DE2102793A1 - Verfahren zur Herstellung von L 3 4 Dihydroxyphenylalanin durch Fermentation - Google Patents

Description

Dr, F. Zumst©!n sen. - Df. E. Assmann -

Dr. R. Koonisc'.=r;:3r - Dip'- r'*ys. Π.HoUbauer 0 1 0 2 7 9 O

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SC 5667

RHONE-POULSNC S.A., Paris, Frankreich

Verfahren zur Herstellung von L-J5,4-Dihydroxyphenyl

alanin durch Fermentation

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-ß^(3,4-Dihydroxyphenyl)-a-alanin oder "L-DOPA" durch mikrobiologische Umwandlung von Tyrosin.

Es ist bekannt, dass L-DOPA ein Produkt des Metabolismus von L-Tyrosin beim Menschen und bei den Tieren ist. Es gibt auch bei den. höheren Pilzen und bei den Pflanzen Tyrosinasen, die L-Tyrosin über L-DOPA in Melaninpigmente überführen.

Die Mikroorganismen verwerten im allgemeinen Tyrosin in einer voll ständig anderen Weise. Larway und Evans (Biochem. &), 22P, I962) haben jedoch das Schwarzpigment analysiert, das sich in den Kulturen von in Anwesenheit von Tyrosin entwickelter Microspira tyrosinatica bildet, und gezeigt, dass dieses Pigment DOPA enthält. Iji. der Folgezeit wurde festgestellt (Aronson und Vickers, Biochim. Btophys» Acta 110, 624, I965), dass wasserlösliche Extrakte von Bacillus cereus T eine Tyrosinase enthalten, die Tyrosin und Metatyrosin in DOPA umwandeln können. Schliesslich haben SIH und Mit-

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arb. (J. Am. Chem. Soc. <J1_, 6204, 1969) eine Herstellung von L-DOPA durch Oxydation von L-Tyrosin (nach Blockierung der Aminfunl:- tion mit verschiedenen Gruppen) mit Hilfe verschiedener Mikroorganismen, darunter Gliocladium deliquescens, beschrieben.

Es wurde nun gefunden, dass Vibrio tyrosinaticus ATCC 19«278 befähigt ist, in Submerskultur beträchtliche Mengen an L-Tyrosin mit ~erhöhter Ausbeute in L-DOPA überzuführen. Man kann so eine wirtschaftliche Produktion dieser Substanz erreichen.

Bei der Durchführung des Verfahrens ist es nicht erforderlich, die Mikroorganismen abzutrennen, um daraus die enzymatischen Systeme zu extrahieren, was im allgemeinen in grossem Massstab schwer durchführbar ist.

Die Umwandlung von L-Tyrosin in L-DOPA durch Vibrio tyrosinatieus erfolgt bei verschiedenen pH-Werten. Man erhält üblicherweise die höchsten Umwandlungsausbeuten bei pH-Werten von 4,0 bis 7*0 und vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 5,5·

Da das pH-Optimum für die Umwandlung mit einer guten Entwicklung des Mikroorganismus nicht vereinbar ist, 1st es bevorzugt, dass die Kultur in zwei Stufen erfolgt. In der ersten Stufelässt man Vibrio tyrosinaticus ATCC 19O7Ö sich in einem geeigneten Nährmedium, dessen pH-Wert über 6,0 liegt* entwickeln. In der zweiten Stufe erfolgt die Zugabe und die Umwandlung des Tyrosine, gegebenenfalls nach Korrektion des pH-Werts der Kultur, damit sich diese in dem günstigsten Gebiet befindet.

Die Züchtung von Vibrio tyrosinaticus ATCC 19.378 kann nach Jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submerszüchtungsmethode erfolgen, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit iu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermente tionsindus trie verwendet werden·

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der

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Arbeitsgänge einschlagen:

Vibrio tyrosinaticus ATCC 19*578

Kultur auf Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium kann variieren, doch sollte es im wesentliehen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke, oder Zuckeralkohole, wie beispielsweise Glycerin, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Melassen, verwenden· Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind ausserordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder gewisse Aminosäuren, sein· Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten,zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalburain, Gluten und deren Hydrolysaten, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers* Solubles und Maisquellwasser·

Unter dsn zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine

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Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- und Magnesiumcarbonate

Andere führen zudem zur Entwicklung des Vibrio tyrosinaticus ATCC 19*378 erforderlichen Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schliesslich wirken gewisse in speziellerer Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Vibrio tyrosinaticus. Es sind dies die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze«

Der pH-Wert des Fermentationsmediums sollte zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7*8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7»5* liegen.

Das so hergestellte Züchtungsmedium wird mit einer Impfkultur des Stammes Vibrio tyrosinaticus ATCC 19·378 in flüssigem Medium beimpft, und die Kultur wird bei einer Temperatur zwischen 22 und 37⁰C und vorzugsweise bei 25 bis 26⁰C unter Bewegen und Belüftung inkubiert. Die Belüftung der Fermentation kann zwischen ziemlich weiten Worten variieren. Es wurde jedoch gefunden, dass Belüftungen von 0,3 bis 3 Liter Luft je Liter Bouillon und je Minute besonders gut Reeiff.net Rind.

In der zweiten Stufe, in deren Verlauf die Synthese des L-DOPA stattfindet, setzt man zu der Kultur L-Tyrosin handelsüblicher Qualität in Merken, die von 0,1 bis I5 g/l betragen und vorzugswei· se zwischen. 3 und 10 £/'] liegen, zu. Diese Zugabe in fester Form oder in Fora einer I ^;<r-unp kann zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlaufe -ier Züchtung vorgenommen wej'den, erfolgt jedoch vorzugsweise nach einer entcn Phase (Inkubation) von 16 bis 2.k Stunden. I;ie Verwendung vor. SZvr\>n oder Basen zur Auflösung des Tyrosine ermöglicht, verha.; ti.inuäsnig konzentrierte Lösungen desselben zu erhallen. Hs jet vorteilhaft, gleichzeitig eine Lösung von Tyrosin in 8nl:*cä<ire und fne Lösung von Tyrosin in Natronlauge zu "verwenden, um diese ;Vopa"fe vorzunehmen, da ein geeignetes Verhältnis Mer beide:; L"i?unp. ί <·ι^ö^licht, gleichzeitig die gewünschte Ί':;ν·

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BAD ORIGINAL

sinmenge in der Kultur und die Korrektion des pH-Werts ohne merkliche Erhöhung der Menge des Mediums an Mineralsalzen zu erhalten.

Nach dieser Zugabe ist es, gleichgültig zu welchem Zeitpunkt und in welcher Menge das Tyrosin zugegeben wird, zweckmässig,die Kultur noch 1 bis 2 Tage unter den gleichen Bedingungen bezüglich des Bewegens und der Temperatur fortzusetzen, um die maximale Produktion an L-DOPA zu erhalten»

Es kann vorteilhaft sein, den Kulturen zu Beginn der Umwandlungsstufe, d.h. gleich nach der Zugabe des Tyrosins, Glucose (2 bis 20 g/l) zuzusetzen, deren Metabolismus gleichzeitig dem Mikroorganismus Energie liefert und ein Mittel zur Steuerung des pH-Werts der Kultur unter Vermeidung einer Entwicklung über 6,0, die für die Umwandlung des Tyrosins und für die Stabilität des bereits gebildeten L-DOPA ungünstig ist, bietet.

Es kann vorteilhaft sein, die Umwandlung des L-Tyrosins in L-DOPA in Anwesenheit von Ascorbinsäure vorzunehmen.

Die Ascorbinsäure wird im allgemeinen nach der Entwicklungsstufe des Mikroorganismus entweder vor oder während oder nach der Zugabe des L-Tyrosins zugegeben. Sie ermöglicht, wertvolle Ausbeuten zu erhalten, selbst wenn der pH-Wert im Verlaufe der Umwandlungsstufe zwischen 6 und 7 beträgt. Unter diesen Bedingungen ist es im allgemeinen nicht mehr erforderlich, den pH-Wert des Kulturmediums vor der Durchführung der Umwandlung des L-Tyrosins in L-DOPA einzustellen.

Die einmal oder mehrere Male zugesetzte Ascorbinsäure wird in Konzentrationen zwischen 1 und 5 g/l verwendet.

Sehliesslich wird die Umwandlung durch die folgenden Zusätze günstig beeinflusst:

BAOORlG₁NAt

Kupfersalze (1 bis 10 mg/l)

Antioxydantien, wie beispielsweise Sorbinsäure, N,N¹-Diphenyl-pphenylendiamin, 2- (und 3-)tert.-Butyl-4-wethoxyphenol, 2,6-Ditert.-butyl-p-cresol und insbesondere 2,2,4-Trimethyl-6-äthoxy-1,2-dihydrochinolin in einer Menge von 0,1 bis 1 g/l.

_Die Extraktion des L-DOPA aus der Fermentationsmaische kann in bekannter Weise vorgenommen werden. Die Maische wird beispielsweise nach Ansäuern auf pH 2 durch Filtrieren oder Zentrifugieren geklärt. Das L-DOPA kann dann aufeinanderfolgend an einem Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäure-Typ nach der von L.E. Martin und C. Harisson (Anal. Biochem. 2J3, 529, I968) beschriebenen Technik und an Aluminiumoxyd in Anwesenheit von Äthylendiaminotetraessigsäure und Natriurnmetabisulfit nach der Methode von A.H. Anton und D.E. Sayre (J. Pharmacol. Exp. Therap. 145, 226, 1964) zurückgehalten werden. Das an dem Aluminiurnoxyd fixierte L-DOPA kann mit einer Oxalsäurelösung eluiert und durch Umkristallisation nach Entfernung der Oxalsäure gereinigt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

In einen 30 1-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:

Hefeextrakt 4-0 g

Pepton 80 g

Fleischextrakt 80 g

Glucose-monohydrat I60 g

Natriumchlorid 80 g

Leitungswasser ad 17 1

Der pH-Wert wird durch Zugabe von 22 cmr 10n-Nat ronlauge auf 7,5 eingestellt. Man sterilisiert das Medium während 40 Minuten bei 122°C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 16 Liter und der pH-Wert 6,95. Man beimpft dann mit 200 cnr einer gerührten bzw.

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Geschüttelten Srlonm-syer-Kultur von Vibrio tyrosinaticus ATCC 19·370. Die Kultur wird bei 26⁰C während 1(5 Stunden unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Durchführung d<>r gewünschten Umwandlung geeignet. Diese wird bei pH 5 .»3 durchgeführt. Man stellt daher den pH-Wert der Kultur durch Zugabe einer sterilen 2,4n-Salzsäurelösung auf diesen Viert ein und setzt 04 g Tyrosin in Form von zwei sterilen Lösungen des gleichen Volumens zu, von denen die eine eine 20 J^ige Lösung in 2,4n-Salz~ säure und die andere eine 20 ^ige Lösung in 2,4n-Natronlauge ist. Man setzt noch 350 cm einer sterilen Lösung mit einem Gehalt von 100 g Glucose-monohydrat zu und setzt die Züchtung 27 Stunden fort, wobei man erforderlichenfalls den pH-Wert korrigiert, um ihn bei 5,3 zu halten. Das Endvolumen beträgt 14 Liter und der Gehalt an L-DOPA 3,0 g/l.

Die Bestimmung des L-DOPA wird mit dem Piltrat der Fermentationsmaischo bei pH 2 nach der von L.E. Arnow (J. Biol. Chem. 118, 531, 1937) beschriebenen Methode durchgeführt. Die Bestimmung der erhaltenen Färbung erfolgt mit einem Spektrophotometer gegenüber einer reinen Probe- von L-DOF-A. Man prüft die Richtigkeit dieser Bestimmung (nicht spezifisch für L-DOPA) durch Dünnschichtchromatographie des Filtrate an Cellulose in den Lösungsmittelsystemen Propanöl-Wasser (7:3 Volumina) oder lßcpropanol-0,In-HCl (5ί1 Volumina) und spektrenhotoinetrischer !Bewertung des L-DOPA nach Entwicklung mit Kaliumforricyanid und A'thyüendiamin. Die nach diesen beiden Methode:: erhaltenen Gohalte stimmen gut überein.

Ioispiel 2

Γ aiii.- Fraktion (1,1* 1) der in Beispiel 1 beschriebenen Umwand lungskalter Kit einer:? Gehalt von S^ β L-J)OΓΑ wird rait 50 ckt⁵ 12ii-Salzr'Iui'fi -iX-ΐΓ pH 2 sm:i'Dä'-pv uni zentj i i'nr.i ert e 3>ie gewonnene überstei:ende Flüssigkeit wird so, v;te sie i$⁴>-, durch eine Säule, (Durchmesser: 7j5 om, H^;liei <^:·~ ·μπ) ν >::■ Ha::: Y■■-*<*;■%_ ^O V.'-X 2 in saurer Form ( Harz auf der B.'jsifr von Vi lyztyi* is;:lfon;-äure mit 2 <ί Divinylliinrol mit eiiK-in GthaJt v>m O₁^ I'j .13 ihquiv;:· It nt/ml un ^; '...3 MiI-3 i äquivalent-/g, b*:-/r^r.n auf Tj οίο .n-:\r: ) π -leitet, Bau fixierte

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BAD ORIGfNAU

L-DOPA wird mit 2n-Sälzsäure eluiert. Das Eluat (5,2 1), das noch kleine Mengen nichtumgewandeltes Tyrosin enthält, wird gereinigt, indem sein pH-Wert durch Zugabe von 800 cnr Natronlauge (d « 1,33) auf 4,0 eingestellt wird und 250 g Aluminiumoxyd, 5 ß Natriummetabisulfit und 5 g Äthylendiaminotetraessigsäure in Form des Dinatriumsalzes zugegeben werden. Das Gemisch wird gerührt, durch Zugabe von 200 cm konzentrierter Natronlauge (d « 1,23) ^auf einen pH-Wert von 8,6 gebracht und dann 15 Minuten stehengelassen. Man trennt das Aluminiumoxyd durch Filtrieren ab und wäscht es mehrere Male mit insgesamt 3 1 destilliertem Wasser. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten, die das Tyrosin enthalten, werden verworfen, während das IrDOPA durch Behandlung des Aluminuumoxyds mit 2,2 1 2n-0xalsäure gewonnen wird. Die Oxalsäurelösung wird unter vermindertem Druck (30 mm Hg) durch Erhitzen auf einem siedenden Wasserbad auf 0,7 1 eingeengt. Man entfernt durch Filtrieren die auskristallisierte Oxalsäure» Das Filtrat wird anschliessend mit 3*7 1 Äthylalkohol behandelt. Der pH-Wert wird mit 150 cnr Natronlauge (d = 1,33) auf 5*5 eingestellt, um die Mineralsalze auszufällen. Man vervollständigt die Ausfällung, indem man noch 3*7 1 Aceton zusetzt. Der gebildete Niederschlag wird sogleich abflltiert, und das neue Filtrat wird unter vermindertem Druck (30 mm Hg) durch Erhitzen auf einem siedenden Wasserbad auf 0,8 1 eingeengt. Man beendet das Einengen bei normalem Druck unter Stickstoffatmosphäre, indem man mittels eines Paraffinbads erhitzt, um 70 cnr einer Lösung zu erhalten, aus der man nach 10-stündigera Stehenlassen bei 4*C 2,54 g rohes L-DOPA isoliert. Durch Einengen der Kristallisationsmutterlaugen erhält man noch 0,65 g Kristalle.

Das gesamte Rohprodukt wird durch Umkristallisation aus Wasser nach Entfärbung der wässrigen Lösung mit einer Aktivkohle gereinigt. Man erhält so 2,65 g kristallisiertes L-DOPA in einer Ausbeute von 49 %, bezogen auf das in öer Feraentationsmaisehe bestimmte Produkt; Ul^⁰- - 16,4 + 0,8* (ö - 1 % In 0,In-HCl).

Das an Cellulose in Dünnschicht mit dem System Propanol-3n-HCl (70:30 Volumina) chromatogrmptiierte und Bit a-Kitroso-ß-napnthol

ν 1Q8S31/2133 BADORJGfNAL

entwickelte Produkt [vgl. R. Acher und C. Crocker, Biochim. Biophys. Acta JJ, 704 (1952)] erweist sich als frei von Tyrosin.

Beispiel 3

In einen 75 1-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:

Hefeextrakt 10Og

Pepton 200 g

Fleischextrakt 200 g

Natriumchlorid 200 g

Leitungswasser ad 53 1

Der pH-Wert wird durch Zugabe von 40 cnr 10n-Natronlauge auf 7 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch 40-minütiges Durchleiten von Dampf von 122⁰C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 38,5 1. Sie wird durch Zugabe von 1,5 1 einer sterilen wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 600 g Glucose-monohydrat auf 40 1 eingestellt.

Der pH-Wert beträgt 6,90. Man beimpft mit 200 cnr einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur des Stammes Vibrio tyrosinaticus ATCC 19O78. Die Kultur wird 10 Stunden bei 30⁰C unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt, bevor sie zur Beimpfung der Produktionskultur verwendet wird.

Die Produktionskultur wird in einem 800 1-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Maisquellwasser (50 # Trockenextrakt) 2,2 kg Magnesiumsulfat mit 7 HgO 0,220 kg

Leitungswasser ad 390 1

Nach Einstellen des pH-Werts auf 6,6 mit 120 cnr 1On-Natronlauge eetzt man 1,1 kg Calciumcarbonat zu und sterilisiert dann das Medium durch 40-mlnütiges Durchleiten von Dampf von 122⁰C. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 425 Liter. Sie wird durch

,..-.^ 103831/2133

Zugabe von 10 1 einer sterilen wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 4,4 kg Glucose-monohydrat und 5 1 einer sterilen wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 0,880 kg Ammonxumsulfat auf 400 1 aufgefüllt. Der pH-Wert beträgt 7.

Man beimpft mit 6 Liter der oben beschriebenen Impfkultur aus dem -75 1-Fermenter. Die Kultur wird 20 Stunden bei 30⁰C unter Bewegen mit einer Turbine, die mit 18O U/rain betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft mit einem Durchsatz von 20 nr/h entwickelt· Der pH-Wert der Kultur wird automatisch durch Zugabe von 6n-Ammoniak oder 4n-Salzsäure bei 6,6 + 0,ü;> ö—-"-^"

Nach 20 Stunden ist die Kultur zur Durchführung der gewünschten Umwandlung geeignet· Das Volumen der Maische wird auf 400 1 und der pH-Wert auf 5*5 mit 6n-Salzsäure eingestellt.

Dann bringt man 1,1 1 einer wässrigen Lösung von pH 5*5* die 215 S L-Ascorbinsäure enthält, ein und hält die Maische 2 Stunden bei 30⁰C unter Rühren mittels einer mit I80 U/min betriebenen Turbine und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 20 rir/h ?, Stunden bei 30 ⁰C.

Man bringt in die Maische erneut 1,1 1 einer wässrigen Lösung von PH 5,5, die 215 g L-Ascorbinsäure enthält, und dann 1,720 kg L-Tyrosir* in Form von zwei wässrigen Lösungen ein, von denen die eine eine 6,15 #ige Lösung in 1 η-Natronlauge und die andere eine 6,15 #ige Lösung in 1n-Salzsäure ist. Man ninmt noch drei aufeinanderfolgende Zugaben von 1,1 1 einer wässrigen Lösung von pH 5,5 mit einem Gehalt von 215 g L-Ascorbinsäure in Abständen von 1 Stunde vor. Die Kultur wird nach Beendigung dieser Zugaben 7 Stunden fortgesetzt, wobei der pH-Wert bei 5*5 gehalten wird· Das Endvolumen der Maische beträgt 430 1. Die Menge an L-DOPA macht dann 3*55 g/l aus.

Beispiel 4

Eine Kultur von Vibrio tyrosinaticus ATCC 19.378 wird unter den

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Bedingungen von Beispiel 3 hergestellt. Nach 20 Stunden ist die Kultur zur Druehführung der Umwandlung geeignet. Das Volumen der Maische wird auf 400 1 eingestellt und der pH-Wert bei 6,6 gehalten»

Man bringt dann 2,2 1 einer wässrigen Lösung von pH 6,5 mit einem Gehalt von 400 g L-Ascorbinsäure ein und hält die Maische unter Rühren mittels einer mit 18O U/min betriebenen Turbine und unter Belüftung mit steriler Luft mit einem Durchsatz von 20 nr/h 2 Stunden bei JO⁰C.

Man bringt in die Maische noch 2,2 1 einer wässrigen Lösung von pH 6,5 mit einem Gehalt von 400 g L-Ascorbinsäure und dann 1,720 kg L-Tyrosin in Form von zwei wässrigen Lösungen ein, von denen die eine eine 6,15 #ige Lösung in 1n-Natronlauge und die andere eine 6,15 #ige Lösung in 1n-Salzsäure ist.

Man nimmt anschliessend aufeinanderfolgend in einem Abstand von 1 Stunde zwei Zugaben von 1,1 1 einer wässrigen Lösung von pH 6,5* von denen Jede 200 g L-Ascorbinsäure enthält, und eine Zugabe von 2,2 1 einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 400 g L-Ascorbinsäure vor. Die Züchtung wird nach der letzten Zugabe noch 7 Stunden fortgesetzt, wobei der pH-Wert der Bouillon bei 6,6 gehalten wird.

Das Endvolumen der Maische beträgt 4j5O Liter. Die Menge an vorhandenem L-DOPA beträgt 2,79 g/l·

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Claims (6)

1. Patentansprüche

   1« Verfahren zur Herstellung von L-ß-(3>^-Dihydroxyphenyl)-aalanin (L-DOPA) durch mikrobiologische Hydroxylierung von L-Tyrosin, dadurch gekennzeichnet, dass man Vibrio tyrosinaticus ATCC 19.578 oder einen seiner Mutanten in einem belüfteten Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur zwischen 22 und 37⁰C in Anwesenheit von Tyrosin züchtet und dann das gebildete L-DOPA extrahiert und reinigt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Züchtung des Vibrio tyrosinaticus in eine Wachstumsphase bei pH 6,0 bis 7*8 und dann eine Umwandlungsphase des Tyrosins bei pH 4,0 bis 7,0 unterteilt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Tyrosin in Form von zwei Lösungen eingeführt wird, von denen eine sauer und die andere basisch ist.
4. 4. Verfahren zur Herstellung von L-DOPA nach einem der Ansprüche

   1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, dass während der Umwandlungsphase des Tyrosins Glucose zugegeben wird·
5. 5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis J>, dadurch gekennzeichnet, dass während der Umwandlungsphase des Tyrosins L-Ascorbinsäure zugegeben wird.
6. 6. Verfahren zur Herstellung von L-DOPA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Verlaufe der Umwandlungsphase des Tyrosins ein Antioxydans zugegeben wird.

   7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, dass während der Umwandlungsphase des Tyrosins Kupfersalze zugegeben werden.

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