen kultiviert, die Zellen abschleudert und die Inhibitoren aus der Kulturbrühe oder den Zellextrakten durch übliche Reinigungsoperationen isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme DSM 292, DSM 356, DSM 36, DSM 740, DSM 741, DSM 1, DSM 479, DSM 365, DSM 742, DSM 7, DSM 372, DSM 675 und DSM 704 verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme DSM 7, DSM 704, DSM 675 und DSM 372 zur Gewinnung von 1-Desoxynojirimycin verwendet.