DE19825494A1 - Neuer Angiotensin Rezeptor, Herstellung und Verwendung desselben - Google Patents
Neuer Angiotensin Rezeptor, Herstellung und Verwendung desselbenInfo
- Publication number
- DE19825494A1 DE19825494A1 DE19825494A DE19825494A DE19825494A1 DE 19825494 A1 DE19825494 A1 DE 19825494A1 DE 19825494 A DE19825494 A DE 19825494A DE 19825494 A DE19825494 A DE 19825494A DE 19825494 A1 DE19825494 A1 DE 19825494A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- sequence seq
- angiotensin
- nucleic acid
- angiotensin receptor
- receptor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft einen neuen Angiotensin Rezeptor, die Herstellung und Verwendung desselben. DOLLAR A Der neue Angiotensin-Rezeptor hat mindestens eine Untereinheit, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 10 enthält.
Description
Die Erfindung betrifft einen neuen Angiotensin Rezeptor, die Herstellung und
Verwendung desselben.
Das Renin Angiotensin System ist wesentlich an der Regulation des Herz-
Kreislauf-Systems, des Elektrolyt- und des Flüssigkeits-Haushalts beteiligt.
Die physiologisch wirksamen Effektorhormone z. B. Angiotensin II (AngII) und
Angiotensin 1-7 (Ang1-7) werden durch proteolytische Spaltung des in der
Leber synthetisierten Precursers Angiotensinogen bzw. des daraus
gebildeten Angiotensin I erzeugt. An diesen Spaltungen sind eine Vielzahl
von Proteasen beteiligt (z. B. Renin, Angiotensin Converting Enzyme (ACE)).
Bisher wurden zwei menschliche Angiotensin Rezeptoren beschrieben, die
mit AT1 und AT2 bezeichnet wurden. Beide Rezeptoren gehören zu den
Arigiotensin II (Ang II)-Rezeptoren, d. h. diese Rezeptoren binden
vorzugsweise Ang II. Die cDNA Sequenzen dieser beiden Rezeptoren
(Takayanagi, R. et al. (1992). Biochemical and Biophysical Research
Communications 183, 910-915; Tsuzuki, S. et al. (1994). Biochemical and
Biophysical Research Communications 200, 1449-1454) weisen jeweils
sieben hydrophobe Bereiche auf, die potentielle Transmembrandomänen
darstellen. Aufgrund dieser charakteristischen Domänenstruktur wird
angenommen, daß die Angiotensin-Rezeptoren AT1 und AT2 zur Familie der
7-Transmembranrezeptoren gehören, die die Wirkung ihres Liganden
Angiotensin II über intrazelluläre G-Protein gekoppelte
Signaltranduktionskaskaden vermitteln.
Aufgrund der pharmakologischen Effekte, die durch andere, von AngII
verschiedene Angiotensine bzw. der von Angiotensin I bzw. II abgeleiteten
Peptide (endogen gebildete Bruchstücke von Angl und Ang/l) vermittelt
werden, wurde vermutet, daß weitere humane Angiotensin-Rezeptoren
existieren. In diesem Zusammenhang wurde kürzlich ein Rezeptor für das
Heptapeptid Ang1-7 gefordert (Ferrario, cm et al. (1997) Hypertension 30,
535-541).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neuer Angiotensin-Rezeptor,
der mindestens eine Untereinheit aufweist, die die Aminosäuresquenz SEQ
ID NO. 10 enthält, wobei diese Aminosäuresequenz gegebenenfalls am C-
terminalen Ende weitere Aminosäuren aufweist.
Der Angiotensin-Rezeptor ist ein Transmembranrezeptor. Er weist, im
Gegensatz zu den bisher beschriebenen Angiotensin Rezeptoren
vorzugsweise weniger als 7 Transmembrandomänen auf. Die Untereinheit,
die die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält, weist vorzugsweise eine
Transmembrandomäne auf. Diese Transmembrandomäne hat vorzugsweise
eine Länge von mehr als 6, vorzugsweise 8 oder 9, besonders bevorzugt 7
Aminosäuren auf. Vorzugsweise hat die Transmembrandomäne die Sequenz
"MSIVIPL" (angegeben im Einbuchstabencode für Aminosäuren).
Der Angiotensin-Rezeptor kann eine oder mehrere Untereinheiten aufweisen.
Beispielsweise kann der Rezeptor entweder als
- a) Monomer (eine Untereinheit, die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält) oder als
- b) Dimer mit einer identischen oder einer anderen Untereinheit oder als
- c) Tetramer mit drei weiteren identischen Untereinheiten oder mit einer identischen und zwei anderen Untereinheiten vorliegen.
Der Angiotensin-Rezeptor kann aber auch bis zur Bindung des Liganden als
Monomer (eine Untereinheit) bzw. als Dimer (zwei verschiedene
Untereinheiten) vorliegen und erst durch die Bindung des Liganden in eine
dimere bzw. tetramere Form übergehen.
Rezeptoren, die eine ähnliche Struktur aufweisen wie der neue Angiotensin-
Rezeptor, sind unter anderem der Insulinrezeptor, Wachstumsfaktoren wie
nerve growth factor (NGF), endothelial growth factor (EGF), fibroblast growth
factor (FGF), platelet derived growth factor (PDGF), T-Zellen Antigen-
Rezeptoren, haematopoietische Cytokin-Rezeptoren (z. B. IL1, IL5), und
Adhesionsmoleküle (Integrine, Selektine).
Der neue Angiotensin-Rezeptor kann gegebenenfalls posttranslational
modifiziert sein, beispielsweise kann der Rezeptor glykosyliert und/oder
phosphoryliert sein.
Der Angiotensin-Rezeptor kann seinen bzw. seine Liganden binden und die
Wirkung dieses Liganden bzw. dieser Liganden intrazellulär vermitteln. Der
Angiotensin Rezeptor kann Angiotensin 1-7 und/oder ein Derivat von
Angiotensin 1-7 binden. Derivate von Angiotensin 1-7 sind vorzugsweise
verkürzte Peptide, die sich von Ang1-7 ableiten, z. B. Abbauprodukte von
Ang1-7. Beispiele für Derivate von Ang1-7 sind Angiotensin III und
Angiotensin IV. Vorzugsweise bindet der Rezeptor Ang1-7.
Gegenstand der Erfindung ist ein Rezeptor, der die Aminosäuresequenz in
Tabelle 2, SEQ ID NO. 10 aufweist bzw. enthält. Der Angiotensin-Rezeptor
bzw. die Untereinheit, die die Sequenz SEQ ID NO. 10 enthält, hat eine
Länge von mindestens 175 Aminosäuren.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Nukleinsäure, die eine Sequenz
aufweist, die für den neuen Angiotensin-Rezeptor ("Rezeptor") kodiert.
Beispielsweise kann der Rezeptor ganz oder teilweise durch eine
Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9 aufweist, kodiert werden. Eine
Nukleinsäure, die für den Rezeptor bzw. eine Untereinheit des Rezeptors
kodiert kann die Sequenz SEQ ID NO. 9 erhalten und am 3'-Ende
gegebenenfalls weitere Nukleotide aufweisen, die zur kodierenden Sequenz
gehören.
Die Nukleinsäure kann beispielsweise eine DNA, eine cDNA oder eine RNA
sein. Die Nukleinsäure kann ein Gen sein, wobei dann die Sequenz SEQ ID
NO. 9 durch nicht-kodierende Sequenzen (Introns) unterbrochen sein kann.
Die Nukleinsäure kann gegebenenfalls derivatisiert sein. Ein Derivat der
Nukleinsäure kann beispielsweise ein Salz sein oder ein Nukleinsäure-
Derivat, welches neben den natürlichen Nukleotiden auch modifizierte
Nukleotide enthält bzw. vollständig aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut
ist.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure, die
für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die die Sequenz SEQ ID NO. 9
enthält. Beispielsweise kann eine solche Nukleinsäure in einer PCR
amplifiziert werden, in der Oligonukleotide, deren Sequenzen homologen
Bereichen (konservierten Bereichen) in den Nukleotidsequenzen der
Angiotensin Rezeptoren AT1 und AT2 entsprechen, als Primer und cDNA, die
vorzugsweise aus einem Gewebe (bzw. Zellen), auf das Angiotensin 1-7 oder
ein Derivat desselben eine Wirkung hat und/oder aus Gewebe (bzw. Zellen),
in dem AT1 und/oder AT2 nicht exprimiert werden, hergestellt wird, eingesetzt
werden. In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens werden
degenerierte Primer eingesetzt, deren Sequenzen sich von den homologen
Bereichen der Sequenzen von AT1 und AT2 ableiten. Vorzugsweise werden
hierzu die Primer Ang3A und Ang3B verwendet. Als Template kann
beispielsweise cDNA, hergestellt aus Endothelzellen verwendet werden.
Beispielsweise kann cDNA hergestellt aus HUVECs (Human Umbilical Vein
Endeothelial Cells) als Template eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung des neuen Rezeptors.
Beispielsweise kann der neue Angiotensin-Rezeptor hergestellt werden,
indem eine Nukleinsäure, deren Sequenz für den Angiotensin-Rezeptor
kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einen
geeigneten Vektor integriert, der rekombinante Vektor in eine Zelle
eingebracht und der Angiotensin Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für
den neuen Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz
SEQ ID NO. 9 enthält, beispielsweise in einem Verfahren zur Herstellung
eines rekombinanten Angiotensin-Rezeptors, wobei die Nukleinsäure, die
unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors steht in eine Zelle
eingebracht und exprimiert wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für .
den neuen Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz
SEQ ID NO. 9 enthält zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, in der der
Angiotensin-Rezeptor exprimiert werden kann.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für
den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ
ID NO. 9 enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und
Prävention von Krankheiten, die mit einer Fehlregulation des Herz-Kreislauf
Systems, des Elektrolythaushalts oder des Flüssigkeitshaushalts
einhergehen.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für
den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ
ID NO. 9 enthält, zur Herstellung eines transgenen Tieres, welches das
entsprechende Angiotensin-Rezeptor Gen nicht enthält oder eines
transgenen Tieres, welches das entsprechende Angiotensin-Rezeptor Gen
überexprimiert. Transgene Tiere können beispielsweise zur Charakterisierung
der Spezifität und biochemischen Funktion des Angiotensin-Rezeptors
verwendet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäure, die für
den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ
ID NO. 9 enthält, in Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von
Substanzen, die als Antagonisten und Agonisten des Angiotensin-Rezeptors
eingesetzt werden können und/oder in Verfahren, in denen Substanzen
identifiziert werden, die die funktionelle Expression des kodierten
Angiotensin-Rezeptors inhibieren oder aktivieren.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Nukleinsäure, die für den
Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die Sequenz SEQ ID NO.
9 enthält, in der Gentherapie oder zur Herstellung eines Arzneimittels, das in
der Gentherapie eingesetzt werden kann.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die
für den Angiotensin-Rezeptor kodiert und die vorzugsweise die SEQ ID NO.
9 enthält als Werkzeug in der Molokularbiologie (z. B. als Sonde).
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des neuen Angiotensin-
Rezeptors. Beispielsweise kann der Angiotensin Rezeptor in Verfahren zur
Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, die als Agonisten oder
Antagonisten des Rezeptors eingesetzt werden können, verwendet werden
(z. B. Bindungsassays und funktionelle Assays zum Screening).
Weiterhin kann der Angiotensin-Rezeptor oder Teile desselben z. B. ein
Epitop, welches z. B. durch die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 10 bzw.
einen Teil derselben vorgegeben wird, zur Herstellung von Antikörpern nach
bekannten Verfahren (Harlow und Lane, "Antibodies-A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN-0-87969-314-2) eingesetzt werden. Auf
diese Weise hergestellt Antikörper, die spezifisch an den neuen Angiotensin-
Rezeptor binden, können zum Nachweis des neuen Rezeptors, z. B. in
diagnostischen Verfahren und/oder zur weiteren Charakterisierung des
Rezeptors eingesetzt werden.
Zur Auffindung des neuen Rezeptors wurden ausgehend von den bekannten
Sequenzen, die für die Angiotensin II Rezeptoren AT1 und AT2 kodieren,
Oligonukleotide synthetisiert, deren Sequenzen konservierten Bereichen der
AT1/AT2 kodierenden Sequenzen entsprechen bzw. die gegen diese
konservierten Bereiche gerichtet sind (Ang3A und Ang3B). Diese
Oligonukleotide wurden in PCR Reaktionen mit cDNA aus humanen HUVECs
(Human Umbilical Vein Endothelial Cell) als Template eingesetzt. Diese
Zellinie leitet sich von Endothelzellen ab, die die Blutgefäße auskleiden.
Diese Zellen exprimieren keine AT1 bzw. AT2-Rezeptoren.
Es wurde ein DNA-Fragment mit einem offenen Leserahmen und einer bisher
nicht beschriebenen Nukleotidsequenz (SEQ ID NO. 3) amplifiziert und
identifiziert. Diese Nukleotidsequenz zeigte keine Übereinstimmung mit
Sequenzen in den Datenbanken EMBL oder Genbank®. Ein
Sequenzvergleich mit Sequenzen in der Lifeseq® Datenbank mit Hilfe der
Programm-Module "Blast" und "Assembly" (GGC Programm Paket) ergab
eine Überlappung von SEQ ID NO. 3 mit den Lifeseq®-Klonen Nr. 1458429,
3341232, 3440195, 1250818, 2836520, 1310286 und 1362205 (ESTs ohne
bekannte Funktion). Das aus diesem virtuellen Contig-(3) abzuleitende
theoretische 0,5 kbp DNA-Fragment wurde experimentell bestätigt (Beispiel
2, PCR mit dem Primerpaar Ang4A und Ang4B). Die Sequenz des DNA-
Fragments mit dem darin enthaltenen offenen Leserahmen wurde durch 5'-
Verlängerung (Beispiel 3) bis in die Vektorsequenz hinein aufgeklärt (SEQ ID
NO. 9). Die SEQ ID NO. 9 enthält auch die 5'-nichttranslatierte Region bzw.
einen Teil derselben.
Eine Analyse des 5'-Bereichs der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO. 9
zeigte, daß stromaufwärts vor dem angenommenen Start-Methionin-Triplet
(ATG) an Position -3 ein Purin-Nukleotid und an den Positionen -1 und -4
Cytosin-Nukleotide lokalisiert sind. Die Lokalisation dieser Nukleotide an den
Positionen -1, -3 und -4 entspricht der eukaryotischen Konsensussequenz für
den mRNA-Translations-Initiationsstartpunkt.
Der offene Leserahmen in SEQ ID NO. 9 kodiert für ein Protein mit mindesten
175 Aminosäuren (SEQ ID NO. 10). Eine Hydrophobizitätsanalyse dieser
Aminosäuresequenz mit Hilfe des GCG Programms zeigte, daß die Sequenz
am N-Terminus eine hydrophobe Domäne mit einer Länge von etwa 7
Aminosäuren aufweist. Diese hydrophobe Domäne kann eine
Transmembrandomäne darstellen, mit der dieser neue Rezeptor in der
Membran verankert ist. Am C-Terminus weist die Sequenz dagegen eine
mehr oder weniger hydrophile Domäne auf.
Für die erste PCR wurden die Oligonukleotid-Primer Ang3A und Ang3B
verwendet, die ein 0,19 kbp-DNA-Fragment - auf Basis der AT112-
Rezeptorgene - einschließen. Als Template DNA wurde cDNA aus einer
käuflichen HUVEC-cDNA-Bank (Stratagene Katalog Nr. 937223, Stratagene
GmbH, Heidelberg) eingesetzt.
Nukleotidsequenz von Ang3A:
SEQ ID NO. 1: 5'-TTG TKC TKK YCT TYW TCW TTT SCT GGM TTC CC-3'
Nukleotidsequenz von Ang3B:
SEQ ID NO. 2: 5'-TTY CCM ASA AAR CMA TAM ARA ARM GGA TT -3'
wobei
M = (A/C)
Y = (C/T)
R = (A/G)
S = (G/C)
K = (G/T)
W = (A/T)
bedeutet.
Nukleotidsequenz von Ang3A:
SEQ ID NO. 1: 5'-TTG TKC TKK YCT TYW TCW TTT SCT GGM TTC CC-3'
Nukleotidsequenz von Ang3B:
SEQ ID NO. 2: 5'-TTY CCM ASA AAR CMA TAM ARA ARM GGA TT -3'
wobei
M = (A/C)
Y = (C/T)
R = (A/G)
S = (G/C)
K = (G/T)
W = (A/T)
bedeutet.
Für die PCR Reaktion wurden 1 µg cDNA aus der HUVEC Bank mit
rekombinanter Thermus aquaticus (Taq) DNA Polymerase (Boehringer
Mannheim, Deutschland) und je 10 µmol Primer Ang3A und Ang 3B pro 50
µl Reaktionsansatz in einem Thermocycler (Perkin Eimer 2400-Thermocycler,
Perkin Eimer Applied Biosystems, Weiterstadt) inkubiert. Die PCR Reaktion
wurde mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 20" bei 96°C, 10" bei
38°C und 20" bei 72°C (60 Zyklen). Es wurde ein 130 Basenpaare (bp)
langes DNA-Fragment amplifiziert.
Dieses 130 bp DNA-Fragment wurde in den Vektor pCR 2.1 TOPO®
(Invitrogen BV, NV Leek, Niederlande) ligiert und in E. coli Top10F'
transformiert. Die Sequenz des im pCR2.1 vorliegenden 130 bp DNA-
Fragments wurde mit Hilfe eines Kapillarelektrophorese-Sequencers (ABI
310, Applied Biosystems, Weiterstadt) ermittelt (SEQ ID NO. 3).
Die Sequenz SEQ ID NO. 3 wurde unter Verwendung der Programm-Module
FASTA und TFASTA (Software-Paket der University of Wisconsin Genetics
Computer Group (GCG), USA) mit den Sequenzen, die in den öffentlich
zugänglichen Datenbanken (z. B. EMBL, GenBank®) vorliegen, verglichen.
Außerdem wurde die Sequenz für einen entsprechenden Homologievergleich
mit den Sequenzen, die in der Lifeseq®-Datenbank der Fa. Incyte (Palo Alto,
USA) erfaßt sind, eingesetzt.
In der Lifeseq®-Datenbank wurden Sequenzen von Expressed Sequence
Tags (ESTs) identifiziert (Lifeseq®-Klone Nr. 1458429, 3341232, 3440195,
1250818, 2836520, 1310286 und 1362205), die mit SEQ ID NO. 3
überlappen. Ausgehend von einer Sequenz, die sich von einer Anordung der
überlappenden Expressed Sequence Tags (ESTs) nach eigenem Assembly
ableitet, wurden die Primer Ang4A und Ang4B synthetisiert.
Nukleotidsequenz von Ang4A:
SEQ ID NO. 4: 5'-TGG GGG TTG ATA CAG CAG AGA C -3'
Nukleotidsequenz von Ang4B:
SEQ ID NO. 5: 5'-GCA CTG CCC TCT CTT TAT CCA AA -3'
Nukleotidsequenz von Ang4A:
SEQ ID NO. 4: 5'-TGG GGG TTG ATA CAG CAG AGA C -3'
Nukleotidsequenz von Ang4B:
SEQ ID NO. 5: 5'-GCA CTG CCC TCT CTT TAT CCA AA -3'
Es wurden PCR Reaktionen mit jeweils 0,1 µg cDNA aus der HUVEC Bank
als Template und jeweils 10 µmol Primer Ang4A und Ang4B pro 50 µl
Reaktionsansatz durchgeführt, wobei der Advantage-cDNA Polymerase Mix
(Clontech, Heidelberg) verwendet wurde. Für die PCR Reaktionen wurde
folgendes Temperaturprofil verwendet: 30" 94°C und 2'30" 60°C (60
Zyklen). Es wurde ein 500 bp langes DNA-Fragment erhalten. Dieses wurde
wie in Beispiel 1 beschrieben kloniert und sequenziert (SEQ ID NO. 6). Die
Sequenz weist einen offenen Leserahmen (Open Reading Frame (ORF)) auf.
Um die Sequenz im 5' Bereich des 500 bp DNA-Fragments aufzuklären,
wurden die Primer Ang5A und Ang5B synthetisiert.
Nukleotidsequenz von Ang5A:
SEQ ID NO. 7: 5'-TGG GGA TTG ATA GGC AG-3'
Nukleotidsequenz von Ang5B:
SQ ID NO. 8: 5'-ATA ACT GTT GGA TTT CTC AA -3'
Nukleotidsequenz von Ang5A:
SEQ ID NO. 7: 5'-TGG GGA TTG ATA GGC AG-3'
Nukleotidsequenz von Ang5B:
SQ ID NO. 8: 5'-ATA ACT GTT GGA TTT CTC AA -3'
Die Nukleotidsequenz von Ang5A und Ang5B entspricht jeweils einem Teil
der Sequenz des 500bp DNA-Fragments. Diese beiden Primer werden in
weiteren PCRs mit den Primern M13 Reverse bzw. M13 Forward (-20)
eingesetzt. Die Primer M13 Reverse und M13 Forward (-20) entsprechen
Sequenzen des zur Herstellung der HUVEC-cDNA-Bank benutzten Uni-ZAP
Bakteriophagen-Vektors.
Diese PCR Reaktionen wurden mit je 0,1 µg cDNA aus der HUVEC Bank als
Template und jeweils 10 µmol Primer Ang5A bzw. Ang5B und M13 Reverse
bzw. M13 Forward (-20) (aus dem TOPO-TA cloning-Kit (Clontech)) und Taq
Polymerase (Boehringer Mannheim) sowie Taq Start Antibody (Clontech)
durchgeführt. Die PCR Reaktionen wurden mit folgendem Temperaturprofil
durchgeführt: 30" 96°C, 30" 50°C, und 45" 72°C (70 Zyklen).
Dadurch wurde ein DNA-Fragment mit einer Länge von insgesamt 660 bp
erhalten. Dieseswurde wie in Beispiel 1 beschrieben kloniert und sequenziert.
Das DNA-Fragment weist die Sequenz SEQ ID NO. 9 auf. Die Sequenz SEQ
ID NO. 9 enthält den gesamten 5'-kodierenden Bereich.
Zusätzlich zu den bereits genannten Software-Modulen wurden für die
Durchführung der rechnergestützten Sequenz-Analysen die GCG-Module
Assemble, Map, Translate, Plotstructure und Pileup verwendet.
Claims (13)
1. Angiotensin-Rezeptor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens
eine Untereinheit aufweist, die die Aminosäuresquenz SEQ ID NO.
10 enthält.
2. Angiotensin-Rezeptor nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure
sequenz SEQ ID NO. 10 gegebenenfalls am C-terminalen Ende
weitere Aminosäuren aufweist.
3. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüche 1
und 2, wobei die Sequenz SEQ ID NO. 10 eine Transmembran
domäne aufweist.
4. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüche 1
bis 3, wobei der Rezeptor Angiotensin 1-7 oder ein Derivat von
Angiotensin 1-7 bindet.
5. Angiotensin-Rezeptor nach einem oder mehreren der Ansprüchen 1
bis 4, wobei mindestens eine Untereinheiten des Rezeptors durch
eine Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID NO. 9 kodiert wird und
wobei die Sequenz SEQ ID NO. 9 am 3'-Ende gegebenfalls weitere
Nukleotide enthält, die zur kodierenden Sequenz gehören.
6. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ
ID NO. 9, wobei Oligonukleotide, deren Sequenzen homologen
Bereichen in den Nukleotidsequenzen der Angiotensin Rezeptoren
AT1 und AT2 entsprechen, als Primer und cDNA, hergestellt aus
Zellen, in dem AT1 und AT2 Rezeptoren nicht exprimiert werden,
als Template in einer PCR Reaktion eingesetzt werden.
7. Verfahren zur Herstellung eines Angiotensin-Rezeptors nach einem
oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei eine Nukleinsäure, die
die Sequenz SEQ ID NO. 9 enthält, in einen geeigneten Vektor
integriert, der rekombinante Vektor in eine Zelle eingebracht und
der Angiotensin-Rezeptor in dieser Zelle exprimiert wird.
8. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9
enthält, in einem Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten
Angiotensin-Rezeptors, wobei die Nukleinsäure, die unter der
Kontrolle eines geeigneten Promotors steht, in eine Zelle
eingebracht und exprimiert wird.
9. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9
enthält, zur Herstellung einer rekombinanten Zelle, in der der
Angiotensin-Rezeptor exprimiert werden kann.
10. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9
aufweist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung
und/oder Prävention von Krankheiten, die mit einer Fehlregulation
des Herz-Kreislauf Systems, des Elektrolythaushalts und/oder des
Flüssigkeitshaushalts einhergehen.
11. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9
enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels, das in der Gentherapie
eingesetzt werden kann.
12. Verwendung einer Nukleinsäure, die die Sequenz SEQ ID NO. 9
enthält, in einem Verfahren zur Identifizierung und
Charakterisierung von Substanzen, die als Agonisten oder
Antagonisten des Angiotensin-Rezeptors eingesetzt werden
können.
13. Verwendung eines Angiotensin-Rezeptors nach einem oder
mehreren der Ansprüche 1 bis 5 in einem Verfahren zur
Identifizierung und Charakterisierung von Angonisten oder
Antagonisten des Rezeptors.
Priority Applications (14)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19825494A DE19825494A1 (de) | 1998-06-08 | 1998-06-08 | Neuer Angiotensin Rezeptor, Herstellung und Verwendung desselben |
KR1020007013967A KR20010052703A (ko) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | 신규한 안지오텐신 수용체, 이의 제조 방법 및 용도 |
PL99345949A PL345949A1 (en) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | Novel angiotensin receptor, production and use thereof |
CA002330229A CA2330229A1 (en) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | Novel angiotensin receptor, production and use thereof |
AU43616/99A AU4361699A (en) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | Novel angiotensin receptor, production and use thereof |
HU0102540A HUP0102540A3 (en) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | Novel angiotensin receptor, production and use thereof |
TR2000/03662T TR200003662T2 (tr) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | Yeni anjiyotensin reseptörü, aynısının üretimi ve kullanımı. |
PCT/EP1999/003249 WO1999064585A2 (de) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | Neuer angiotensin rezeptor, herstellung und verwendung desselben |
JP2000553575A JP2002517237A (ja) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | 新規なアンギオテンシン受容体、その製造および使用 |
BR9912183-2A BR9912183A (pt) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | Receptor de angiotensina, preparação e aplicação do mesmo |
CN99807126A CN1304449A (zh) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | 新血管紧张肽受体,其制备和用途 |
EP99926305A EP1086217A2 (de) | 1998-06-08 | 1999-05-12 | Neuer angiotensin rezeptor, herstellung und verwendung desselben |
ARP990102666A AR020086A1 (es) | 1998-06-08 | 1999-06-04 | Nuevo receptor de angiotensina, preparacion y empleo del mismo |
IDW20002553A ID27566A (id) | 1998-06-08 | 1999-12-07 | Reseptor angiotensin baru, preparasi dan penggunannya |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19825494A DE19825494A1 (de) | 1998-06-08 | 1998-06-08 | Neuer Angiotensin Rezeptor, Herstellung und Verwendung desselben |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19825494A1 true DE19825494A1 (de) | 1999-12-09 |
Family
ID=7870244
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19825494A Withdrawn DE19825494A1 (de) | 1998-06-08 | 1998-06-08 | Neuer Angiotensin Rezeptor, Herstellung und Verwendung desselben |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1086217A2 (de) |
JP (1) | JP2002517237A (de) |
KR (1) | KR20010052703A (de) |
CN (1) | CN1304449A (de) |
AR (1) | AR020086A1 (de) |
AU (1) | AU4361699A (de) |
BR (1) | BR9912183A (de) |
CA (1) | CA2330229A1 (de) |
DE (1) | DE19825494A1 (de) |
HU (1) | HUP0102540A3 (de) |
ID (1) | ID27566A (de) |
PL (1) | PL345949A1 (de) |
TR (1) | TR200003662T2 (de) |
WO (1) | WO1999064585A2 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1802361B1 (de) * | 2004-10-21 | 2009-11-18 | Medtronic, Inc. | Angiotensin-(1-7) freisetzende polymerbeschichtete medizinische vorrichtung zur reduzierung von restenose und zur verbesserung von endothelzellfunktionen |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994000492A1 (en) * | 1992-06-24 | 1994-01-06 | Washington State University Research Foundation | Angiotensin iv peptides and receptor |
-
1998
- 1998-06-08 DE DE19825494A patent/DE19825494A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-05-12 TR TR2000/03662T patent/TR200003662T2/xx unknown
- 1999-05-12 EP EP99926305A patent/EP1086217A2/de not_active Withdrawn
- 1999-05-12 WO PCT/EP1999/003249 patent/WO1999064585A2/de not_active Application Discontinuation
- 1999-05-12 CA CA002330229A patent/CA2330229A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-12 HU HU0102540A patent/HUP0102540A3/hu unknown
- 1999-05-12 BR BR9912183-2A patent/BR9912183A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-05-12 CN CN99807126A patent/CN1304449A/zh active Pending
- 1999-05-12 KR KR1020007013967A patent/KR20010052703A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-05-12 AU AU43616/99A patent/AU4361699A/en not_active Abandoned
- 1999-05-12 PL PL99345949A patent/PL345949A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1999-05-12 JP JP2000553575A patent/JP2002517237A/ja not_active Withdrawn
- 1999-06-04 AR ARP990102666A patent/AR020086A1/es unknown
- 1999-12-07 ID IDW20002553A patent/ID27566A/id unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994000492A1 (en) * | 1992-06-24 | 1994-01-06 | Washington State University Research Foundation | Angiotensin iv peptides and receptor |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR9912183A (pt) | 2001-04-10 |
CA2330229A1 (en) | 1999-12-16 |
HUP0102540A3 (en) | 2003-09-29 |
PL345949A1 (en) | 2002-01-14 |
WO1999064585A2 (de) | 1999-12-16 |
TR200003662T2 (tr) | 2001-07-23 |
ID27566A (id) | 2001-04-12 |
AU4361699A (en) | 1999-12-30 |
KR20010052703A (ko) | 2001-06-25 |
AR020086A1 (es) | 2002-04-10 |
JP2002517237A (ja) | 2002-06-18 |
CN1304449A (zh) | 2001-07-18 |
HUP0102540A2 (hu) | 2001-10-28 |
WO1999064585A3 (de) | 2000-04-06 |
EP1086217A2 (de) | 2001-03-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bargmann et al. | The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein | |
DE69231128T2 (de) | Domänen von extrazellulären bereichen von menschlichen blutplättchen abstammenden wachstumsfaktor rezeptor-polypeptiden | |
DE69233421T2 (de) | Neuartige rezeptor-typ tyrosinkinase und deren verwendung | |
DE69733204T2 (de) | Neuartige vegf-ähnliche faktoren | |
DE69033109T2 (de) | Rezeptoren für fibroblasten-wachstumsfaktoren | |
DE69822840T2 (de) | Säugetier zytokinrezeptor-11 | |
Schwinn et al. | Molecular cloning and expression of the cDNA for a novel alpha 1-adrenergic receptor subtype. | |
DE69838334T2 (de) | Kdr, ein menschlicher tyrosin kinase rezeptor | |
DE69837606T2 (de) | Cystein-reiche rezeptoren-train | |
Glickman et al. | Molecular cloning, tissue-specific expression, and chromosomal localization of a novel nerve growth factor-regulated G-protein-coupled receptor, nrg-1 | |
DE69333315T2 (de) | Säugetier-rezeptoren für das melanocyten-stimulierendes hormon und deren verwendungen | |
DE69334146T2 (de) | Peptide mit gdp-austauschfaktorartiger wirkung, dafür kodierende nukleinsäuresequenzen, ihre herstellung und verwendung | |
DE69835509T2 (de) | Verfahren zur bestimmung des kardiovasculären status und zusammensetzungen zu deren verwendung | |
US5658783A (en) | Mammalian methadone-specific opioid receptor gene and uses | |
DE69534471T2 (de) | Peptide, die fähig sind die sh3-domäne des gap-proteins zu binden, ihre kodierende dns, ihre zubereitung und verwendung | |
DE69232737T2 (de) | Nukleotide sequenzen die für den murin-beta-3-adrenergischen rezeptor kodieren und ihre verwendungen | |
LANGLEY et al. | Identification of multiple forms of 180-kDa ribosome receptor in human cells | |
DE69734199T2 (de) | Menschliches netrin-1 | |
DE19825494A1 (de) | Neuer Angiotensin Rezeptor, Herstellung und Verwendung desselben | |
WO1999037761A1 (de) | Neue sequenzvarianten des menschlichen beta2-adrenergen rezeptorgens und ihre verwendung | |
DE69836278T2 (de) | Allele formen von menschlichem stat3 | |
DE69333154T2 (de) | Für den prostaglandinrezeptor kodierendes gen, damit transformierte zelle und dessen expressionsprodukt | |
DE69627598T2 (de) | Neue ATP empfindliche Kaliumkanal-Proteine und Gene für dieselben | |
DE69635667T2 (de) | Biologisch aktive liganden der eph familie | |
DE69832447T2 (de) | Gen kodierend für Afadin-1 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH, 65929 FRANKFURT, |
|
8130 | Withdrawal |