DE2209834C3 - Herstellung von Saccharase-Inhibitoren - Google Patents

Description

Gegenstand älterer Patentanmeldungen (deutsche Patentanmeldung P 20 64 09Z0, britische Patentanmeldung Nr. 59 939/71) ist die Erkenntnis, daß eine Reihe von Actinomyceten Inhibitoren von Glycosidhydrolasen. und zwar insbesondere Inhibitoren für Glycosid hydrolasen vorzugsweise kohlenhydratspaltender Enzyme des Verdauungstraktes bilden. Eine Gruppe dieser Inhibitoren ist relativ hitzestabil und bei Raumtemperatur säore- und alkalistabil. Diese Inhibitoren gehören chemisch in die Klasse der Oligo- oder Polysaccharide bzw. deren Derivate.

In den genannten Patentanmeldungen, z. B. in den Beispielen 28 bis 38 der genannten deutschen Patentanmeldung, wird die Gewinnung eines derartigen Amylase-lnhibitors aus dem zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Actinoplanaceen-Stamm SE 50 beschrieben.

Die Kulturlösungen des Stammes SE 50 besitzen oft auch eine geringe saccharaseinhibitorische Wirksamkeit.

Die Gewinnung und Reindarstellung des gebildeten Saccharase-Inhibitors wird jedoch sehr stark erschwert durch das Vorhandensein erheblicher Amylase-Inhibitor-Mengen in der Kulturlösung. $0

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.

Bei den Verfahren gelingt es, die Bildung von Amylase-Inhibitor zu vermindern bei gleichzeitiger Förderung der Bildung von Saccharase-Inhibitor. Diese Effekte werden durch die folgenden Maßnahmen erreicht, die erfindungsgemäß entweder einzeln oder miteinander kombiniert angewandt werden:

1. Man verwendet eine stärkefreie Nährlösung (Anspruch 2).

2. Man fügt Maltose zur Nährlösung zu (Anspruch

3).

3. Man bricht die Kultur kurz vor oder beim Erreichen eines optimalen Gehaltes an Saccharase-Inhibitor ab (Anspruch 4).

Ad 1. Die Nährlösungen müssen stärkefrei sein. Man erhält so nach Optimierung Nährlösungen, z. B. der Zusammensetzung 33% Glucose, 0,5% Casembydrolysat, 1,3% Hefe-Extrakt, 0,3% KjHPO₁, 0,3% CaCO₃ (pH mit KOH vor Sterilisation auf 7,8 eingestellt), die nach mehrtägiger Fermentation mit dem zur Ordnung Actinomycetales gehörenden Actinoplanaceen-Stamm SE 50, der im Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Niederlande, unter der Nr. CBS 961,70 hinterlegt wurde, Kulturbrühen ergeben, die über 10 SIE/ml enthalten. Bei einem Gehalt von 300—700 AIE/ml (Amylase-Inhibitor-Einheiten) ergibt sich ein SIE/AIE-Verhältnis von 15 χ 10-3-30 χ 10 -γ/WSIE/AIEx 10³).
Ad 2. Man kann die Produktion von Saccharase-Inhibitor noch erhöhen, wenn man der Nährlösung Maltose zusetzt. Gibt man z. B. in oben erwähnte Nährlösung 1,5% Maltose, so erhält man Kulturbrühen mit einem Gehalt von z. B. 16 -18, ja bis zu 24SIE/mI.

Ad 3. Entscheidend wird das SIE/AIE-Verhältnis durch die Dauer der Kultur beeinflußt. Bricht man die Kultur kurz vor oder gerade beim Erreichen des maximalen SIE-Gehaltcs ab, was je nach Beimpfung schon bei 1,5- bis 2tägiger Fermentation der Fall sein kann, so erhält man /-Werte bis zu 180.

Anstelle des Stammes SE 50 können erfindungsgemäß auch dessen Mutanten, z. B. der Stamm SE 50/13 (CBS-Nr.614.71), verwendet werden (Anspruch 5).

Die Gewinnung des saccharaseinhibierenden Prinzips aus den entsprechend fermentierten Kulturlösungen geschieht entweder durch Konzentration der Kulturbrühen im Vakuum auf V10 —'/» des ursprünglichen Volumens mit anschließender Lyophilisation oder durch Fällung der konzentrierten Lösungen mit 4—10 Volumenteilen organischen Lösungsmittels wie Alkoholen bzw. Ketonen, vorzugsweise mit 5 -9 Volumenteilen Aceton, oder besonders einfach durch Adsorption des inhibierenden Prinzips aus der neutralen Kulturlösung an 0,5—4%, vorzugsweise 1—2%, Aktivkohle und anschließende Desorption mit wäßrigen Alkoholen oder Aceton besonders bei sauren pH-Werten, vorzugsweise mit 50%igem Aceton bei pH 2—3. Das Desorbat wird anschließend im Vakuum auf '/so— V200, vorzugsweise Vixi, des Ausgangsvolumens (der Kulturlösung) eingeengt und anschließend mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton, gefällt. Allgemein wird zur Gewinnung reinerer Präparate eine Voradsorption der die Kulturlösung verunreinigenden braunen Farbstoffe an 1—2% Aktivkohle bei sauren pH-Werten (pH-Werte von 1-4, vorzugsweise 2-3) vorgenom* men, bei denen die Adsorption des Wirkstoffes überraschenderweise noch nicht in nennenswertem Umfang stattfindet.

Es ist bekannt, daß bei Tieren und Menschen nach Aufnahme von saccharosehaltigen Nahrungs- und Genußmitteln Hyperglykämien auftreten, die infolge einer raschen Spaltung der Saccharose durch Saccharasen des Verdauungstraktes nach folgendem Schema

Saccharose Succhiirasc Glucose + Fructose

bewirkt werden. Diese Hyperglykämien sind bei Diabetikern besonders stark und anhaltend ausgeprägt. Bei Adipösen bewirkt die alimentäre Hyperglykämie oftmals eine besonders starke Insulinsekretion, die ihrerseits zu vermehrtem Fettaufbau und vermindertem Fettabbau führt.

Die nach obigen Methoden gewonnenen und isolierten Saccharase-Jnhibitoren vermindern die alimentäre Hyperglykämie und Hyperinsulinämie nach Belastung von Ratten mit Saccharose erheblich.

Weiter ist bekannt, daß Karies nach Genuß von saccharosehaltigen GenuB- und Nahrungsmitteln besonders stark und häufig vorkommt (z, B. W, Gold: Advances in Applied Microbiology II [1969] 135 — 157). Eine Hemmung der Saccharosespaltung durch die erfindungsgemäßen Inhibitoren vermindert die Bildung kariogener Stoffe.

Diese Inhibitoren eignen sich deshalb als Therapeuticum für die folgenden Indikationen:

Adipositas, Hyperlipämie (Atherosklerose), Diabetes, Prädiabetes, Karies.
Dosierung:

100-10 000 SIE ein oder mehrmals täglich vor und/oder während und/oder nach den Mahlzeiten p. os.
Zubereitungsformen:

Tablette, Dragee, Kapsel, Lösung, Suspension, Granulat, Kaugummi, Zahnpasta und ais Zusatz zu saccharosehaltigen Lebens- und/oder Genußmitteln.

Amylasetest

Eine Amylase-Inhibitor-Einheit (I AIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Amylaseeinheiten zu 50% inhibieren. Eine Amylaseeinheit(AE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedi^gungen 1 μ Äquivalent glucosidischer Bindungen in der Stärke spa'tet Die jttVal gespalteten Bindungen werden als /tVal gebildeter reduzierender Zucker mit Dinitrosaücylsäqre kolorimetrisch bestimmt und mit Hilfe einer Mahoseeichkurve als μ VaI Maltoseäquivalente angegeben. Zur Durchführung des Testes werden 0,1 ml Amylaselösung (20 — 22 AE/ml) mit 0-10 μg Inhibitor oder 0-20 μg der zu testenden Lösung in 0,4 ml 0,02 m Natriumglycerophosphatpuffer/0,001 m CaCI₂ pH 6,9 versetzt und etwa 10 — 20 Minuten in einem Wasserbad von 35° C äquilibriert Dann wird 5 Minuten mit 0,5 ml einer auf 35°C vorgewärmten 1% Stärkelösung (Stärke, löslich, der Firma Merck, Darmstadt, Nr. 1252) bei 35°C inkubiert und anschließend mit I ml Dinitrosalicylsäure-Reagens (nach P. Bern feld in Colowick-Kaplan, Meth. EnzymoU Band 1, Seite 149) versetzt. Zur Farbentwicklung wird der Ansatz 5 Minuten auf dem siedenden Wasserbad erhitzt, dann abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Die Extinktion bei 540 nm wird gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert ohne Amylase gemessen. Zur Auswertung wird aus einer vorher aufgenommenen Amylaseeichkurve die nach Inhibitorzusatz noch wirksame Amylaseaktivität abgelesen und daraus die prozentuale Hemmung der eingesetzten Amylase errechnet. Die prozentuale Hemmung wird als Funktion des Quotienten

[ig Inhibitor⁺

Saccharasetest

Eine Saccharase-Inhibitor-Einheit (SIE) ist definiert als die Menge Inhibitor, die zwei Saccharaseeinheiten zu

50% inhibieren. Eine Saccharaseeinheit (SE) ist die Menge an Enzym, die in einer Minute unter den unten angegebenen Testbedingungen 1 μΜοΙ Saccharose in Glucose und Fructose spaltet Die ^aMoI gebildete Glucose wird mit Hilfe der Glucoseoxidasereakthn

ίο quantitativ bestimmt unter Bedingungen, bei denen eine weitere Saccharosespaltung durch die Saccharase nicht mehr stattfindet Zur Durchführung des Testes werden 0,05 ml einer auf 0,12 SE eingestellten Saccharaselösung¹) mit 0-20 μg Inhibitor oder 0—20 μΐ der zu testenden Lösung versetzt und mit 0,1 m Natriummaleinatpulier pH 6,0 auf 0,1 ml aufgefüllt Es wird 10 Minuten bei 35° C äquilibriert und dann mit 0,1 ml einer auf 35°C vorgewärmten 0,05 m Saccharoselösung in 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6,0 versetzt Man inkubiert 20 Minuten bei 35° C und stoppt die Saccharasereaktion durch Zugabe von I ml Glucoseoxidasereagens²) ab und inkubiert weitere 30 Minuten bei 35° C Danach wird 1 ml 50% H₂SO₄ zugesetzt und bei 545 nm gegen einen entsprechenden Leerwert gemessen. Zur Auswertung wird die prozentuale Hemmung der eingesetzten Saccharase berechnet und aus dem 50% Hemmpunkt mit Hilfe einer Glucoseeichkurve auf SIE/g bzw. SIE/Liter umgerechnet.

1) Solubilisierte Saccharase aus Schweinedünndarmmucosa nach B. Borgström, A. Dahlquist,ActaChem.Scand. 12 (1958), Seite 1997. Mit 0,1 m Natriummaleinatpuffer pH 6 auf entsprechenden SE-Gehalt verdünnt.

2) Das Glucoseoxidasereagens wird durch Lösen von 2 mg Glucoseoxidase in 100 ml 0,565 m Tris-HCI-Puffer pH 7 und anschließenden Zusatz von 1 ml Detergenslösung (2 g Triton 100+8g 95% Äthanol p.a.), 1 ml Dianisidinlösung (260mg o-Dianisidin 2 HCI in 20 ml H₂O) und 0,5 ml 0,1 %iger wäßriger Peroxidaselösung hergestellt.

«₀ Beispiel!

Beimpft man l-Liter-Erlenmeyerkolbem mit 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3,5% Glucose, 0,5% Caseinhydrolysat, 13% Hefe-Extrakt, 03% CaCO₃, 03% K₂HPO₄, pH vor der Sterilisation mit KOH auf 7,8 eingestellt und 30 Minuten bei 121°C sterilisiert, mit 4 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes CBS 961.70 in einer Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glycerin, 3% Sojamehl, 0,2% CaCOj, gewonnen durch Inkubation auf einer Rund-Schüttelmaschine bis 28⁰C, bebrütet bei 24°C, so erhält man eine Kulturbrühe, die nach 3tägiger Inkubation 9,1 SIE/ml und 240 AIE/ml und nach 4tägiger Inkubation 10,4 SIE/ml und 675 AIE/ml enthält.

Beispiel 2

Gibt man einer Nährlösung nach Beispiel 1 Maltose in verschiedenen Konzentrationen zu, beimpft und inkubiert nach Beispiel 1, so erhält man folgende Ausbeuten an SIE/ml und AIE/ml:

55

"" bezogen auf Trockensubstanz.
^{f f} AE im nicht inhibierten Ansatz der gleichen
Serie.

aufgetragen, der 50% Hemmungspunkt aus der Kurve abgelesen und auf AIE/rng Inhibitor umgerechnet.

Maliose-	Nach 3	Tagen	Nach 5	Tagen
konzcn-
tration	AIE/ml	SIE/ml	AIE/ml	SIE/ml
0	363	11,2	444	8,8
0,5	479	12,7	614	11.3

Fortsetzung

Maltosekonzen
tration A IE/ml

Nach 3 Tagen

SIE/ml

Nach 5 Tagen
AIE/ml SIH/ml

1,0	383	13,6	688	12,5
1,3	337	15,7	725	12,7
1,8	274	16,6	678	14,4
2,2	287	16,8	600	15,5

IO

Beispiel 3

Beimpft und bebrütet man eine Nährlösung nach Beispiel 1, die zusätzlich 13% Mallose enthält so erhält man eine Kulturbrühe, die nach 2tägiger Fermentation 14,4 SIE/ml und 81 AIE/ml und nach 4tägiger Fermentation 143 SIE/ml und 580 AIE/ml enthält

Beispie! 4

Beimpft man 1-Liter-ErlenmeyerkoIben, die 120 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glucose, 1% Maltose, 03% Caseinhydrolysat, 13% Hefe-Extrakt, 03% CaCO₃, 03% K₂HPO₄, pH vor der Sterilisation mit Na₂CO₃ auf 7,2 eingestellt und 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert, mit 4 ml einer 3 Tage alten Vorkultur des Stammes CBS 961.70 in einer Nährlösung der Zusammensetzung 3% Glycerin, 3% Sojamehl, 0,2% CaCO₃, gewonnen durch Inkubation auf einer Rundschüttelmaschine bis 28° C, bebrütet bei 24⁰C, so erhält man eine Kulturbrühe, die nach 4tägiger Inkubation 22 SIE/ml und 500 AIE/ml enthält.

Beispiel 5

35

500 ml einer nach Beispiel 4 fermentierten braunen Kulturlösung mit 22 000 SI E/Liter wurde mit halbkonz. HNO₃ auf pH 23 eingestellt und mit 5 g Aktivkohle versetzt und 10 Minuten gerührt. Man zentrifugierte 15 Minuten bei 10 000 UpM und neutralisierte den klaren gelben Überstand mit Ammoniak. Danach wurde am Rotationsverdampfer bei 20 Torr auf 50 ml einrotiert und diese konzentrierte Lösung mit 50 ml Aceton zur Ausfällung inaktiver Anteile versetzt. Das klare Filtrat wurde in 400 ml Aceton unter Rühren eingetropft und der ausfallende Niederschlag auf einer Nutsche gesammelt, mit Aceton und Äther gewaschen und im

Tabelle 1 zu Beispiel
(Aktivitätsausbeuten der Aufarbeitung)

Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet

Ausbeute: 1,4 g mit 6000 SlE/g=70% Ausbeute, bezogen auf Aktivität

Beispiel 6

500 ml einer nach Beispiel 4 fermentierten Kulturlösung mit 22 000 SIE/Liter wurden nach Beispiel 5 aufgearbeitet, jedoch nicht mit Aceton, sondern mit Äthanol gefällt

Ausbeute: 0,6 g mit 7000 SIE/g=38% Ausbeute, bezogen auf Aktivität.

Beispiel 7

1 Liter einer analog Beispiel 4 fermentierten dunkelbraunen Kulturlösung (21 000 SIE/Liter) wurde mit halbkonz. Salpetersäure auf pH 23 eingestellt, mit 10 g Aktivkohle und 10 g des Filterhilfsmittels Clarcell versetzt und 10 Minuten gerührt. Man saugte über eine mit einer 1—2 cm hohen Clarcellschicht versehene Nutsche ab und neutralisierte dua Filtrat mit Ammoniak. Der Filterkuchen wurde verworfen. Zum neutralen Filtrat (19 000 SIE/Liter) wurde 13% Aktivkohle zugesetzt und 10 Minuten gerührt danach erneut abgenutscht. Das Filtrat enthielt noch ca. 10% der Aktivität und wurde verworfen.(Soll diese Restaktivität mitgenommen werden, so adsorbiert man nochmals mit 0,5% Aktivkohle und vereint die Kohlerückstände.) Der die Saccharaseaktivität enthaltende Kohlerückstand wurde mit wenig Wasser gewaschen und anschließend 3mal mit je 50 ml 50%igem Aceton pH 23 (HCl) zur Desorption der Aktivität 10 Minuten gerührt Danach wurde jedesmal abgenutscht und die drei Desorbate vereinigt Man engte im Rotationsverdampfer auf 10 ml ein und versetzte das zähflüssige Konzentrat mit dem gleichen Volumen (10 ml) Methanol unter Rühren. Der ausgefallene Niederschlag wurde abzentrifugiert Die klare, gelbbraune, 50% methanolische Lösung wurde dann in 250 ml (= 12,5 Vol.) absolutes Aoeton unter Rühren eingetropft. Der ausfallende Niederschlag setzte sich gut ab, er wurde nach dem Abdekantieren des tiefgelben Überstandes mit absolutem Aceton aufgenommen und gewaschen. Es wurde abgenutscht und noch je einmal mit absolutem Aceton und Äther nachgewaschen. Anschließend wurde im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet

Ausbeute: 850 mg mit 12 500 SIE/g=51% Ausbeute (bezogen auf Einheiten in der Kulturbrühe).

Aufarbritungsschritl	Volumen	SIE/L	A!E/f-	χ 10'	SIE	SIE-Ausbculc	81	72
				42		(%)		63
1) Originallösung	1 000 ml	2!000	0,5 X 106	48	21 000	100
2) nach 1. Aktivkohle-	1000 ml	19 000	0,4 X IO6		19 000	90
Adsorp. (pH 2,5)
3) nach 2. Aktiv-kohle-	I 000 ml	2 000			2 000	(verworfen:
Adsorp. (pH 7,0)				75		10%)
4) I. Desorbat	45 ml	260 000	3,5 X 10''	46	11 500	55
5) 2. Desorbat	45 ml	92 000	2 x 10"	40	100	19,5
6) 3. Desorbat	45 ml	30 000	0,75 x 10"	68	350	6.5
7) Hinroticrt auf 10 ml	10 ml	1 500000	22 x 10"	61	15 000
8) 50% Methanolfiillung	18 ml	730 000	12 x 10"		13 200
(filtriert)

oilset/iiML'

Aiiliirhciliingssi'hriM Volumen SII /I All /I / V/l S"' SIL-Aushculc

9) Überstand der 260 ml 8 400 2 200 (vcrworl'cn:

Aectonlallung 10%)

10) Niederschlag 0.85 g 12 500/g 0.22 x 10'·/.. 56 10 6(K) 51

Dosierung. Die Blutglucose und das Seruminsulir

Versuch werden in den angegebenen Zeitintervallen nacr

Versuchsanordnungen zum Wirkungsnachweis von Saccharoseapplikation untersucht. Die Blutproben wer

Saccharase-Inhibitoren an Ratten. ι; den aus dem retroorbitalen Venenplexus gewonnen

Zur Erzeugung einer alimentären Hyperglykämie und Blutglucose wird im Auto-Analyzer (H of f m a η : J

Hyperinsulinämie erhalten nüchterne Ratten (η =6) 2,5 biol. Chem. 120, 51 [1937]), Seruminsulin nach der

g/kg Saccharose p. os. 6 andere Ratten erhalten Methode von H λ I ρ ? und Rändle: Biochcrrs. J. SS

zusätzlich zur Saccharose den Saccharase-Inhibitor, 137(1963)bestimmt, hergestellt analog Beispiel 5. in der angegebenen m

Tabelle I /um Versuch

Durchschnittliche Blutgliicosewerle in my/K)OmI ± Is von nüchternen Ratten /u verschiedenen Zeiten nach oraler Gabe von Saccharose + Wirkstoff analog Beispiel 5.

I)osfsZkiz p. os

II)	7 1	20	4.6	30	± 5.3	M)	±	5.0	120	Min.
67 ±	15	72 ±	16	68	± 12	66	+	20	71	± iJ
134 ±	4.4	140 ±	6.2	126	+ 5.6	117	+	3,4	103	± 3.0
96 ±	93 ±	92	92		95	± 12

Kontrolle ohne Saccharose

Kontrolle mit Saccharose

100 SU: in Saccharose

P < 0.05 P ·- 0.(K)I gegen Kontrolle mit Saccharose.

Tabelle 2 /um Versuch

Durchschnittliche Seruminsulinwcrtc in y.Ii/ml ± Is von nüchternen Ratten zu verschiedenen Zeilen nach oraler (iahe von Saccharose ± Wirkslofl analog Beispiel 5.

k^ p. os IO 20 30 60 120 Min.

Kontrolle ohne Saccharose
Kontrolle mit Saccharose
100 SII- in Saccharose

-- P < 0.05

8.x	+	1.8	9,8	± 1	.4	10,8 ±	IJ	10.7 ±	4.6	8.1	+	0,/
22.2	+	11	35,3	± 14		19.3 ±	5.0	16.7 ±	5.3	8.1	+	1.1
9,9		4.3	11,1	± 3	,5	7,6 ±	1.7	14.8 ±	3.8	10.2	+	2.8
0 01			P<	0.001	gegen Kontrolle	mit	Saccharose

Claims (5)

Patentansprüche;

1. Verwendung des Actinoplanaceen-Stammes CBS 961.70 sowie seiner Mutanten zur Herstellung von Saccharase-Inhibitorea

2. Verfahren zur Herstellung von Saccharase-Inhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man den Actinoplanaceen-Stamm CBS 961.70 oder seine Mutanten in einem stärkefreien Nährmedium kultiviert und aus dem Nährmedium die Inhibitoren nach an sich bekannten Methoden gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium Maltose zusetzt

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur kurz vor oder beim Erreichen eines optimalen Gehaltes an Saccharase-Inhibitor abbricht

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mutante den Stamm CBS 614.71 einsetzt.