DE2018058A1

DE2018058A1 - Glucose Isomerase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2018058A1
Application number: DE19702018058
Authority: DE
Inventors: Charles Edward Elkhart Ind Brownewell (V St A ) P
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1969-04-16
Filing date: 1970-04-15
Publication date: 1971-01-28
Also published as: DK128125B; IL34186A0; LU60734A1; JPS5538115B1; DE2018058C3; NL7005183A; US3625828A; DE2018058B2; NO128540B; GB1280396A; BE748992A; FR2043399A5; CA920077A; IT1045522B; IL34186A

Description

Miles Laboratories, Inc., 1127 Myrtle Street, Elkhart, Indiana, USA betreffend:

"Glucose-Isomerase und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Ein neues Glucose-Isomerase-Enzym, das zur Umwandlung von Glucose in Fructose geeignet ist, kann hergestellt werden, indem man eine Kultur von Streptomyces olivaceus HHEL 3583 oder dessen Mutanten in einem Medium, das geeignete Nährstoffe enthält, züchtet und dann das Enzym hieraus gewinnt.

Süße Sirupe sind weitverbreitet und werden z.B. beim Backen, bei der Herstellung von Konditoreiwaren und in der Getränkeindustrie verwendet· Diese Sirupe bestehen im allgemeinen aus Saccharose (Rohrzucker) oder Dextrose enthaltenden Produkten, die bei der Stärkehydrolyse erhalten werden, als Hauptsüßungsmittel. Wenn ein Sirup benötigt wird, der süßer ist als derjenige, der aus Saccharose erhalten wird, wird ein Invertzucker eirup verwendet. Dieser wird dutch saure Hydrolyse von Saccharose hergestellt, wobei ein Gemisch aus ungefähr 50 Ji Glucose (Dextrose) und ungefähr 50 Ji Fructose (levulose) entsteht. Während Gluooee etwa« weniger süß ist als Saccharose, ist die fructose süßer al« Saccharose, so daß die Gesästsüßt, verglichen mit Saccharose, suniamt«

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Es ist bekannt, daß Dextrose unter alkalischen Bedingungen in Fructose umgewandelt werden kann. Diese Umwandlung hat große potentielle Bedeutung für die Herstellung γοη süßem Sirup. Die alkalische Umwandlung hat jedoch keinen kommerziellen Erfolg gehabt, da die alkalische Reaktion zu einem unerwünscht hohen Gehalt von Aschen in dem entstehenden Sirup führt, der nur unwirtschaftlich au entfernen ist. Der Sirup kann, ohne daß diese Aschen entfernt wurden, nicht verwendet werden.

Man wandte sich dann der enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose zu. Es zeigte sich* daß Arten von Pseudomonas hydrophila„ Streptomyces flavovireus, Streptomyces eehinatur, Streptomaces achromogenus_s Streptomyces albus u.a. in einem geeigneten Mhrmedium gezüchtet werden konnten, wobei Enzyme gebildet wurden, die glucose-isomerase-Eigenschaften besaßen«, Diese bekannten Verfahren setzten sich jedoch kommerziell nicht durch, da entweder die Ausbeuten an Enzym während des Enzymproduktionsprozesses oder die Ausbeuten an Fructose, wenn das Enzym zut Umwandltmg von Glucose verwendet wurde, zu gering waren«,

Es hat sich jetzt gezeigt, daß ein überlegenes §lucose-Isomerase;*· Enzym erhalten werden kann« wenn man ©ine Kultur von Streptomyces olivaceus HERL 3585 oder dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das geeignete Nährstoffe enthält und dann hieraus das Enzym gewinnt. Dieses Enzym kann in guten Ausbeuten, erhalten werden und besitzt bessere Eigenschaften für die Umwandlung^on Glucose in Fructose·

Der für da»

Verfahren geeigntte Organismus

wird auf bekam te Welse als S&reptiwgr««»» olivaaeus tiezeiclanet. Der spezielle ί tamm toh. Stpoptomyc·· olivac&us, des? fmr die Herstellung der neuen Glucose-Ibox6T&A® ge^igmst iat*_fJ wurde bei de? Hortöeyn Utilization H®sssrcm akd P#T@iopaent Sivieion,

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Agricultural Research Service of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und erhielt die Nummer IiHEL 3583. Diese Kultur ist für die Öffentlichkeit unbeschränkt erhältlich.

Das erfindungsgemäSe Verfahren ist nicht nur auf die Anwendung von otreptorayces olivaceus IiRHL 3583 beschränkt, sondern natürliche und künstliche Mutanten von Streptomyces olivaceus NEIlL 3583 können ebenfalls verwendet werden. Solche Mutanten können durch bekannte Verfahren, wie Röntgen- oder Ultraviolettbestrahlung erhalten werden.

Der Streptomyces olivaceus NRRL 3583-Organismus wird auf Agarschrägen gehalten und kann in einem Medium gezüchtet werden, das geeignete Nährstoffe enthält. Das Medium enthält vorzugsweise Xylose und eine Stickstoffquelle. Günstigerweise enthält das Medium außerdem andere Kohlenhydrate und anorganische Salze. Typische Kohlenhydrate sUnd Maisstärke, Dextrose, Lactose, Milchfeststoffe, Weizenkleie u.a. Typische Stickstoff quellen sind Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren u.a. Typische anorganische Salze sind Natriumchlorid, Magnesiumsulfat u.a. Diese Kohlenhydrate, Stickstoffquellen und anorganischen Salze sind bekannt._tDie in dem Wachstumsmedium verwendete Xylose kann in gereinigter Form oder in Form eines rohen xylosehaltigen Materials vorliegen.

Der Organismus wird günstigerweise unter Bedingungen der submersen Fermentation ungefähr 20 bis ungefähr 50 h bei einer Temperatur von ungefähr 15°C bis ungefähr 35°C gezüchtet. Bei Temperaturen unterhalb ungefähr 15⁰C und bei Temperaturen oberhalb ungefähr 35°C wird die Ausbeute an dem gewünschten Enzym ziemlich niedrig. Die bevorzugte Wachstumstemperatur beträgt ungefähr 25°C bis ungefähr 35°C. Es wird günstigerweise Ataosphärendruck angewandt, aber Drucke oberhalb und unterhalb von Ataosphärendruck können gegebenenfalls

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ohne besondere Vorteile oder Nachteile angewandt werden· Der Anfangs-pH-Wert des Wachstumsmediums sollte· zwischen ungefähr €>,8 und 7*1 liegen.

Die erfindungsgemäße Glucose-Isomerase wird innerhalb der Bakterienzellen gebildet, die während ihrer Produktion wachsen. Die Zellen können von der Gärbrühe abfiltriert und direkt als Quelle für die Glucose-Isomerase verwendet werden. Wahlweise können die Zellen durch Filtration gewonnen und dann durch bekannte Verfahren aufgebrochen werden. Die entstehenden "aufgebrochenen Zellen und ihr freigesetzter Zellinhalt können als Quelle für Glucose-Isomerase verwendet werden. Außerdem können die Zellen auch z.B. durch Ultraschall oder Homogenisierungsapparate aufgebrochen und die Trümmer können durch Zentrifugation entfernt werden. Die überstehende Flüssigkeit kann direkt ale Quelle für die Glucose-Isomerase verwandet werden oder sie kann zu einem feinen Pulver für spätere Verwendung lyophilisiert werden. Das Enzym kann aus der oben beschriebenen überstehenden Flüssigkeit auch durch bekannte Ausfällmittel, wie Methanol oder Ammoniumsulfat ausgefällt werden.

Die Aktivität der erfindungegemäßen Glucose-Isomerase zur Fructoseerzeugung kann durch die folgenden beiden Bestimmungs- ' aethoden beetiamt werden.

Bestiaaungsnethode 1

Ee wurde eint 50%ige (Gew./Vol.) wäßrige Lösung von Glucose alt O,0O5a Amaoniuechlorid, O,1a Magnesiumsulfat und 0,001m Cobalteh&ÄfiÜ·.·%ϋ^* Lösung Jbeamß einen pH-Wert von 9,0. 5 al dir oben angegebenen gepufferten Glucoeelösung wurden alt 5 al einer Glucoee~IeoBer*ee-LÖoung veraiecht· Diese suletftt genannte Lösung kann «in· Suspension von ganzen Bakterien*·! len, eine ßuepeneion von auf gebrochenen Zellen oder

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die-Enzymlösung, die von den aufgebrochenen Zellen gewonnen worden ist, sein. Das oben angegebene Gemisch, wurde gut geschüttelt und 60 min auf 7°°0 erwärmt. 1 ml des entstehenden Reaktionsgemisches wurde weggenommen und mit 9 ml 0,5& Perchlorsäure vermischt. Es wurden mit Wasser weitere Verdünnungen hergestellt, wie sie notwendig waren, um eine geeignete End- · farbe zu ergeben. Zu 1 ml des entstehenden Gemisches wurde 0,2*·ml einer 1,5-gew.-%igen Lösung von Cysteinhydrochlorid zugegeben. Hierzu wurden dann 6 ml eines Gemisches von 190 ml destilliertem Wasser und 450 ml konzentrierter Schwefelsäure zugegeben. Unmittelbar darauf wurden 0,2 ml einer 0,12-gew.-%igen alkoholischen Lösung von Carbazol zugegeben. Das gesamte Gemisch wurde dann geschüttelt und 30 min bei 40⁰C stehengelassen. Die optische Dichte der entstehenden purpurroten Farbe wurde dann gemessen, wobei eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 560nm verwendet wurde. Die so erhaltenen Meßwerte für die optische Dichte wurden mit den Werten auf einer Standardkurve verglichen, auf der die Fructosekonzentration gegen die optische Dichte aufgetragen war. Der Prozentsatz von Glucose, die in Fructose umgewandelt worden war, wurde angegeben.

Bestimmungsmethode 2

Es mirde eine 62,5%ige (Gew./Vol.) wäßrige Lösung von Glucose hergestellt, indem man unter Rühren langsam 625 g wasserfreie Glucose zu 300 ml heißem destilliertem Wasser zugab. Die Lösung wurde .auf Zimmertemperatur abgekühlt und hierzu wurden 125 ml 1m wäßrige Lösung von Tris-(hydroxymetnyl)-aminomethan vom pH-Wert 8,5» 125 ml 1m wäßrige Lösung von Magnesiumsulfat und 50 ml 0,025m wäßrige LösungföSbaltchlorid zügesetzt. Das entstehende Gemisch wurde dann mit destilliertem Wasser auf 1 1 verdünnt. ^!

10 ml der oben angegebenen Glucoselösung wurden in einen 25 ml-

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Meßkolfaen gegeben. Es wurde eine ausreichende Menge des zu untersuchenden Enzyms zugegeben, um zu einer Reduktion der spezifischen Rotation von ungefähr 2,9° bis ungefähr 7»5° zu kommen, wie später beschrieben wird. Der Kolbeninhalt wurde dann mit destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt und das entstehende Gemisch wurde 2 h bei 60° stehengelassen. Die Reaktion wurde dann durch Zusatz von 1 ml einer 0,5m wäßrigen Lösung von Perchlorsäure abgebrochen. Das Gemisch wurde dann mit 15 000 UpM 20 min zentrifugiert und die optische Drehung (in Grad) der überstehenden Flüssigkeit wurde durch bekannte Verfahren bestimmt. Es wurde eine Blindprobe auf die gleiche Weise, aber ohne das Enzym, gemacht. Die optische Drehung der Blindprobe wurde ebenfalls bestimmt. Die spezifische Rotation /.~*a_7p der Probe bzw. der Blindprobe betrug 2a oder den doppelten Wert der beobachteten optischen Drehung. Die prozentuale Umwandlung von Glucose in Fructose wurde durch die folgende Formel berechnet:

Prozentuale Umwandlung = i"^aJBl±nä_Vrohe - ^~^a-⁷Probe χ

Λα 7

" Blindprobe + 92

Diese Bestimmungsmethode wurde auch angewandt, um die Aktivität in Glucose-Isomerase-Einheiten zu berechnen, wobei eine Glucose-Ieomerase-Einheit die Menge von Enzym bedeutet, die unter den angegebenen Bedingungen in 1 min 1 μ Mol Glucose in Fructose umwandelt. Die Enzymaktivität in Glucose-Isomerase-Einheiten (GIU) der untersuchten Enzymprobe wurde nach der folgenden Formel berechnet: ι

GIU/ oder ! GIUZ₁ . /^ug ee*il««te Fructose χ 0,0463

g

oder ml verwendetes Etezym

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wobei die /ug gebildete Fructoe· durch Multiplikation de· oben berechneten Werte· für die prosentualt Ölucoee-Uawendlung kit dea faktor 6,25 χ 10 bereohnet wurden.

Die Erfindung wird duroh die folgenden Beispiel« näher erläutert.

Eine Kultur Ton Streptoayoee olivaoeu· IBBL 3583 wurde in einen 250 al-Kolben gegeben, der lOOeil ein·· wäSrigen Geaiscaes', ait 1,0 % Xylose, 1,0 «S Peptone, 0,50 + fleischextrakt, 0,25 + Hefeextrakt, 0,50 Jt BatriuBOhlorid und 0,05 Jt Magnesiuaaulfat alt ein·· pH-lert γοη 6,8 bis 7,0 enthielt· All« oben angegebenen Proientgehalte sind in Gew.-/Toi· angegeben. Her ait den Bakterien geiapfte Kolbeninhalt wurd« dann auf einea hin- und hergehenden Sohüttler Bit «in«a Ausschlag von 5 ob und 176 Bewegungen pro Minute 24 h bei 3O⁰II geschüttelt, Sie Bakterlenaellen wurden Ton der entetehenden Oärbrube abfiltriert· Duroh dl« B«stia«ungaB«thod« 1 wurd· «in· Uitwandlung τοπ aindest«n· 40 % Oluoo·· in Fruotos« b«atisjit·

Beieplel 2

Bine Kultur von Streptoa/cee olivaoeue IBBl 3583 «art« unter Bühren in eia FeraantationegefäS gegeben, dae 10 1 eines wäßrigen Qeaieohee Bit 0,7 1» iylo··, 0,3 ^raffinierte Maisstärke, 1,0 ^'Peptone, 0,5 * fleieohextrakt, 0,25 f> Mefeextrakt, 0,50 «i BatriuBehlorld und 0,05 % MagneaiuBaulfat und eines pH-Wert *oa 7t0 enthielt. All· oben angegebenen Prosentwerte besieaen aloh auf Öew./Tol. Ba wurde alt 400 UpM gerührt mit luft Bit elaer Oeeeawlndigkelt von 3 Teluaina Luft pro Tolmaen Am» Mediaae in 1 Minute durehgeleitet· Mt feraentatlon wurde 24 m aal 32⁰O fortgeaetst. BIa Oarartthe wurde Bit 40 000 OpM sentrlfuglert* «b dl· BakterleaseUen absu-

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trennen. Die Zellen wurden dann gefroren und lyophilisiert. Die Aktivität des entstehenden Enzympulvers wurde durch die Bestimmungsmethode 2 bestimmt. Es ergab sich eine Aktivität von 42,6 /D Umwandlung von Glucose in Fructose.

Beispiel 3

Eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRIiL 3583 wurde in ein Fermentationsgefäß gegeben, das wie in Beispiel 2 ausgerüstet war und 10 1 des in Beispiel 2 beschriebenen Mediums enthielt. Es wurde mit 400 UpM gerührt und Luft in einer Menge von 2 l/min durchgeleitet. Die Fermentation wurde 48 h bei 21 bis 31°C fortgesetzt. Die Fermentationszellen wurden abgetrennt, in einem Homogenisator aufgebrochen und die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren entfernt. Die entstehende überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert und die Aktivität des Pulvers durch die Bestimmungsmethode bestimmt. Man erhielt 320 GIU/g.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Glucose-Isomerase ist zur Umwandlung von Glucose in Fructose unter anderen als den für die Bestimmung angewandten Bedingungen geeignet. Dies wird im folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel 4

Eine wäßrige Glucose-Lösung, die 25 Y* (Gew.-/Vol.) Glucose enthielt, wurde init einigen Bakterienzellen vermischt, die entsprechend dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren gezüchtet worden waren. Die Aktivität der Bakterienzellen wurde entsprechend Methode 2 bestimmt und die Zellen vrurden in einer Menge von 1,5 GIU pro g Glucose in der Glucose-Lösung verwandt. Man ließ das entstehende Gemisch mit einem pH-Wert von 8,0 72 h bei 60°C reagieren. Die entstehende Lösung wurde ent sprechend der Methode 2 untersucht und es zeigte sich, daß eine Umwandlung von Glucose in Fructose von 40,7 % stattgefunden hatte.

PATENTANSPRÜCHE : - 9 -

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Claims

1A-37 74-9 - 9 PATE N TA N SPRÜCHE

1) Glucose-Isomerase, die aus Streptomyces olivaceus NEIiL 3583 oder dessen Mutanten gewonnen worden ist.

2) Verfahren zur Herstellung einer Glucose-Isomerase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Kultur von Streptomyces olivaceus NRRL 3583 oder dessen Mutanten unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das geeignete Nährstoffe enthält und dann hieraus das Enzym gewinnt.

3) Verwendung der Glucose-Isomerase nach Anspruch 1 zur Herstellung von Fructose aus Glucose.

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