DE68907490T2 - Verfahren zur Herstellung von Glukose-Isomerase. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Glukose-Isomerase.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase durch Züchten von Microbacterium-Stämmen.
- Süße Sirupsorten werden beispielsweise in der Backwaren-, Süßwaren- und Getränkeindustrie in weitem Umfang eingesetzt. Diese Sirupsorten bestehen im allgemeinen aus durch Hydrolyse von Stärke erhaltenen Saccharose (Rohrzucker) oder Dextrose enthaltenden Produkten als dem Hauptsüßungsmittel. Falls ein süßerer Sirup als der aus Saccharose gewonnene benötigt wird, wird ein Invertzuckersirup verwendet. Dieser wird durch saure Hydrolyse von Saccharose hergestellt, wobei ein Gemisch von etwa 50% Glucose (Dextrose) und etwa 50% Fructose (Lävulose) gewonnen wird. Während Glucose etwas weniger süß ist als Saccharose, ist Fructose beträchtlich süßer als Saccharose, so daß die Gesamtsüße im Vergleich zu Saccharose erhöht ist.
- Es ist wohl bekannt, daß Dextrose unter alkalischen Bedingungen in Fructose umgewandelt werden kann. Der potentielle Wert dieser Umwandlung ist bei der Herstellung von süßen Sirupsorten hoch. Die alkalische Umwandlung war jedoch kommerziell nicht erfolgreich einsetzbar, da bei der alkalischen Reaktion ein unerwünscht hoher Aschegehalt im sirupprodukt gebildet wird, dessen Entfernung unwirtschaftlich ist. Der Sirup kann ohne eine Entfernung dieser Asche nicht in akzeptabler Weise verwendet werden. Die alkalische Isomerisierung und die damit verbundenen Probleme werden in der US-PS-3 383 245 diskutiert.
- Auf dem einschlägigen Fachgebiet wandte man sich dann einer enzymatischen Umwandlung von Glucose in Fructose zu. Es wurde festgestellt, daß Spezies von beispielsweise Pseudomonas hydrophila, Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenus, Streptomyces echinatur, Streptomyces albus, Streptomyces olivaceus, Bacillus coagulans, Microbacterium arborescens (früher als Flavobacterium arborescens klassifiziert) und Bacillus licheniformis in geeigneten Nährmedien unter Bildung von Enzymen mit Glucose-Isomeraseeigenschaften gezüchtet werden konnten. Dies ist beispielsweise in den US-PS-2 950 228, 3 616 221, 3 625 828, 3 979 261, 4 061 539 und 4 348 480 beschrieben. Die Vorauswahl einer Vielzahl von Bakterienstämmen zur Herstellung von Glucose-Isomerase wurde von M. Suekane, et al., Z. Allgemeine Microbiologie 21, 457 (1981), veröffentlicht. Suekane et al. berichteten, daß M. lacticum und Brevibacterium imperiale (reklassifiziert als M. imperiale) auf Xylose nicht wuchsen und keine Glucose-lsomerase bildeten. M. Laevaniformens wurde früher als Corynebacterium laevaniformans klassifiziert. Suekane et al. überprüften einige Spezies von Corynebacterium und berichteten, daß keine dieser Spezies Glucose-Isomerase bildete. Demzufolge wird in keinem Dokument des bekannten Stands der Technik die Verwendung von Stämmen der Spezies Microbacterium imperiale, M. lacticum, M. ainmoniaphilum oder M. laevaniformans zur Herstellung einer Glucose-Isomerase vorgeschlagen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-Isomerase, das ein Züchten einer Kultur von Microbacterium unter aeroben Bedingungen in einem geeignete Nährstoffe enthaltenden Medium und ein anschließendes Gewinnen des Enzyms umfaßt. Geeignete Stämme von Microbacterium umfassen Stämme der Spezies M. imperiale, M. lacticum, M. ammoniaphilum und M. laevaniformans.
- Die vorliegende Erfindung verwendet Stämme von Microbacterium zur Herstellung von Glucose-Isomerase. Es wurde festgestellt, daß bestimmte Stämme in der Lage sind, Glucose-Isomerase in merklichen Mengen zu bilden. Diese Stämme zeigen in Abwesenheit des normalen Auslösers, Xylose, einen merklichen Grad an konstitutiver Enzymaktivität. Diese Microbacterium- Spezies bilden beispielsweise Glucose-Isomerase, wenn sie auf einem Lactose enthaltenden Nährmedium gezüchtet werden, wogegen M. Arborescens unter diesen Bedingungen keine Glucose-Isomerase bildet. Zur Herstellung von Glucose-Isomerase geeignete Microbacterium-Spezies umfassen: M.imperiale, M. lacticum, M. ammoniaphilum und M. laevaniformans. Stämme dieser Microbacterium-Spezies sind gegenwärtig bei The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter den Kennummern ATCC 8365, ATCC 8180, ATCC 15354 bzw. ATCC 15953 erhältlich.
- Die Microbacterium-Spezies werden auf Agarschrägflächen, vorzugsweise auf Nähragar (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), gehalten und können auf den verschiedensten geeignete Nährstoffe enthaltenden Medien kultiviert werden. Vorzugsweise enthält das Medium Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen. Beispiele für Stickstoffquellen sind Brauerhefeextrakt, hydrolysiertes tierisches Protein u. dgl.. Beispiele für anorganische Salze sind Ammoniumsulfat, Dikaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat u. dgl.. Ein bevorzugtes Medium enthält hydrolysiertes tierisches Protein, Maiseinweichflüssigkeit, ein Brauerhefeextrakt, (anorganische) Puffersalze und ein Kohlenhydrat. Geeignete Kohlenhydrate sind Xylose, Lactose, Polymerhydrolysate und dgl..
- Der Organismus wird unter aeroben Fermentationsbedingungen bei einer Temperatur von etwa 30º bis etwa 35º C gezüchtet. Die bevorzugte Wachstumstemperatur liegt bei 33º C. Der pH-Wert des Wachstumsmediums sollte in einem Bereich von etwa 6.5 bis etwa 7.5 gehalten werden. Der bevorzugte pH-Wert liegt bei 7,0. Ein anfänglicher pH-Wert von etwa 7,0 wird für das Wachstumsmedium bevorzugt. Maximale Glucose-Isomeraseaktivität wird im allgemeinen in etwa 48 bis etwa 72 h erreicht.
- Die Glucose-Isomerase der vorliegenden Erfindung wird innerhalb der während ihrer Bildung wachsenden Bakterienzellen gebildet. Die Zellen können vom Fermentationsbier nach allgemein bekannte Verfahren, z.B. durch Filtration oder Zentrifugation, abgetrennt und direkt als Gluose-Isomerasequelle verwendet werden. Derartige Zellen können nach allgemein bekannten Verfahrensweisen, z.B. der in der US-PS-3 779 869 offenbarten Glutaraldehyd-Behandlung, agglomeriert und die Enzymaktivität darin unterbunden werden. Alternativ dazu können die Zellen entweder mechanisch, durch Autolyse oder durch andere enzymatische Mittel aufgebrochen und das lösliche Enzym von den Zellbruchstücken abgetrennt werden. Das lösliche Enzym kann direkt verwendet oder auf einen geeigneten Träger nach allgemein bekannten Verfahren in einem immobilisierten Zustand gebracht werden.
- Die Erfindung wird im folgenden Beispiel detailliert beschrieben.
- Teile der Kulturen von Microbacterium-Spezies wurden jeweils von den Nähragarplatten in 250 ml Auffangkolben, die 50 ml eines wäßrigen Mediums mit 1% hydrolysiertem tierischen Protein (Bacto-Tryptone, bezogen von Difco Laboratories), 1% Trockenmaiseinweichflüssigkeit (Roquettes freres), 1% Hefeextrakt (Difco), 1% Kaliummonohydrogenphosphat, 0,5% Kaliumdihydrogenphosphat und 2% Xylose oder Lactose enthielten, überführt. Der anfängliche pH-Wert des Mediums lag bei etwa 7,0. Die Kolben wurden anschließend bei 33º C 72 h lang auf einem mit 250 UpM rotierenden Rotationsschüttler inkubiert. Nach Inkubation wurden die Kulturen mit Hilfe des in der US-PS-4 348 480 beschriebenen Verfahrens auf ihre Glucose-Isomeraseaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Glucose-Isomeraseaktivität wird Einheiten (GIU) ausgedrückt, die den pro Minute bei den Testbedingungen gebildeten Mikromolen Fructose entsprechen. Spezies Lactose Xylose Microbacterium lacticum Microbacterium imperiale Microbacterium ammoniaphilum Microbacterium Laevaniformans Flavobacterium arborescens* *) reklassifiziert als M. arborescens **) Daten aus der US-PS-4 061 539, in GIU/l umgerechnet
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung einer Glukose-Isomerase, das
das Züchten einer Kultur einer Microbacterim Spezies,
ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus M. lacticum, M.
imperiale, M. ammoniaphilum und M. laevaniformans, in
einem Medium, das geeignete Nährstoffe enthält, für eine
ausreichend lange Zeit, umfaßt, um eine wiedergewinnbare
Menge des Enzyms herzustellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Züchten aerob
durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Spezies M.
imperiale ist.
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