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Die
vorliegende Erfindung stellt einen neuen Liganden, welcher Proteine
bindet, die zur EPH-Unterfamilie von rezeptorartigen Protein-Tyrosinkinasen
gehören,
wie den Elk-Rezeptor und Verfahren zur Herstellung löslicher
Formen dieses Liganden, welche biologisch aktiv sind, bereit.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Fähigkeit
von Polypeptidliganden, Zellen zu binden und dadurch eine phänotypische
Antwort wie Zellwachstum, Überleben
oder Differenzierung hervorzurufen, wird oft durch Transmembran-Tyrosinkinasen vermittelt.
Der extrazelluläre
Teil jeder Rezeptortyrosinkinase (RTK) ist im Allgemeinen der kennzeichnendste Teil
des Moleküls,
da er dem Protein seine Liganden erkennende Eigenschaft verleiht.
Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne führt zu einer Signaltransduktion über eine
katalytische intrazelluläre
Tyrosinkinasedomäne,
welche ein biologisches Signal auf intrazelluläre Zielproteine überträgt. Die
besondere Anordnung von Sequenzmotiven dieser cytoplasmatischen,
katalytischen Domäne
bestimmt ihren Zugang zu möglichen
Kinasesubstraten (Mohammadi et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1990),
5068–5078;
Fantl et al., Cell, 69 (1992), 413–413).
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RTKs
scheinen in Folge der Ligandenbindung eine Dimerisierung oder eine
verwandte konformationelle Änderung
durchzumachen (Schlessinger J., Trend Biochem. Sci. 13 (1988), 443–447; Ullrich
und Schlessinger, Cell 61 (1990), 203–212; Schlessinger und Ullrich,
Neuron 9 (1992), 383–391);
molekulare Wechselwirkungen zwischen dimerisierenden cytoplasmatischen
Domänen
führen
zur Aktivierung der Kinasefunktion. In einigen Fällen wie dem Wachstumsfaktor
von Blutplättchen
abstammender Wachstumsfaktor (PDGF) ist der Ligand ein Dimer, welches
zwei Rezeptormoleküle
bindet (Hart et al., Science 240 (1988), 1529–1531; Heldin, J. Biol. Chem.
264 (1989), 8905–8912),
während
zum Beispiel im Fall von EGF der Ligand ein Monomer ist (Weber et
al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 14631–14636).
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Die
Gewebeverteilung eines bestimmten Tyrosinkinaserezeptors in höheren Organismen
stellt wichtige Daten in Bezug auf die biologische Funktion des
Rezeptors bereit. Die Tyrosinkinaserezeptoren für einige Wachstums- und Differenzierungsfaktoren
wie Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) werden verbreitet exprimiert
und scheinen deshalb eine allgemeine Rolle bei Wachstum und Erhalt
von Geweben zu spielen. Mitglieder der Trk-RTK-Familie (Glass & Yancopoulos,
Trends in Cell Biol 3 (1993), 262–268) von Rezeptoren sind im
Allgemeinen eher auf Zellen des Nervensystems begrenzt und die Nervenwachstumsfaktor-Familie,
bestehend aus NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5 (bekannt als die Neurotrophine),
welche diese Rezeptoren bindet, fördert die Differenzierung von
verschiedenen Gruppen von Nervenzellen in Hirn und Peripherie (Lindsay
R. M. in Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin & J.H. Fallon, Hrsg., (1993) Seiten
257–284
(San Diego, CA: Academic Press). Die Lokalisierung eines solchen
Rezeptors der Trk-Familie, trkB, im Gewebe stellt einen gewissen
Einblick in die mögliche
biologische Rolle dieses Rezeptors genauso wie der Liganden, welche
diesen Rezeptor binden (hier als Verwandte bezeichnet), bereit.
So wurde zum Beispiel von trkB in erwachsenen Mäusen herausgefunden, dass es
bevorzugt in Hirngewebe exprimiert wird, obwohl wesentliche Spiegel
von trkB-mRNAs auch in Lunge, Muskel und Eierstöcken beobachtet wurden. Weitere
trkB-Transkripte wurden in Embryos aus der mittleren und späten Gestationsphase
gefunden. In situ-Hybridisierungsuntersuchungen von 14 und 18 Tage
alten Mausembryos zeigten auf, dass trkB-Transkripte in den zentralen
und peripheren Nervensystemen, einschließlich des Hirns, des Rückenmarks,
der Rückenmarks-
und Schädelganglien,
des Truncus paravertebralis des sympathischen Nervensystems und
verschiedener Innervationswege lokalisiert waren, was nahe legt,
dass das trkB-Genprodukt ein an der Neurogenese und frühen neuralen
Entwicklung beteiligter Rezeptor sein könnte und genauso eine Rolle
im reifen Nervensystem spielen könnte.
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Die
zelluläre
Umgebung, in welcher eine RTK exprimiert wird, kann die bei Bindung
eines Liganden an den Rezeptor gezeigte biologische Antwort beeinflussen.
So ergibt sich zum Beispiel, wenn eine einen Trk-Rezeptor exprimierende
Nervenzelle einem Neurotrophin ausgesetzt wird, welches diesen Rezeptor
bindet, Überleben
und Differenzierung der Nervenzelle. Wenn der gleiche Rezeptor von
einem Fibroblasten exprimiert wird, ergibt die Exposition gegenüber dem
Neurotrophin eine Vermehrung des Fibroblasten (Glass et al., Cell 66
(1991), 405–413).
Somit scheint es, dass die extrazelluläre Domäne den bestimmenden Faktor
in Bezug auf die Ligandenspezifität bereitstellt und, sobald
die Signaltransduktion ausgelöst
ist, die zelluläre
Umgebung das phänotypische
Ergebnis dieser Signaltransduktion bestimmen wird.
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Basierend
auf Sequenzhomologien in ihrer intrazellulären Domäne wurde eine Anzahl von RTK-Familien
identifiziert. Die von NGF verwendeten Rezeptor- und Signaltranduktionswege
schließen
das Produkt des trk-Protoonkogens ein (Kaplan et al., Nature 350
(1991), 156–160;
Klein et al., Cell 65 (1991), 189–197). Klein et al. (EMBO J.
8 (1989), 3701–3709)
berichteten über
die Isolierung von trkB, welches ein zweites Mitglied der Protein-Tyrosinkinase-Familie
von Rezeptoren codiert, von denen herausgefunden wurde, dass sie
in hohem Maße
mit dem menschlichen trk-Protoonkogen
verwandt ist. TrkB bindet und vermittelt die funktionellen Antworten
auf BDNF, NT-4 und in einem geringeren Ausmaß NT-3 (Squinto et al., Cell
65 (1991), 885–903;
Ip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 89 (1992), 3060–3064; Klein
et al., Neuron, 8 (1992), 947–956).
Auf der Aminosäureebene
wurde von den Produkten von trk und trkB herausgefunden, dass sie,
einschließlich
9 der 11 in trk vorhandenen Cysteine, eine Homologie von 57 Prozent
in ihren extrazellulären
Regionen teilen. Es wurde herausgefunden, dass diese Homologie in
ihren jeweiligen katalytischen Tyrosinkinasedomänen auf 88 Prozent zunimmt.
Die Trk-Genfamilie
wurde nun ausgeweitet, um den trkC-Lokus einzuschließen, wobei
NT-3 als der bevorzugte Ligand für
trkC identifiziert wurde (Lamballe et al., Cell 66 (1991), 967–979; Valenzuela
et al., Neuron 10 (1993), 963–974).
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Die
mit Eph verwandten Transmembran-Tyrosinkinasen umfassen die größte bekannte
Familie von rezeptorartigen Tyrosinkinasen, wobei viele Mitglider
eine spezifische Expression im sich entwickelnden und im reifen
Nervensystem zeigen.
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Zwei
neue Mitglieder der Eph-RTK-Familie, bezeichnet als Ehk (Eph Homology
Kinase) –1
und –2
wurden unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR)-basierten
Durchmusterung von im Hirn exprimierten Genen identifiziert (Maisonpierre
et al., Oncogene 8 (1993), 3277–388).
Diese Gene scheinen ausschließlich
im Nervensystem exprimiert zu werden, wobei die Expression von Ehk-1
früh in
der Entwicklung des Nervensystems beginnt. Kürzlich wurde ein neues Mitglied
dieser Gruppe von verwandten Rezeptoren, Ehk-3, cloniert (Valenzuela
et al., Oncogene 10 (1995), 1573–1580).
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Das
elk-Gen codiert eine rezeptorartige Protein-Tyrosinkinase, welche
auch zur eph-Unterfamilie gehört
und welche fast ausschließlich
im Hirn (und auf niedrigeren Niveaus in den Hoden) exprimiert wird
(Letwin et al., Oncogene 3 (1988), 621–678; Lhotak et al., Mol. Cell.
Biol. 11 (1991), 2496–2502).
Gründend
auf seinem Expressionsprofil wird von dem Elk-Rezeptor und seinem
verwandten Liganden erwartet, dass sie einen Rolle bei Interaktionen
von Zelle zu Zelle im Nervensystem spielen. Andere Mitglieder der
Eph-Familie von Rezeptoren, die in die gleiche Unterklasse wie Elk
fallen, schließen
die Nuk/Cek5-, Hek2/Sek4- und Htk-Rezeptoren ein (Brambilla und Klein,
Mol. Cell. Neurosci. 6 (1995), 487–495; Gale et al., Neuron 17
(1996), 9–19).
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Ungleich
den Ehks und Elk-Rezeptoren scheint der eng verwandte Eck-Rezeptor in einer
eher pleiotropen Weise zu funktionieren; er wurde in Nerven-, Epithel-
und Skelettgeweben identifiziert und scheint bei der Gastrulation
und bei craniofacialen Stellen der Musterbildung und Stellen der
Musterbildung an den Extremitätenknospen
im Mausembryo beteiligt zu sein (Ganju et al., Oncogene 9 (1994),
1613–1624).
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Die
Identifizierung einer großen
Zahl von Rezeptortyrosinkinasen hat die Identifizierung ihrer verwandten
Liganden weit übertroffen.
Im besten Fall stellt die Bestimmung der Gewebe, in welchen solche
Rezeptoren exprimiert werden, einen Einblick in die Regulation des
Wachstums, der Vermehrung und Regeneration von Zellen in Zielgeweben
bereit. Weil die RTKs eine Anzahl von wichtigen Funktionen während der
Entwicklung zu vermitteln scheinen, werden ihre verwandten Liganden
unvermeidlich eine entscheidende Rolle in der Entwicklung spielen.
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Obwohl
eine Zahl von Schemata zur Identifizierung von verwandten Liganden
für die
vielen verwaisten Rezeptoren, welche identifiziert worden sind,
entwickelt wurde, wurden sehr wenige solcher Liganden identifiziert
und die Liganden, welche bis jetzt identifiziert worden sind, scheinen
keine andere Aktivität
zu haben, als ihren verwandten Rezeptor zu binden. Zum Beispiel
beschreibt die Internationale Veröffentlichung Nummer WO/94/11020,
veröffentlicht
am 26. Mai 1994, Liganden, welche an den Eck-Rezeptor binden. Insbesondere wird
der Ligand EBP (auch bekannt als B61) beschrieben. Obwohl jedoch
die Bindung von B61 an den Eck-Rezeptor
offenbart wird, wird keine biologische Aktivität beschrieben. Ähnlich wurde
trotz der Beschreibung eines Liganden in der PCT Veröffentlichung
Nummer WO94/11384 (veröffentlicht
am 26. Mai 1994), welcher den Elk-Rezeptor bindet, keine biologische
Aktivität
beobachtet, ungeachtet ob der Ligand membrangebunden oder in Form
eines Fc-Dimers des löslichen
Liganden präsentiert
wurde. Im Hinblick auf den Elk-Rezeptor wurden jedoch chimäre EGFR-Elk-Rezeptoren
(bei welchen die extrazelluläre
Domäne
des EGFR mit der cytoplasmatischen Domäne von Elk verknüpft ist)
verwendet, um die funktionelle Intaktheit (gemessen durch die durch
EGF stimulierte Selbstphosphorylierung) der enzymatischen Domäne dieses
Rezeptors zu zeigen (Lhotak und Pawson, Mol. Cell. Biol. 13 (1993),
7071–7079).
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen neuen als Efl-6 bezeichneten
Polypeptidliganden, welcher an die Elk-, Nuk/Cek5, Hek2/Sek4-, Htk-
und Sek1-Rezeptoren
auf Zellen bindet, und solche Liganden codierende Nucleinsäuren bereit.
Wichtiger ist, dass die Erfindung ein Mittel zur Herstellung von
biologisch aktiven, löslichen
Formen dieses Liganden bereitstellt, welche zur Förderung
einer besonderen Funktion und/oder Beeinflussung des Phänotyps wie
Wachstum und/oder Vermehrung von den Rezeptor tragenden Zellen nützlich sind.
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung deshalb ein isoliertes
und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, welches
das Efl-6 [Eph transmembrane tyrosine kinase family ligands-6]-Protein
codiert, bereit, wobei die Sequenz der Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend
aus:
- (a) der Sequenz der DNA, die reifes Efl-6-Protein
codiert, enthalten in dem Plasmid pBluescriptSK–Efl-6, das
am 19. Oktober 1995 bei der American Type Culture Collection hinterlegt
wurde und die Bezeichnung 97319 hat;
- (b) der Sequenz der DNA, die reifes Efl-6-Protein mit der Aminosäuresequenz,
wie in 1 dargestellt, codiert; und
- (c) DNA-Sequenzen, die als Folge des genetischen Codes zu einer
DNA-Sequenz von
(a) oder (b) degeneriert sind und welche ein Efl-6-Protein codieren,
das an die Elk-Unterfamilie von Eph-Rezeptoren: Elk, Nuk/Cek5, Hek
2/Sek 4, Htk, und Sek 1 bindet.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung isoliertes
und gereinigtes reifes Efl-6-Protein mit einer Aminosäuresequenz,
wie in 1 dargestellt, oder ein Fragment davon, das zum
Binden an den Elk-Rezeptor fähig
ist, bereit.
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In
noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine
isolierte Nucleinsäure,
codierend die extrazelluläre
Domäne
von Efl-6 (sEfl-6) mit einer Sequenz, ausgewählt aus den Folgenden bereit:
- (a) der Sequenz, dargestellt von Nucleotid
274 bis Nucleotid 873 der 1; und
- (b) einer Sequenz, die die extrazelluläre Domäne von Efl-6, wie dargestellt
in 1, codiert.
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Die
Erfindung stellt auch Vektoren, welche eine erfindungsgemäße Nucleinsäure umfassen,
und Wirtszellen, welche solche Vektoren enthalten, bereit. Sie stellt
weiterhin Verfahren für
die Herstellung von Efl-6 oder sEfl-6-Liganden bereit, umfassend
die Züchtung
von Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Herstellung des Liganden
erlauben, und das Gewinnen des so hergestellten Liganden. Die Erfindung
stellt auch Antikörper bereit,
welche spezifisch an diese Liganden binden.
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Gemäß der Erfindung
können
hier beschriebene lösliche
Formen der Liganden verwendet werden, um biologische Reaktionen
in Elk-, Nuk/Cek5-, Hek2/Sek4-, Htk- und Sek1-Rezeptoren exprimierenden
Zellen zu fördern.
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Insbesondere
wird hier ein allgemeines Verfahren beschrieben, welches eine „Clusterbildung" von Liganden für mit Eph
verwandte Rezeptoren bewirkt, was bewirkt, dass ansonsten inaktive
lösliche
Liganden biologisch aktiv gemacht werden, oder was die biologische
Aktivität
von Liganden steigert, welche in Abwesenheit einer solchen Clusterbildung
nur niedrige Niveaus biologischer Aktivität hätten.
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Die
hier beschriebenen Liganden haben auch eine diagnostische Nutzbarkeit.
Insbesondere können Verfahren
zum Nachweis von Abweichungen in ihrer Funktion oder Expression
verwendet werden, um neurologische oder andere Erkrankungen zu diagnostizieren.
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In
anderen Ausführungsformen
kann die Manipulation der Wechselwirkung zwischen den Liganden und
ihren verwandten Rezeptoren in Testsystemen, welche dazu ausgelegt
sind, sowohl Agonisten als auch Antagonisten von Eph-Rezeptorliganden
zu identifizieren, verwendet werden. Solche Agonisten und Antagonisten
können
zur Verwendung bei der letztendlichen Behandlung von neurologischen
oder anderen Erkrankungen entwickelt werden.
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Die
Erfindung stellt weiterhin Arzneimittel, umfassend ein Efl-6-Protein
oder ein Fragment davon, welches an den Elk-Rezeptor bindet, und
einen pharmakologisch verträglichen
Träger
bereit.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1.
Nucleotid- und codierte Proteinsequenz von Efl-6. Die mutmaßliche Signalsequenz
wird durch etwa Nucleotid 202 bis etwa Nucleotid 273 codiert. Die
codierende Region des reifen Proteins beginnt bei etwa Nucleotid
274 und endet bei etwa Nucleotid 1224. Der hinterlegte Clon hat
ein A bei Position 698. Diese Änderung
erzeugte eine Aminosäureveränderung
von Q (Gln) nach R (Arg). Die codierende Region für die mutmaßliche Transmembrandomäne wird
unterstrichen gezeigt. Die Aminosäuresequenz der codierten extrazellulären Domäne, welche
durch etwa Nucleotid 274 bis etwa Nucleotid 873 codiert wird, wird
in Fettdruck gezeigt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen neuen Polypeptidliganden bereit,
welcher an den Elk-Rezeptor bindet. Der neue erfindungsgemäße Polypeptidligand
ist auch fähig
andere Mitglieder der Elk-Unterklasse von Eph-Rezeptoren, einschließlich Nuk/Cek5,
Hek2/Sek4 und Htk, genauso wie den einzigen Rezeptor, von welchem
bekannt ist, dass er „Subklassen überschreitet", bekannt als Sek1
(Brambilla und Klein, Mol. Cell. Neurosci., 6 (1995), 487–495; Gale
et al., Neuron 17 (1996), 9–19),
zu binden. Entsprechend bezieht sich, wie hier verwendet, der „Elk"-Rezeptor auf Elk genauso wie auf die
vorstehenden Rezeptoren, von denen bekannt ist, dass sie die Elk-Liganden
binden.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein Mittel bereit, um biologisch aktive,
lösliche
Formen des Efl-6-Liganden herzustellen, welche nützlich sind eine bestimmte
Funktion von den Rezeptor tragenden Zellen zu fördern und/oder den Phänotyp wie
Wachstum und/oder Vermehrung von den Rezeptor tragenden Zellen zu
beeinflussen. Die Erfindung stellt auch einen solchen Polypeptidliganden
codierende Nucleinsäuren
und sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Expressionssysteme
zur Herstellung dieses Proteins bereit. Die Erfindung stellt auch
Antikörper
gegen diesen Liganden bereit.
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Der
neue hier beschriebene Ligand wird als Efl (Eph transmembrane tyrosine
kinase family ligands)-6 bezeichnet. Eine als pbluescript SK– encoding
Efl-6 bezeichnete Hinterlegung wurde am 19. Oktober 1995 bei der
American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer
97319.
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Entsprechend
der Erfindung können
lösliche
Formen des Elk-Liganden (hier als Efl-6 bezeichnet) dazu verwendet
werden, biologische Antworten in den Elk-Rezeptor exprimierenden Zellen zu fördern. Insbesondere
wir hier ein allgemeines Verfahren beschrieben, welches eine „Clusterbildung" des Efl-6-Liganden
erzeugt, was bewirkt, dass der ansonsten inaktive lösliche Ligand
biologisch aktiv wird, oder was die biologische Aktivität des Liganden,
welcher ohne eine solche Clusterbildung nur geringe Niveaus biologischer
Aktivität
hätte, verstärkt.
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Der
hier beschriebene Efl-6-Ligand kann auch eine diagnostische Nutzbarkeit
haben. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Verfahren
zum Nachweis von Abweichungen in seiner Funktion oder Expression
bei der Diagnose neurologischer oder anderer Erkrankungen verwendet
werden. In anderen Ausführungsformen
kann die Manipulation der Wechselwirkung zwischen dem Liganden und
seinem verwandten Rezeptor bei der Behandlung von neurologischen
oder anderen Erkrankungen verwendet werden.
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Wenn
es hier verwendet wird, schließt
Efl-6 funktionell gleichwertige Moleküle ein, in welchen Aminosäurereste
Reste in der Sequenz ersetzen, was eine stille Veränderung
ergibt. Zum Beispiel kann ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste
in der Sequenz durch eine andere Aminosäure gleicher Polarität ersetzt
werden, welche als funktionelles Äquivalent wirkt, was eine stille Änderung
ergibt. Ersatz für
eine Aminosäure
in der Sequenz kann aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu welcher
die Aminosäure
gehört,
ausgewählt werden.
Zum Beispiel schließen
die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin,
Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren
neutralen Aminosäuren
schließen
Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin
ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin
ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und
Glutaminsäure
ein. Proteine oder Fragmente davon, welche die gleiche oder eine ähnliche
biologische Aktivität
aufweisen, und Abkömmlinge,
welche während
oder nach der Translation zum Beispiel durch Glycosylierung, proteolytische
Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder an
einen anderen zellulären Liganden
und so weiter unterschiedlich modifiziert werden, sind im Umfang
der Erfindung auch eingeschlossen.
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Zellen,
welche Efl-6 exprimieren, können
dies natürlicherweise
tun oder können,
wie vorstehend beschrieben, durch Transfektion, Transduktion, Elektroporation,
Mikroinjektion, über
ein transgenes Tier und so weiter von Nucleinsäuren in einem geeigneten Expressionsvektor,
welche, wie hier beschrieben, Efl-6 codieren, genetisch verändert sein,
um diesen Liganden herzustellen. Ein die Efl-6 codierende cDNA enthaltender Vektor,
welcher bei der American Type Culture Collection unter den Bedingungen
des Budapester Vertrages am 19. Oktober 1995 als pBluescriptSK–Efl-6
hinterlegt wurde, erhielt die ATCC-Bezeichnung 97319.
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Die
Nucleinsäuren,
mit welchen sich die Erfindung befasst, schließen die Sequenzen, wie sie
in der Hinterlegung enthalten sind und wie sie in 1 dargestellt
werden, und Nucleinsäuresequenzen,
welche zu den vorstehenden Sequenzen als Ergebnis des genetischen
Codes degeneriert sind, welche aber (einen) Liganden) codieren,
der (die) an den Elk-Rezeptor bindet (binden), ein.
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Zusätzlich befasst
sich die vorliegende Erfindung mit der Verwendung der hier beschriebenen
Liganden in löslichen
Formen, verkürzten
Formen und markierten Formen. Dies schließt monomere Formen des Liganden
ein, welche an den Rezeptor binden und als Antagonist wirken können.
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Jegliches
der dem Fachmann bekannten Verfahren zum Einfügen von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann verwendet
werden, um unter Verwendung geeigneter Transcriptions/Translations-Kontrollsignale
und der das Protein codierenden Sequenzen Efl-6 codierende Expressionsvektoren
zusammenzusetzen. Diese Verfahren können rekombinante DNA- und
Synthesetechniken in vitro und Rekombinationen in vivo (genetische
Rekombination) einschließen.
Die Expression von Efl-6 oder Peptidfragmente davon codierenden
Nucleinsäuresequenzen
kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz
reguliert werden, so dass das Protein oder Peptid in einem mit dem
rekombinanten DNA-Molekül
transformierten Wirt exprimiert wird. Zum Beispiel kann die Expression
des hier beschriebenen Efl-6 durch jegliches im Fachgebiet bekanntes
Promotor/Enhancer-Element kontrolliert werden. Promotoren, welche
zur Kontrolle der Expression der Liganden verwendet werden können, schließen die
lange terminale Wiederholung, wie in Squinto et al. beschrieben
(Cell 65 (1991), 1–20),
die Region des frühen
SV40-Promotors (Bernoist und Chambon, Nature 290 (1981), 304–310), den CMV-Promotor,
die 5'-terminale M-MuLV-Wiederholung,
den in der 3'-terminalen
langen Wiederholung enthaltenen Promotor des Rous-Sarcom-Virus (Yamamoto
et al., Cell 22 (1980), 787–797),
den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U,S,A 78 (1981), 144–1445),
die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster
et al., Nature 296 (1982), 39–42),
prokaryontische Expressionsvektoren wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 75 (1978), 3727–3731) oder den
tas-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 80 (1983),
21–25),
siehe auch "Useful
proteins from recombinant bacteria" in Scientific American 242 (1980),
74–94,
Promtorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen wie den Gal 4-Promotor,
den ADH (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, PGK (Phosphoglycerinkinase)-Promotor,
den Promotor der alkalischen Phosphatase und die folgenden tierischen
Transkriptionskontrollregionen, welche Gewebespezifität zeigen
und in transgenen Tieren verwendet wurden: die Kontrollregion des Elastase
I-Gens, welche in den Azinuszellen des Pankreas aktiv ist (Swift,
et al., Cell 38 (1984), 639–646;
Ornitz, et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 (1986),
399–409;
MacDonald, Hepatology 7 (1987), 425–515); die Kontrollregion des
Insulingens, welche in den Beta-Zellen des Pankreas aktiv ist (Hanahan,
Nature 315 (1985), 115–122);
die Kontrollregion des Immunglobulingens, welche in lymphoiden Zellen
aktiv ist (Grosschedl et al., Cell 38 (1984), 647–658; Adames
et al., Nature 318 (1985), 533–538;
Alexander et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 1436–1444),
die Kontrollregion des Maus-Brusttumor-Virus, welche in Hoden-,
Brust-, lymphoiden und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., Cell
45 (1986), 485–495),
die Kontrollregion des Albumingens, welche in der Leber aktiv ist
(Pinkert et al., Genes and Devel. 1 (1987), 268–276), die Kontrollregion des
Alpha-Fetoproteingens, welche in der Leber aktiv ist (Krumlauf et
al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 1639–1648; Hammer et al., Science
235 (1987), 53–58);
die Kontrollregion des Alpha 1-Antitrypsingens, welche in der Leber aktiv
ist (Kelsey et al, Genes and Devel. 1 (1987), 161–171), die
Kontrollregion des Beta-Globingens,
welche in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., Nature 315
(1985), 338–340;
Kollias et al., Cell 46 (1986), 89–94); die Kontrollregion des
Gens des basischen Myelinproteins, welche in oligodendrocytischen
Zellen im Hirn aktiv ist (Readhead et al., Cell 48 (1987), 703–712); die
Kontrollregion des Gens der leichten Myosinkette-2, welche im Skelettmuskel
aktiv ist (Shani, Nature 314 (1985), 283–286) und die Kontrollregion
des Gens des Gonadotropinreleasinghormons, welche im Hypothalamus
aktiv ist (Mason et al., Science 234 (1986), 1372–1378) ein, sind
aber nicht auf diese beschränkt.
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Somit
werden gemäß der Erfindung
Expressionsvektoren, welche zur Replikation in einem bakteriellen oder
eukaryontischen Wirt fähig
sind und Efl-6 codierende Nucleinsäure, wie hier beschrieben,
umfassen, verwendet, um den Wirt zu transfizieren und dadurch die
Expression einer solchen Nucleinsäure zu steuern, um die Efl-6-Proteine
herzustellen, welche dann in einer biologisch aktiven Form gewonnen
werden können.
Wie hier verwendet, schließt
eine biologisch aktive Form eine Form ein, welche zur Bindung an
den entsprechenden Rezeptor wie Elk fähig ist und eine bestimmte
Funktion auslöst
und/oder den Phänotyp
der den Rezeptor exprimierenden Zellen beeinflusst. Solche biologisch
aktiven Formen würden
zum Beispiel die Phosphorylierung der Tyrosinkinasedomäne des Elk-Rezeptors
oder die Stimulation der Synthese zellulärer DNA auslösen. Alternativ
schließen
biologisch aktive Elf-6-Liganden monomere Formen ein, welche den
Rezeptor binden und als Antagonisten wirken.
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Expressionsvektoren,
welche die Geninsertionen enthalten, können durch drei allgemeine
Ansätze identifiziert
werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Anwesenheit oder Abwesenheit
von „Markierungs"-Genfunktionen und
(c) Expression der eingefügten
Sequenzen. Im ersten Ansatz kann die Anwesenheit eines fremden Gens,
welches in einen Expressionsvektor eingefügt wurde, durch DNA-DNA-Hybridisierung
unter Verwendung von Sonden, welche Sequenzen umfassen, die homolog
zu einem eingefügten
efl-6-Gen sind, nachgewiesen werden. Im zweiten Ansatz kann das
rekombinante Vektor/Wirt-System basierend auf der Anwesenheit oder
Abwesenheit von bestimmten „Markierungs"-Genfunktionen (zum
Beispiel der Tymidinkinaseaktivität, der Resistenz gegen Antibiotika,
dem Transformationsphänotyp,
der Einschlusskörperbildung
in Baculoviren und so weiter), welche durch das Einfügen des
fremden Gens in den Vektor bedingt wird, identifiziert und selektioniert
werden. Wenn zum Beispiel das efl-6-Gen in die Markierungsgensequenz
des Vektors eingefügt
wird, können
Rekombinanten, welche die Insertion enthalten, durch die Abwesenheit
der Markierungsgenfunktion identifiziert werden. Im dritten Ansatz
können
rekombinante Expressionsvektoren durch die Testung auf das durch
die Rekombinante exprimierte fremde Genprodukt identifiziert werden.
Solche Tests können
zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften
des efl-6-Genprodukts zum Beispiel durch Bindung des Liganden an
den Elk-Rezeptor oder einen Teil davon, welcher zum Beispiel mit
einem nachweisbaren Antikörper
oder einem Teil davon markiert sein kann, oder durch Bindung an
Antikörper,
welche gegen das Elf-6-Protein oder einen Teil davon hergestellt
wurden, aufgebaut sein.
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Efl-6
scheint ein konventionelles Transmembranprotein mit einer cytoplasmatischen
Domäne
zu sein. Die Transmembrandomäne
wird in 1 unterstrichen gezeigt. Entsprechend
wird die lösliche
oder extrazelluläre
Domäne
des Liganden (sEfl-6) durch die Nucleotidsequenz von etwa Nucleotid
274 bis etwa Nucleotid 873 codiert.
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Die
hier beschriebenen Liganden können
als membrangebundene Formen in Expressionssystemen mit tierischen
Zellen oder können
in löslicher
Form exprimiert werden. Lösliche
Formen der Liganden können unter
Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren exprimiert werden.
Eine gängig
verwendete Strategie schließt
die Verwendung von Oligonucleotidprimern ein, von welchen einer
den N-Terminus der Proteins umfasst und der andere die Region genau
stromaufwärts
von einem hydrophoben Abschnitt des Proteins, welcher entweder die
GPI-Linker-Erkennungsdomäne
oder eine Transmembrandomäne
des Proteins darstellt, umfasst. Das die C-Terminusregion umfassende
Oligonucleotid wird modifiziert, so dass es ein Stoppcodon vor der
hydrophoben Domäne
enthält.
Die zwei Oligonucleotide werden verwendet, um eine modifizierte
Version des Gens zu vervielfältigen,
welche ein Protein codiert, das sezerniert wird anstatt membrangebunden
zu sein. Alternativ kann eine gut geeignete Restriktionsstelle im
Vektor verwendet werden, um eine veränderte Sequenz einzufügen, welche
die GPI-Linker-Erkennungsregion
oder die Transmembrandomäne
entfernt und so einen Vektor ergibt, welcher fähig ist, eine sezernierte Form
des Proteins zu exprimieren. Das so hergestellte lösliche Protein
würde die
Region des Proteins vom N-Terminus bis zur der GPI-Erkennungsdomäne oder Transmembrandomäne vorangehenden
Region einschließen.
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Die
Anmelder haben herausgefunden, dass, obwohl die entsprechend der
Erfindung hergestellten löslichen
Liganden an die Rezeptoren in der Eph-Unterfamilie binden, solche löslichen
Liganden oft geringe oder keine biologische Aktivität haben.
Solche lösliche
Liganden werden entsprechend der vorliegenden Erfindung durch Liganden-„Clusterbildung" aktiviert. „Clusterbildung" bezieht sich, wie
hier verwendet, auf jegliches dem Fachmann bekannte Verfahren zur
Erzeugung von Multimeren der hier beschriebenen löslichen
Abschnitte der Liganden.
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In
einer Ausführungsform
ist ein „geclustertes" elf-6 ein Dimer,
welches zum Beispiel entsprechend der vorliegenden Erfindung unter
Verwendung der Fc-Domäne von IgG
hergestellt wurde (Aruffo et al., Cell 67 (1991), 35–44), was
die Expression des löslichen
Liganden als über
Disulfide verbundenes Homodimer ergibt. In einer anderen Ausführungsform
werden sezernierte Formen des Liganden mit Epitopmarkierungen an
ihren C-Termini erstellt; anti-Markierungs-Antikörper werden dann verwendet,
um die Liganden zu aggregieren.
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Zusätzlich befasst
sich die Erfindung mit anderen „erstellten" Ligandenmolekülen, welche
als Multimere vorliegen oder solche bilden. Zum Beispiel können Dimere
der extrazellulären
Domänen
unter Verwendung von Leucin-Zippern erstellt werden. Von den Leucin-Zipper-Domänen der
menschlichen Transcriptionsfaktoren c-jun und c-fos wurde gezeigt,
dass sie mit einer 1:1-Stöchiometrie
stabile Heterodimere bilden (Busch und Sassone-Corsi, Trends Genetics
6 (1990), 36–40;
Gentz et al., Science 243 (1989): 1695–1699). Obwohl von jun-jun-Homodimeren
auch gezeigt worden ist, dass sie gebildet werden, sind sie etwa
1000-fach weniger stabil als jun-fos-Heterodimere. Fos-fos-Homodimere
wurden nicht nachgewiesen. Die Leucin-Zipper-Domäne von entweder c-jun oder
c-fos werden durch
genetische Erstellung chimärer
Gene im Leserahmen mit dem C-Terminus
der löslichen
oder extrazellulären
Domänen
der vorstehend erwähnten
Liganden verknüpft.
Die Fusionen können
direkt sein oder sie können
eine flexible Linkerdomäne
wie die Gelenkregion des menschlichen IgG oder Polypeptidlinker,
welche aus kleinen Aminosäuren
wie Glycin, Serin, Threonin oder Alanin bestehen, in verschiedenen
Längen
und Kombinationen verwenden. Zusätzlich
können
die chimären
Proteine durch His-His-His-His-His-His (His6) markiert sein, um
eine schnelle Reinigung durch Metall-Chelat-Chromatographie zu erlauben,
und/oder durch Epitope markiert sein, gegen welche Antikörper verfügbar sind,
um einen Nachweis durch Western-Blots, Immunpräzipitation oder Aktivitäts-Entzug/Blockierung
in Biotests zu erlauben.
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Alternativ
können
Multimere durch genetische Erstellung und Expression von Molekülen hergestellt werden,
welche aus dem löslichen
oder extrazellulären
Abschnitt des Liganden, gefolgt von der Fc-Domäne des hlgG und gefolgt von
entweder den vorstehend beschriebenen c-jun- oder den vorstehend
beschriebenen c-fos-Leucin-Zippern (Kostelny et al., J. Immunol.
148 (1992), 1547–1553)
bestehen. Da diese Leucin-Zipper überwiegend Heterodimere bilden,
können
sie verwendet werden, um, wo dies erwünscht ist, die Bildung der Heterodimere
zu bewirken. Im Fall der beschriebenen, Leucin-Zipper verwendenden,
chimären
Proteine können
diese auch mit Metallchelaten oder einem Epitop markiert sein. Diese
Markierungsdomäne
kann zur schnellen Reinigung durch Metallchelatchromatographie und/oder
Antikörper
verwendet werden und um den Nachweis durch Western-Blots, Immunpräzipitation
oder Aktivitäts-Entzug/Blockierung
in Biotests zu erlauben.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden multimere, lösliche Liganden durch Expression
als chimäre
Moleküle
unter Verwendung flexibler Linkerschleifen hergestellt. Ein das
chimäre
Protein codierendes DNA-Konstrukt wird so entworfen, dass es zwei
oder mehr lösliche
oder extrazelluläre
Domänen, welche
miteinander in einer Tandem-Form („Kopf-an-Kopf") durch eine flexible
Schleife verknüpft
sind, exprimiert. Diese Schleife kann vollständig künstlich (zum Beispiel in einem
bestimmten Abstand durch Serin oder Threonin unterbrochene Polyglycin-Wiederholungen) oder
aus natürlich
auftretenden Proteinen (zum Beispiel der Gelenkregion von hlgG) „entliehen" sein. Moleküle können erstellt
werden, in welchen die Länge
und Zusammensetzung der Schleife variiert wird, um die Auswahl von
Molekülen
mit gewünschten
Eigenschaften zu erlauben. Obwohl die Anmelder nicht wünschen durch
eine Theorie gebunden zu sein, glauben sie, dass die Membranbindung
der Liganden die Clusterbildung erleichtert, was wiederum die Multimerisierung
und Aktivierung von Rezeptoren fördert.
So wird entsprechend der Erfindung die biologische Aktivität des löslichen
Liganden durch die Imitation der Clusterbildung von membranassoziierten
Liganden in Lösung
erreicht. Somit umfasst ein biologisch aktiver, „geclusterter", löslicher
Ligand der eph-Familie (lösliches
Efl)n, wobei das lösliche efl
die extrazelluläre
Domäne
eines Liganden ist, welcher einen Rezeptor der eph-Familie bindet
und n gleich 2 oder größer ist.
Wie hier beschrieben, wird Elf-6 entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren
biologisch aktiv gemacht.
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In
jedem Fall wird ein Fachmann erkennen, dass der Erfolg der Clusterbildung
die Untersuchung der biologischen Aktivität unter Verwendung von Biotests
wie jene, die hier beschrieben sind, erfordert. Zum Beispiel kann
die durch Stimulierung von Rezeptoren exprimierenden Reporterzellen
mit die Membranformen der Liganden überexprimierenden COS-Zellen,
löslichen
Formen der Liganden und „geclusterten" Liganden ausgelöste Phosphorylierung
von Rezeptoren verglichen werden.
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Obwohl
in manchen Fällen
die Dimerisierung des Liganden ausreichend ist, um biologische Aktivität auszulösen, werden
in bestimmten Fällen
die hier beschriebenen Verfahren verwendet, um die Hinlänglichkeit eines
bestimmten Clusterbildungsverfahrens zu bestimmen. Oft scheint die
Dimerisierung eines löslichen
Liganden unter Verwendung von Fc unzureichend zu sein, um eine biologische
Antwort zu erreichen, doch kann noch weitere erfindungsgemäße Clusterbildung
des Liganden unter Verwendung von anti-Fc-Antikörpern eine wesentliche Zunahme
der biologischen Aktivität
ergeben.
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Erfindungsgemäße Zellen
können
transient oder bevorzugt konstitutiv und anhaltend Efl-6 in seiner natürlichen
Form oder in löslicher
Form als markiertes Efl-6 oder „geclustertes" Elf-6, wie hier
beschrieben, exprimieren.
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Der
rekombinante Faktor kann durch jegliches Verfahren gereinigt werden,
welches die nachfolgende Bildung von stabilem, biologisch aktivem
Protein erlaubt. Zum Beispiel und nicht im Sinne einer Eingrenzung kann
der Faktor entweder als lösliches
Protein oder als Einschlusskörperchen,
aus welchen es quantitativ durch 8 M Guanidiniumhydrochlorid und
Dialyse extrahiert werden kann, aus Zellen gewonnen werden. Um den
Faktor weiter zu reinigen, kann die konventionelle Ionenaustauschchromatographie,
hydrophobe Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie oder Gelfiltration verwendet
werden.
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In
zusätzlichen
erfindungsgemäßen Ausführungsformen
kann rekombinantes efl-6 verwendet werden, um das endogene Gen durch
homologe Rekombination zu inaktivieren oder ein „Knock-out" zu erzeugen und dadurch eine für das Efl-6-Protein
defiziente Zelle, defizientes Gewebe oder Tier zu erzeugen. Zum
Beispiel und nicht im Sinne einer Eingrenzung kann rekombinantes
efl erstellt werden, um eine Einschubmutation, zum Beispiel das
neo-Gen, welches das natürliche
efl-6-Gen inaktivieren würde,
zu enthalten. Solch ein Konstrukt unter der Kontrolle eines geeigneten
Promotors kann in eine Zelle wie eine embryonale Stammzelle durch
ein Verfahren wie Transfektion, Transduktion, Injektion und so weiter
eingebracht werden. Zellen, welche das Konstrukt enthalten, können dann
durch G418-Resistenz selektioniert werden. Zellen, welchen ein intaktes
elf-6 fehlt, können
dann zum Beispiel durch Erstellen von Southern-Blots oder Northern-Blots
oder durch Testung der Expression identifiziert werden. Zellen,
welchen ein intaktes efl-6 fehlt, können dann mit frühen Embryozellen
fusioniert werden, um transgene Tiere zu erzeugen, welche für einen
solchen Liganden defizient sind. Ein Vergleich eines solchen Tiers
mit einem Tier, welches endogenes Efl-6 exprimiert, würde bei
der Aufklärung
der Rolle der Liganden in Entwicklung und Erhaltung helfen. Solch
ein Tier kann verwendet werden, um spezifische Nervenzellpopulationen
oder jegliche andere in vivo-Prozesse, welche normalerweise von
diesem Liganden abhängen,
zu definieren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper gegen das hier beschriebene
Efl-6 bereit, welche zum Nachweis des Liganden in zum Beispiel diagnostischen
Anwendungen nützlich
sind. Antikörper
gegen den Liganden können
auch zum Erreichen einer Clusterbildung gemäß der Erfindung nützlich sein.
In Fällen,
in denen ein endogener Ligand existiert, kann der Antikörper selbst
als therapeutisch wirksame Substanz durch die Aktivierung von existierendem
Liganden wirken.
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Zur
Herstellung gegen Elf-6 gerichteter monoclonaler Antikörper kann
jegliches Verfahren, welches die Herstellung von Antikörpermolekülen durch
kontinuierliche Zelllinien in Kultur bereitstellt, verwendet werden. Zum
Beispiel das ursprünglich
von Köhler
und Milstein entwickelte Hybridomverfahren (Nature 256 (1975), 495–497) genauso
wie das Triom-Verfahren, das menschliche B-Zell-Hybridom-Verfahren (Kozbor et al., Immunology
Today 4 (1983), 72) und das EBV-Hybridom-Verfahren
zur Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper (Cole et al., in "Monoclonal Antibodies
and Cancer Therapy," Alan
R. Liss, Inc. (1985), Seiten 77–96) und Ähnliches
liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung.
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Die
monoclonalen Antikörper
zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung können menschliche
monoclonale Antikörper
oder chimäre
monoclonale Mensch-Maus (oder andere Arten)-Antikörper sein. Menschliche
Antikörper
können
durch jegliches der zahlreichen im Fachgebiet bekannten Verfahren
(zum Beispiel Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 80 (1983),
7308–7312;
Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72–79; Olsson et al., Meth. Enzymol.
92 (1982), 3–16)
hergestellt werden. Chimäre
Antikörpermoleküle, welche
eine antigenbindende Domäne
aus der Maus mit menschlichen konstanten Regionen enthalten, können hergestellt
werden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 81 (1984),
6851; Takeda et al., Nature 314 (1985), 452).
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Verschiedene
im Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Herstellung von polyclonalen
Antikörpern
gegen Epitope des hier beschriebenen Elf-6 verwendet werden. Für die Herstellung
von Antikörper
können
verschiedene Wirtstiere, einschließlich, aber nicht auf diese
begrenzt, Kaninchen, Mäuse,
Ratten und so weiter durch Injektion von Elf-6 oder einem Fragment
davon immunisiert werden. Verschiedene Adjuvantien können verwendet
werden, um abhängig
von der Wirtsspezies und einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Freudsches
Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid,
oberflächenaktiver
Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl-Emulsionen, KLH („keyhole
limpet hemocyanins"),
Dinitrophenol und möglicherweise
nützliche
menschliche Adjuvantien wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium
parvum, die immunologische Antwort zu steigern.
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Ein
molekularer Clon eines Antikörpers
gegen ein ausgewähltes
Efl-6-Epitop kann durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Rekombinante
DNA-Methodik (siehe zum Beispiel Maniatis, et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Cold
Spring Harbor, New York) kann verwendet werden, um Nucleinsäuresequenzen
zu erstellen, welche ein monoclonales Antikörpermolekül oder eine Antigenbindungsregion
davon codieren.
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Antikörpermoleküle können durch
bekannte Verfahren zum Beispiel Immunabsorption oder Immunaffinitätschromatographie,
chromatographische Verfahren wie HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)
oder eine Kombination davon und so weiter gereinigt werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Antikörpermoleküle sowie Fragmente solcher
Antikörpermoleküle bereit.
Antikörperfragmente,
welche den Idiotyp des Moleküls
enthalten, können
durch bekannte Verfahren erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche
Fragmente, sind aber nicht darauf beschränkt: das F(ab')2-Fragment, welches
durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls hergestellt
werden kann; die Fab'-Fragmente, welche
durch Reduktion der Disulfidbrücken
des F(ab')2- Fragmentes
erzeugt werden können,
und die Fab-Fragmente, welche durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain
und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können, ein.
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Die
erfindungsgemäßen Liganden
können
zur Behandlung von Patienten, welche an einer neurologischen Erkrankung
leiden, durch Behandlung des Patienten mit einer wirksamen Menge
des Efl-6 oder Peptidfragmenten davon, welche zur Bindung des Elk-Rezeptors
fähig sind,
verwendet werden.
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Der
Elk-Rezeptor wird auch hauptsächlich
im Hirn exprimiert. Entsprechend wird angenommen, dass der hier
beschriebene Elk-bindende Ligand bei diesen Rezeptor exprimierenden
Nervenzellen die Auslösung einer
bestimmten Funktion unterstützen
wird und/oder den Phänotyp
wie Wachstum und/oder Überleben
beeinflussen wird. Wie in Gale et al., Oncogene 13 (1996), 1343–1352, beschrieben,
ist Efl-6 (im Zitat als Elk-Ligand 3 beschrieben) wegen seiner bemerkenswert
beschränkten
und ausgeprägten
Expression in der Bodenplatte und Dachplatte des sich entwickelnden
Neuralrohres und seiner für
das Rhombomer spezifischen Expression im sich entwickelnden Rautenhirn
beachtenswert. Diese Verteilung legt eine Rolle von Efl-6 und seinem
reziproken Rezeptor in der Leitung und Grenzbildung im Nervensystem,
kritischen Punkten in der Organisation des sich entwickelnden zentralen
Nervensystems des Wirbeltiers, nahe.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel, umfassend das hier
beschriebene Elf-6 oder Peptidfragmente davon, in einem geeigneten
pharmakologischen Träger,
bereit.
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Die
Elf-6-Proteine oder Peptidfragmente können systemisch oder lokal
verabreicht werden. Jeglicher im Fachgebiet bekannte, geeignete
Verabreichungsweg kann verwendet werden, einschließlich, aber
nicht darauf begrenzt, intravenös,
intrathekal, intraarteriell, intranasal, oral, subkutan, intraperitoneal
oder durch lokale Injektion oder chirurgisches Implantat. Formulierungen
mit verzögerter
Freisetzung werden ebenfalls bereitgestellt.
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Wenn
unser Verständnis
von neurodegenerativen Erkrankungen/Neurotraumata klarer wird, kann
es offenbar werden, dass es vorteilhaft wäre, die Wirkung von endogenem
Elf-6 zu verringern. Deshalb kann es wünschenswert sein, in Gebieten
von Verletzungen des Nervensystems Efl-6- Antagonisten bereitzustellen, einschließlich, aber
nicht auf diese beschränkt,
löslicher
Formen von Efl-6, welche mit zellgebundenem Liganden um die Interaktion
mit dem Elk-Rezeptor konkurrieren können. Alternativ können lösliche Formen
der Elk-Rezeptoren (zum Beispiel exprimiert als „Rezeptorkörper" und, wie hier beschrieben, hergestellt)
durch Bindung und dadurch Inaktivierung des Liganden als Antagonisten
wirken. Es kann wünschenswert
sein, solche Antagonisten anstatt systemisch lokal an der Stelle
der Verletzung bereitzustellen. Die Verwendung eines den Efl-6-Antagonisten
bereitstellenden Implantats kann wünschenswert sein.
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Alternativ
können
bestimmte Krankheiten von einer Steigerung der Ansprechbarkeit von
Elf-6 profitieren. Es kann daher vorteilhaft sein, die Zahl oder
Bindungsaffinität
von Efl-6 in Patienten die, an solchen Zuständen leiden, zu steigern. Dies
könnte
durch Gentherapie unter Verwendung von entweder Efl-6, Elf-6 exprimierenden
Zellen, Elk-Rezeptor oder Rezeptor-Chimären (Zellen, welche die extrazelluläre Domäne des Elk-Rezeptors
exprimieren) erreicht werden. Die selektive Expression solcher rekombinanter
Proteine in geeigneten Zellen könnte
durch die Verwendung ihrer durch gewebespezifische oder induzierbare
Promotoren gesteuerten codierenden Gene oder durch das Hervorrufen
einer lokalisierten Infektion mit für die Replikation defizienten
und die rekombinanten Gene tragenden Viren erreicht werden.
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Die
Efl-6 codierende DNA, wie sie bei der ATCC hinterlegt wurde und
die Zugangsnummer 97319 hat, wurde aus einer Genbibliothek von menschlichem
Him (frontaler Cortex) von Stratagene (La Jolla, Kalifornien) (Katalognummer
936212) isoliert. Die Genbibliothek ist im Vektor λZAPII. Die
Sequenz der Efl-6 codierenden Region dieses Vektors ist in 1 dargestellt.
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Tests
oder eine Aufreinigung des Efl-6-Proteins können unter Verwendung eines
Elk-Rezeptorkörpers, welcher
aus der extrazellulären
Domäne
von Elk, verknüpft
mit der konstanten Region von IgG1, besteht, durchgeführt werden.
Dieser Rezeptorkörper
wird wie folgt hergestellt: Der Fc-Teil von menschlichem IgG1, beginnend
von der Gelenkregion und sich bis zum Carboxy-Terminus des Moleküls erstreckend,
wurde aus Plazenta-cDNA unter Verwendung von PCR mit Oligonucleotiden,
welche der veröffentlichten
Sequenz von menschlichem IgG1 entsprechen, cloniert. Günstige Restriktionsstellen
wurden ebenfalls in die Oligonucleotide eingeschlossen, um so die
Clonierung des PCR-Fragmentes in einen Expressionsvektor zu erlauben.
Die Rezeptoren voller Länge
enthaltenden Expressionsvektoren wurden entweder durch Restriktionsenzymspaltungen
oder durch PCR-Strategien verändert,
um so die Transmembran- und intrazellulären Domänen durch Restriktionsschnittstellen
zu ersetzen, die eine Clonierung des menschlichen IgG1-Fragmentes
in diese Stellen erlauben; dies wurde so durchgeführt, um
ein Fusionsprotein mit der Rezeptorektodomäne als seinem Amino-Terminus und dem
Fc-Teil des menschlichen IgG1 als seinem Carboxy-Terminus zu erzeugen.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Rezeptorkörpern wird
in Goodwin et al., Cell 73 (1993), 447–456, beschrieben.
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HINTERLEGUNG
VON MIKROORGANISMEN
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Der
folgende Vektor wurde bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 in Übereinstimmung
mit dem Budapester Vertrag hinterlegt.
HINTERLEGUNG | ZUGANGSNUMMER |
pBluescript
SK–Efl-6 | 97319 |
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Die
vorliegende Erfindung ist im Umfang nicht durch die bestimmten,
hier beschriebenen Ausführungsformen
zu begrenzen. Tatsächlich
werden verschiedene Veränderungen
der Erfindung, zusätzlich
zu denen, die hier beschrieben sind, aus der vorstehenden Beschreibung
und den begleitenden Figuren für
den Fachmann offensichtlich werden. Von solchen Veränderungen
ist beabsichtigt, dass sie in den Umfang der anhängenden Ansprüche fallen.
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