Es ist bekannt, daß eine Reihe von Actinomyceten, vor allem Actinoplanaceen,
Inhibitoren für Glykosidhydrolasen, vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme,
des Verdauungstraktes bilden (DT-OS 20 64 092).
Weiterhin weiß man, daß Nojirimycin, ein bakteriostatisch wirkendes Antibioticum
aus Stämmen der Gattung Streptomyces, gewisse mikrobielle α-Glucosidasen
hemmt [T. Niwa et al., Agr. Biol. Chem. 34, 966 (1970)].
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Saccharase-
Inhibitoren, die im Verdauungstrakt wirksam werden. Diese Inhibitoren werden
von bestimmten Stämmen der Gattung Bacillus gebildet. Die so isolierten
Inhibitoren eignen sich für pharmazeutische Zusammensetzungen sowie für
Verfahren zur Kontrolle und Beeinflussung des Kohlenhydratstoffwechsels von
Menschen und Tieren durch Hemmung von Saccharasen.
Zur Auffindung geeigneter Stämme bedient man sich der nachstehend beschriebenen
Methode.
Aus Erdproben isoliert man in bekannter Weise Stämme der
Familie Bacillaceae, insbesondere solche der Gattung Bacillus.
Mit Abimpfungen dieser Stämme beimpft man Kulturkolben mit
Nährlösungen, die das Wachstum dieser Stämme ermöglichen.
Man kann z. B. eine Nährlösung verwenden, die 5 g Pepton und
3 g Fleischextrakt pro Liter enthält, jedoch sind grundsätzlich
viele andere Typen von Nährlösungen, die geeignete Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen und Nährsalze enthalten, einsetzbar. Der
pH-Wert der Nährlösungen kann in weiten Grenzen variieren;
bevorzugt wird ein Anfangs-pH der Nährlösung zwischen 6,0
und 8,0 gewählt.
Als Kohlenstofflieferant für die Nährlösung kommen die verschiedenartigsten
organischen Substanzen in Frage. Kohlenhydrate,
organische Säuren und Alkohole seien beispielhaft
genannt.
Als Stickstoffquelle können Hefeextrakt, Sojamehl, Peptone,
Fleischextrakt und viele andere organische Substanzen Verwendung
finden.
Die Konzentrationen der Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
sowie der Nährsalze, von denen FeSO₄, CaCO₃ und MgSO₄ beispielhaft
erwähnt seien, können in weiten Grenzen schwanken.
Auf den gesonderten Zusatz von Nährsalzen kann in manchen
Fällen ganz verzichtet werden, da sie oftmals in den komplexen
Stickstoffquellen als Beimengungen enthalten sind.
Da die Bildung von Inhibitoren oft stark von der Zusammensetzung
der Nährböden abhängig ist, empfiehlt es sich, die
Stämme zur Optimierung der Produktionsleistung in verschiedenen
Nährlösungen zu kultivieren. Entsprechende Vorschläge
können den Beispielen entnommen werden.
Von der Nährlösung füllt man z. B. 100-200 ml in einen
1-Liter-Erlenmeyer-Kolben, sterilisiert in bekannter Weise,
beimpft mit dem zu untersuchenden Stamm und bebrütet den Kolben
bei 15-80°C, vorzugsweise bei 24-40°C bzw. 50-70°C
bei thermophilen Bacillen, auf Schüttelmaschinen. Zeigt die
Kultur Wachstum, was im allgemeinen nach 1-10 Tagen, meist
nach 1-5 Tagen sichtbar wird, so entnimmt man eine Probe
von z. B. 5 ml und trennt in dieser Probe die Zellen durch
Filtration oder Zentrifugation ab. Von den Kulturbrühen werden
1-100 µl in die nachfolgend beschriebenen Tests eingesetzt
und die Hemmkapazität pro ml berechnet.
Die Zellen werden zweimal mit je 5 Volumina (bezogen auf das
Zellvolumen) Aceton und anschließend einmal mit 5 Volumina
Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden
zur Trockene eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
Die Lyophilisate werden in Konzentrationen von
10-1000 µg/ml in dem nachfolgend beschriebenen Test eingesetzt.
Saccharasetest
Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die
Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu 50% inhibiert.
Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die
in einer Minute unter den unten angegebenen Testbindungen
1 µMol Saccharose in Glucose und Fructose spaltet. Die µMol
gebildete Glucose werden mit Hilfe der Glucoseoxidasereaktion
quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere
Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet.
Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf
0,12 SE eingestellten Saccharaselösung
[solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach
B. Borgström, A. Dahlquist, Acta Chem. Scand. 12 (1958),
Seite 1977. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf
entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.] mit 1-20 µg Inhibitor
oder 1-20 µl der zu testenden Lösung versetzt und
mit 0,1 M Natriummaleinatpuffer pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt.
Es wird 10 Minuten bei 35°C äquilibriert und dann mit 0,1 ml
einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m
Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt. Man inkubiert 20 Minuten
bei 35°C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe von
1 ml Glucoseoxidasereagens
[Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase
(Fa. Boehringer, Reinheitsgrad I) in 100 ml
0,565 m Tris-HCl-Puffer pH 7,0 und anschließenden Zusatz
von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton×100+8 g 95%
Äthanol p. a.), 1 ml Dianisidinlösung (260 mg o-Dianisidin · 2 HCl
in 20 ml H₂O) und 0,5 ml 0,1%iger wäßriger Peroxidaselösung
(Fa. Boehringer, Lyophilisat, Reinheitsgrad
II) hergestellt.] ab und inkubiert weitere
30 Minuten bei 35°C. Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt
und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen.
Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten
Saccharase berechnet und aus dem 50%-Hemmpunkt mit Hilfe
einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.
Nach der oben beschriebenen Methode wurde eine ganze Reihe
von Stämmen der Familie Bacillaceae geprüft. Dabei wurden
bei Stämmen der Gattung Bacillus deutliche
Saccharase inhibierende Aktivitäten gefunden. Am
günstigsten hinsichtlich der Ausbeute erwiesen sich die
Arten B. subtilis, B. subtilis var. niger, B. amyloliquefaciens,
B. longisporus, B. polymyxa sowie B. coagulans.
Die Häufigkeit, mit der nach der angegebenen Methode Stämme
gefunden wurden, die sich in den Tests als aktive Inhibitoren
erwiesen, lag über 5%. Beispiele besonders wirksamer Stämme werden in Tabelle 1 aufgeführt:
Bacillus-Stämme mit Saccharase-Inhibitor-Wirkung |
Art |
Stamm-Nr. |
B. subtilis |
DSM 704 |
B. subtilis var. niger |
DSM 675 (ATCC 9372) |
B. amyloliquefaciens |
DSM 7 (ATCC 23 350) |
B. coagulans |
DSM 1 (ATCC 7050) |
B. longisporus |
DSM 479 |
B. polymyxa |
DSM 365 |
B. polymyxa |
DSM 372 |
B. polymyxa |
DSM 742 |
B. polymyxa |
DSM 292 |
B. polymyxa |
DSM 356 (ATCC 8523) |
B. polymyxa |
DSM 36 (ATCC 842) |
B. polymyxa |
DSM 740 |
B. polymyxa |
DSM 741 |
Die aufgeführten Stämme sind unter den angegebenen DSM-
Nummern bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
(DSM), Göttingen, hinterlegt und von dort zu beziehen.
Die Stämme DSM 704, 740, 741 und 742 werden in Tabelle 2
beschrieben; die restlichen Stämme sind aus der Literatur
bekannt und werden im "Catalogue of Strains 1974" der DSM
aufgeführt.
Zur Gewinnung der Saccharase-Inhibitoren werden
die oben aufgeführten Stämme in den oben beschriebenen
Nährlösungen kultiviert. Dabei ist zu beachten, daß praktisch
jeder Stamm zur optimalen Produktion eine andere,
qualitativ und quantitativ anders zusammengesetzte Nährlösung
benötigt.
Nach 1-10tägiger Bebrütung bei 15-80°C, vorzugsweise
24-40°C bzw. bei Thermophilen 50-70°C, in Schüttelkolben
oder in Fermentern verschiedener Größe werden die
Zellen von der Kulturlösung abgetrennt und je nach dem
Auftreten der Inhibitoren das wirksame Prinzip aus der
Kulturlösung und/oder aus den Zellen angereichert.
Aus den Kulturbrühen gewinnt man die Inhibitoren durch
Lyophilisation oder Fällung mit Salzen oder wasserlöslichen
organischen Lösungsmitteln (wie z. B. niedere Alkohole
und Ketone) oder durch Adsorption der Wirkstoffe an Ionenaustauschern.
Aus den Zellen gewinnt man die Inhibitoren durch Extraktion
mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkoholen,
Ketonen, Äthern, Estern und Sulfoxiden.
Dazu wird der Fermentationsansatz bei 3000-20 000 UpM,
vorzugsweise 6-10 000 UpM 10-60 Minuten, vorzugsweise
30 Minuten zentrifugiert oder filtriert, vorzugsweise mit
Druck und unter Zuhilfenahme von Filterhilfsmitteln, und
derart in Kulturbrühe und Zellrückstand getrennt.
Die Stämme DSM 740, DSM 741, DSM 742 und DSM 704 sind aufgrund
von Sporenbildung und aerobem Wachstum der Gattung Bacillus
zuzuordnen. Die ermittelten morphologischen und physiologischen
Merkmale der Stämme DSM 740, DSM 741 und DSM 742 entsprechen
denjenigen von Bacillus polymyxa, während der Stamm DSM 704 der
Art Bacillus subtilis zuzuordnen ist.
Die Identifizierung erfolgte nach den Angaben von R. E. Gordon,
W. C. Haynes, C. Nor-Nay Pong: The Genus Bacillus, Washington
1973.
Die Isolierung des Inhibitors aus der jeweiligen Kulturbrühe
kann auf verschiedene Weise erfolgen:
- a) Einengen der Kulturbrühen bei vermindertem Druck (10-
50 Torr) bei Bad-Temperaturen von 20-100°C, vorzugsweise
40-80°C auf ca. ¹/₅-¹/₅₀ des Ausgangsvolumens.
Der eingeengte Extrakt wird filtriert oder zentrifugiert
und ds klare Filtrat (der klare Überstand) eventuell
nach vorheriger Entsalzung lyophilisiert.
- b) Ausfällung der Inhibitoren aus der Kulturbrühe [oder den
nach a) eingeengten Kulturbrühen] durch Zusatz von
wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B.
Alkoholen oder Ketonen, vorzugsweise Methanol, Äthanol,
Aceton, bis zu einem Gehalt von 60-90%. Da bei niederer
Konzentration an Lösungsmittel inaktive Begleitsubstanzen
gefällt werden, eignet sich dieses Fällungsverfahren besonders
gut zur fraktionierenden Fällung zur Abtrennung
von unerwünschten Begleitstoffen.
- c) Aussalzen der Inhibitoren aus den Extrakten [oder den nach
a) eingeengten Extrakten], z. B. mit Ammonsulfat, Kochsalz
usw. Der ausfallende Niederschlag wird durch Zentrifugation
oder Filtration gesammelt und entweder direkt mit
Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet oder
nach Rücklösen in Wasser dialysiert und lyophilisiert.
- d) Adsorption der Inhibitoren an Ionenaustauscher.
Dieses Verfahren eignet sich zur Isolierung von solchen
Inhibitoren, die auf Grund ihrer chemischen Natur Ladungen
tragen. Die Desorption des Inhibitors geschieht durch
Änderung der Ionenstärke oder des pH-Wertes des Elutionsmediums.
Neben dem Inhibitor finden sich in den Kulturbrühen häufig
unerwünschte Begleitsubstanzen. Die Abtrennung dieser
Begleitstoffe kann auf verschiedene Weise erfolgen, z. B.
durch Hitzedenaturierung der Begleitstoffe bei Inhibitoren,
die hitzestabil sind oder durch Dialyse durch entsprechende
Membranen bei niedermolekularen Inhibitoren, wobei die ungewünschten
Begleitstoffe von der Membran zurückgehalten werden
oder durch fraktionierende Fällung [vgl. b)] oder durch
Adsorption der Begleitstoffe an Ionenaustauscher.
Die Gewinnung von Inhibitoren aus den Zellen geschieht durch
mehrmalige Extraktion der Zellen mit organischen Lösungsmitteln,
vorzugsweise zweimaliger, 10-20minütiger Extraktion
mit 3-5 Vol. Aceton (bezogen auf das Zellfeuchtvolumen)
und anschließend einmaliger, 5-10minütiger Extraktion
mit Äther. Die Aceton- und Äther-Extrakte werden im Vakuum
zur Trockne eingeengt, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.
Die neuen Substanzen lösen sich gut in Wasser. Eine Gruppe der
Inhibitoren ist bei neutralen pH-Werten hitzestabil, säurestabil
(pH 2), alkalistabil (pH 12) und dialysierbar. Diese
Inhibitoren werden durch Trypsin und Pepsin nicht inaktiviert,
sie hemmen ihrerseits die genannten Enzyme nicht. Sie sind mit
den typischen Proteinfärbestoffen nicht anfärbbar. Nach Abschätzungen
aus der Gelfiltration liegt das Molekulargewicht
dieser Inhibitoren über 100, aber unter 2000.
Die besten Inhibitoren dieser Gruppen zeichnen sich durch eine
extrem hohe, auch alle bisher bekannten Saccharase-Inhibitoren
übertreffende Hemmaktivität gegenüber Saccharase
aus.
Bei Fermentation des Stammes DSM 7 in einer Nährlösung der
Zusammensetzung A werden nach viertätiger Fermentation über
400 000 SIE/l, bei einer Kultivierung dieses Stammes in
Nährlösung S₃ werden nach sechstägiger Fermentation über
300 000 SIE/l gewonnen.
Durch Adsorption an stark sauren Kationenaustauschern in der
H⊕-Form und anschließende Desorption mit wäßriger NH₃-Lösung
sowie Einengen und Lyophilisation des Desorbats wird ein Rohinhibitor
mit etwa 40 000 SIE/g erhalten .Extraktion des Rohinhibitors
mit Methanol, Einengen des Extraktes zur Trockene,
Rücklösen in Wasser und Chromatographie der wäßrigen Lösung an
schwach sauren Austauschern auf Dextran- oder Cellulose-Basis,
insbesondere Carboxymethylcellulose, Desorption mit verdünnten
Mineralsäuren, vorzugsweise 10-3-10-1 N Salzsäure, Einengen
der saccharase-inhibitorisch aktiven Fraktionen und
Lyophilisation dieser Fraktionen führt zu einem angereicherten
Rohprodukt mit etwa 250 000 SIE/g. Chromatographie des
angereicherten Rohproduktes an modifiziertem Dextran
(Sephadex® LH 20) in Methanol, Einengen der saccharase-inhibitorisch
aktiven Fraktionen und Zusatz von konzentrierten
Mineralsäuren, vorzugsweise konzentrierte Salzsäure, bis zu
einem pH-Wert von 1-3 liefert ein kristallines Produkt mit
540 000 SIE/g. Diese Substanz ist chromatographisch rein.
Als Summenformel wurde C₆H₁₃O₄N bzw. C₆H₁₄O₄NCl für das Hydrochlorid
ermittelt. Auf Grund ihrer physikalischen Parameter
(IR-, NMR-, UV-Spektren; Schmelzpunkt; spezifischer
Drehwert) und den chemischen Eigenschaften (Perjodat-Oxidation,
Elementaranalyse) ist sie identisch mit einer von
S. Inoye et al. [Tetrahedron 23, 2125, (1968)] beschriebenen
Verbindung der Summenformel C₆H₁₃O₄N bzw. C₆H₁₄O₄NCl für das
Hydrochlorid, welcher von den Autoren die Strukturformel
zugeordnet und für die der Name "1-Desoxynojirimycin" vorgeschlagen
wurde.
Diese Verbindung wurde von den Autoren auf chemischem Weg
durch Hydrierung des Antibioticums Nojirimycin erhalten.
Das Ausgangsprodukt Nojirimycin wird nach T. Niida et al.
[J. Antibiotics, Ser. A. 20, 62 (1967)] durch Fermentation
von Organismen der Gattung Streptomyces erhalten.
Es ist außerordentlich überraschend und war nicht vorherzusehen,
daß diese Verbindungen von Organismen der Gattung
Bacillus produziert werden, da sich diese Mikroorganismen im
allgemeinen als Sekundärstoff-Produzenten weniger eignen und
allenfalls im wesentlichen peptidartige Sekundärstoffe bilden.
Darüber hinaus werden von einzelnen Stämmen, z. B. DSM 372,
Saccharase-Inhibitoren gebildet, die im Gemisch neben Desoxynojirimycin
und/oder Nojirimycin noch andere, im Dünnschicht-
Chromatogramm deutlich unterscheidbare saccharase-inhibitorisch
aktive Komponenten produzieren.
Andere Stämme, z. B. DSM 741, bilden Inhibitoren, die im
Dünnschicht-Chromatogramm kein Desoxynojirimycin oder Nojirimycin
erkennen lassen und die somit chemisch von anderer
Struktur sind.
Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme
von kohlenhydrathaltigen Nahrungsmitteln und Getränken (z. B.
Getreide-, Kartoffelstärke, Obst, Fruchtsaft, Bier,
Schokolade) Hyperglykämien auftreten, die infolge eines
raschen Abbaus der Kohlenhydrate durch Glycosidhydrolasen
(z. B. Speichel- und Pankreasamylasen, Maltasen, Saccharasen)
nach folgendem Schema
bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern
besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt
die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders
starke Sekretion von Insulin, das seinerseits zu vermehrtem
Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt. Im Anschluß
an derartige Hyperglykämien tritt bei stoffwechselgesunden
und adipösen Personen infolge der Insulinsekretion häufig
eine Hypoglykämie auf. Bekannt ist, daß sowohl Hypoglykämien
als auch im Magen verweilender Speisebrei die Produktion von
Magensaft fördern, der seinerseits die Entstehung einer
Gastritis, eines Ulcus ventriculi oder duodeni auslöst oder
begünstigt.
Ferner ist bekannt, daß in der Mundhöhle Kohlenhydrate, besonders
Saccharose, durch Mikroorganismen gespalten werden
und dadurch die Kariesbildung gefördert wird.
Malabsorption von Kohlenhydraten, z. B. infolge intestinalen
Saccharasemangels, bewirkt eine Diarrhoe. Geeignete
Dosen eines Glucosidase-Inhibitors bewirken eine künstliche
Malabsorption und sind deshalb geeignet, einer Obstipation
entgegenzuwirken.
Die erfindungsgemäß hergestellten Inhibitoren eignen sich deshalb
als Therapeutica für folgende Indikationen:
Adipositas, Hyperlipoproteinämie, Atherosklerose, Diabetes,
Prädiabetes, Gastritis, Obstipation, Karies.
Näheres zu Arzneimitteln und Arzneimittelpräparationen beschreibt
die DE-PS 26 61 012.
Beispiel 1
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung
2,0% Maisstärke,
1,0% Glucose,
0,5% Kaseinhydrolysat,
1,0% Hefeextrakt,
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt,
+0,4% CaCO₃,
Sterilisation 30′ bei 121°C,
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
70 SIE/ml.
Beispiel 2
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung
7,5% Malzextrakt,
0,3% Kaseinhydrolysat,
0,7% Hefeextrakt,
0,3% CaCO₃,
0,3% K₂HPO₄,
Leitungswasser, Sterilisation 30′ sbei 121°C,
pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt,
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 704 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
197 SIE/ml.
Beispiel 3
Beimpft man einen 140-l-Fermenter, der 100 l Nährlösung
der Zusammensetzung
7,5% Malzextrakt,
0,3% Kaseinhydrolysat,
0,7% Hefeextrakt,
0,3% CaCO₃,
0,3% K₂HPO₄,
Leitungswasser, Sterilisation 30′ bei 121°C,
pH nach der Sterilisation auf 6,6-6,8 mit K₂CO₃ eingestellt,
enthält, mit 1,2 l Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von
10 1-l-Erlenmeyer-Schüttelkolben mit je 120 ml Nährlösung
derselben Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 704 und
bebrütet unter Rührung und Belüftung 5 Tage bei 28°C, so erhält
man eine Kulturbrühe, die 260 SIE/ml enthält.
Beispiel 4
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung
3,0% Sojamehl,
3,0% Glycerin,
0,2% CaCO₃,
Leitungswasser,
Sterilisation 30′ bei 121°C,
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von
437 SIE/ml.
Beispiel 5
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
162 SIE/ml.
Beispiel 6
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung
1,0% Glucose,
1,0% Stärke lösl.,
0,5% Kaseinhydrolysat,
0,75% Fleischextrakt,
0,75% Peptone,
0,5% Hefeextrakt,
0,1% K₂HPO₄,
0,3% NaCl,
0,1% MgSO₄ · 7 H₂O,
Leitungswasser, pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingesteellt,
Sterilisation 30′ bei 121°C,
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
36,4 SIE/ml.
Beispiel 7
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 200 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 3
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 7 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von
224 SIE/ml.
Beispiel 8
Beimpft man einen 140-l-Fermenter, der 100 l Nährlösung
nach Beispiel 4
enthält, mit 1,2 l Vorkultur, gewonnen durch Bebrütung von 10
1-l-Erlenmeyer-Schüttelkolben mit je 120 ml Nährlösung derselben
Zusammensetzung, beimpft mit dem Stamm DSM 7 und bebrütet unter
Rührung und Belüftung 5 Tage bei 28°C, so erhält man eine Kulturbrühe,
die 286 SIE/ml enthält.
Beispiel 9
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 1 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 6 Tagen eine Aktivität von
28,4 SIE/ml.
Beispiel 10
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von
15,6 SIE/ml.
Beispiel 11
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 365 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von
25,8 SIE/ml.
Beispiel 12
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 4
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
3,2 SIE/ml.
Beispiel 13
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
26,4 SIE/ml.
Beispiel 14
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
24,0 SIE/ml.
Beispiel 15
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung
2,0% Maisstärke,
0,5% Glucose,
0,3% Kaseinhydrolysat,
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt,
+0,4% CaCO₃,
Sterilisation 30′ bei 121°C,
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 741 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 2 Tagen eine Aktivität von
81,7 SIE/ml und nach 3 Tagen eine Aktivität von 121 SIE/ml.
Beispiel 16
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 4
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675
und bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
8,6 SIE/ml.
Beispiel 17
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
53,0 SIE/ml.
Beispiel 18
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 675 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von
17,8 SIE/ml.
Beispiel 19
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 4
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 5 Tagen eine Aktivität von
6,0 SIE/ml.
Beispiel 20
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von
21,6 SIE/ml.
Beispiel 21
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 200 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
26,8 SIE/ml.
Beispiel 22
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung der Zusammensetzung
2,0% Maisstärke,
1,0% Glucose,
0,5% Kaseinhydrolysat,
0,5% Hefeextrakt,
pH mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt,
+0,4% CaCO₃,
Sterilisation 30′ bei 121°C,
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 372 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
26,5 SIE/ml.
Beispiel 23
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 22
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 479 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
7,9 SIE/ml.
Beispiel 24
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 6
enthält, mit einer Sporensuspension de Stammes DSM 36 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
5,4 SIE/ml.
Beispiel 25
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 36 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
5,4 SIE/ml.
Beispiel 26
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 356 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
8,8 SIE/ml.
Beispiel 27
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
9,0 SIE/ml.
Beispiel 28
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 292 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
9,2 SIE/ml.
Beispiel 29
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 2
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 742 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 3 Tagen eine Aktivität von
9,8 SIE/ml.
Beispiel 30
Beimpft man einen 1-l-Erlenmeyer-Kolben, der 120 ml einer
Nährlösung nach Beispiel 1
enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes DSM 740 und
bebrütet den Kolben bei 28°C auf einer Rundschüttelmaschine,
so zeigt die Kulturlösung nach 4 Tagen eine Aktivität von
5,7 SIE/ml.
Beispiel 31
Die Fermentationsbrühe aus einem 100-l-Fermenter
nach Beispiel 3
wurde mit halbkonz. HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt und die
Bakterienmasse nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt
70 l tiefbraune Kulturlösung mit einem SIE-Gehalt von
220 000 SIE/l. Diese Lösung wurde mit einer Fließrate von
20 l/h über eine mit 12 kg Lewatit® SC 104 in der H⁺-Form
gepackte Säule von ⌀ 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch
keine saccharase-inhibitorische Aktivität und wurde verworfen. Die
Säule wurde mit 50 l dest. H₂O (Waschwasser I), 20 l 0,01n HCl
und anschließend nochmals 20 l dest. H₂O (Waschwasser II) gewaschen.
Zur Desorption der Aktivität wurden nun 2,5% Ammoniak
angeschlossen. Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeit des
Eluats und der Zunahme der Braunfärbung wird die saccharase-
inhibitorische Aktivität eluiert. Der Vorlauf (20 l) bis zum
Anstieg der Leitfähigkeit wird verworfen, die die Aktivität enthaltende
Fraktion (35 l) im Rotationsverdampfer eingeengt und in
wenig Wasser rückgelöst (Konzentrat, 3 l). Das Konzentrat wurde
lyophilisiert. Man erhielt 288 g tiefbraunes Rohprodukt I
mit 38 000 SIE/g.
Beispiel 32
Die Fermentationsbrühe aus einem 100-l-Fermenter
nach Beispiel 8
wurde mit halbkonz. HCl auf pH 3,0-3,5 eingestellt und die
Bakterienmasse nach dem Ausflocken abzentrifugiert. Man erhielt
60 l tiefbraune Kulturlösung mit einem SIE-Gehalt von
240 000 SIE/l. Diese Lösung wurde mit einer Fließrate von
20 l/h über eine mit 12 kg Dowex 50 W×4 in der H⁺-Form gepackte
Säule von ⌀ 30 cm gegeben. Der Durchlauf hatte praktisch keine
saccharase-inhibitorische Aktivität und wurde verworfen. Die Säule
wurde mit 50 l dest. H₂O (Waschwasser I), 20 l 0,01n HCl und
anschließend nochmals 20 l dest. H₂O (Waschwasser II) gewaschen.
Zur Desorption der Aktivität wurden nun 2,5% Ammoniak angeschlossen.
Parallel mit dem Anstieg der Leitfähigkeits des Eluats und der
Zunahme der Braunfärbung wird die saccharase-inhibitorische Aktivität
eluiert. Der Vorlauf (20 l) bis zum Anstieg der Leitfähigkeit
wird verworfen, die die Aktivität enthaltende Fraktion
(35 l) im Rotationsverdampfer eingeengt und in wenig Wasser
rückgelöst (Konzentrat, 3 l). Das Konzentrat wurde lyophilisiert.
Man erhielt 360 g tiefbraunes Rohprodukt I mit 24 000 SIE/g.
Beispiel 33
50 g Rohprodukt I aus Beispiel 31 wurden fein zermörsert und
anschließend 3× mit je 300 ml techn. Methanol extrahiert. Dazu
wurde der Ansatz zunächst 2 Min. im Ultraturraxhomogenisator
homogenisiert, dann in ein 40-50°C warmes Wasserbad eingebracht
und 20′ gerührt. Nach jeder Extraktion wurde durch ein Faltenfilter
abfiltriert. Der nach der 3. Extraktion im Faltenfilter
verbleibende Rückstand wurde im Vakuum getrocknet (28,4 g). Da
die Testung nur eine geringe spezifische Aktivität dieses Rückstandes
ergab, wurde er anschließend verworfen. Die methanolischen
Extrakte wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt.
Der im Kolben verbleibende aktive Rückstand wurde in 750 ml H₂O
gelöst (L=2,8 mS, pH=7,2) und mit einer Fließrate von
500 ml/h über eine 5×50-cm-Säule, gefüllt mit CM-Cellulose in
der H⁺-Form (CH-Cellulose der Fa. Whatman, Typ C 52), gegeben. Man
wusch mit 5 l Wasser nach und schloß dann zur Elution 20 l 0,002n
HCl an. Durchlauf, Waschwasser und Eluat wurden in ca. 0,5-l-Portionen
fraktioniert aufgefangen. Die saccharase-inhibitorische Aktivität
wurde bestimmt und alle Fraktionen, die mehr als 30 000
SIE/l enthielten, vereinigt: Im Durchlauf die tiefbraun gefärbten
Fraktionen 2-4 und im hellgelben Eluat die Fraktionen 16-35. Die
vereinigten Fraktionen wurden eingeengt und lyophilisiert. Man
erhielt 18,2 g der Durchlauffraktionen 2-4 mit einer spezifischen
Aktivität von 4000 SIE/g (verworfen) sowie 3,1 g des sogenannten
Rohproduktes II mit 250 000 SIE/g (ca. 50-60% rein). Das
Rohprodukt II ist stark hygroskopisch und zerfließt an der
Luft in kurzer Zeit zu einer klebrigen Masse.
Beispiel 34
2,5 g des Rohproduktes II aus Beispiel 33 werden zur Abtrennung
der Hauptmenge der begleitenden Peptide in 15 ml Methanol gelöst
und über eine 5×90 cm, mit Sephadex LH 20 in Methanol gefüllte
Säule chromatographiert. Bei einer Fließrate von 100 ml/h und
einer Temperatur von 4-5°C sammelt man 10-ml-Fraktionen. 10 µl
dieser Fraktionen werden auf eine Kieselgelplatte (Fa. Merck)
aufgetragen und dünnschichtchromatographisch im System Äthanol/
25% NH₃/H₂O=80/10/10 untersucht. Die nach DC Inhibitor enthaltenden
Fraktionen wurden vereinigt, auf 5-10 ml eingeengt und
über die gleiche Säule rechromatographiert. Man analysierte die
Fraktionen in der DC und vereinigte die inhibitorhaltigen
Fraktionen, wobei nur ein sehr enger Bereich geschnitten wurde.
Man engt zur Trockne ein. Derart LH 20 gereinigter Inhibitor ist
ca. 90% rein. Zur Abtrennung der letzten verbliebenen Peptidverunreinigungen
nimmt man die nach dem Einrotieren als Rückstand
verbleibende Substanz in 2-3 ml Methanol auf und versetzt die
gelbe methanolische Lösung mit 50 µl konz. HCl. Nach kurzer Zeit,
eventuell auch erst nach mehrstündigem Stehen, kristallisiert der
Inhibitor in Form leicht gelblicher Würfel oder Quader aus. Die
Peptide bleiben in der Mutterlauge. Man zentrifugiert die Kristalle
ab, wäscht 1× mit eiskaltem Methanol und löst den gewaschenen
Niederschlag anschließend unter Erhitzen in 2 ml Methanol wieder
auf. Man setzt 4 ml Butanol hinzu und stellt über Nacht bei 4°C
ab. Die am nächsten Morgen ausgefallenen farblosen Kristalle
werden abzentrifugiert, 1× mit eiskaltem Methanol, 1mal mit
Aceton und 1mal mit Äther gewaschen und anschließend im Vakuum
getrocknet. Ausbeute 460 mg des Inhibitors als Hydrochlorid
mit 540 000 SIE/g.
Beispiel 35
Zum Nachweis saccharase-inhibitorischer Komponenten in Kulturlösung
oder Rohprodukt wurde auch folgendes dünnschichtchromatographische
Verfahren mit anschließender Enzymreaktion auf der
Platte benutzt, welches den Nachweis inhibitorischer Komponenten
direkt auf der Platte gestattet. In dieser Dünnschichtchromatographie
trägt man 1-5 µl der Fermentationsbrühen oder 1-5 µg
der Präparate auf Kieselgelfertigplatten (Fa. Merck, Typ
KG 60 F 254) auf und entwickelt in Äthanol/NH₃/H₂O=8/1/1.
Zur direkten Sichtbarmachung der saccharase-inhibitorischen Komponenten besprayt man die entwickelte und gut getrocknete Platte
mit Enzymgel (20 ml/20×20-cm-Platte) und läßt das Gel erstarren.
Dann wird für 5′ in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur
vorinkubiert und anschließend satt mit Substratgel besprayt. Nach
dem Erstarren dieser zweiten Gelschicht bringt man die Platte in eine
feuchte Kammer ein und inkubiert bei 40°C. Die Inhibitionsfärbung
(helle Flecken, rotbrauner Hintergrund) entwickelt sich in 60-
90′. Zum Zeitpunkt der optimalen Farbentwicklung wird abgebrochen
und die Platte mit den darauf befindlichen Agarschichten am Fön
mit Warmluft getrocknet.
Bereitung der Gele
Enzymgel:
1,5 g Agarose (L'Industrie Biologique Francais) wird
in 100 ml 0,2m Na-Maleinatpuffer pH 6,0 suspendiert und
anschließend durch Aufkochen gelöst. Die klare Agaroselösung wird
auf 50°C abgekühlt und mit 250 µl Triton-X-100-Lösung (2 g Triton
X-100+8 g Äthanol p. a.) und 0,5 ml Dianisidinlösung (20 mg
Dianisidin/1 ml Aceton) unter Umschwenken versetzt. Direkt vor
Gebrauch des Gels werden 1 ml GOD/POD-Reagens (12,5 mg Glucoseoxidase,
Reinheitsgrad I, Fa. Böhringer, Best.-Nr. 15 423, und 2,5 mg
Peroxidase, Reinheitsgrad II, Fa. Böhringer, Best.-Nr. 15 302, gelöst
in 5 ml Maleinatpuffer) und 4-5 Einheiten Saccharase aus
Schweinedünndarm (Enzympräparation wie auf Seite beschrieben) zugesetzt. Das Gel muß bis zum Versprayen
auf 50°C gehalten werden, da es sonst beim Sprayvorgang in den
Düsen erstarrt.
Substratgel:
0,5 g Agarose wird in 100 ml Na-Maleinatpuffer
pH 6,0 suspendiert und unter Kochen gelöst. Man kühlt anschließend
auf 50°C ab, versetzt mit 100 µl Triton (2 g Triton X-100+8 g
Äthanol p. a.) und gibt 1 g Saccharose (Serva Nr. 35 579) zu. Nach
dem Lösen der Saccharose ist das Gel gebrauchsfertig.
Die Untersuchung der Kulturlösungen der Stämme mit dieser Methode
ergaben saccharase-inhibitorische Komponenten mit folgenden
Rf-Werten:
Stämme |
Rf-Werte |
DSM 7|0,25 |
DSM 741 |
0,25; 0,41; 0,50; 0,59; 0,71 |
DSM 704 |
0,25 |
DSM 372 |
0,25; 0,51; 0,60; 0,71 |