DE69635667T2

DE69635667T2 - Biologisch aktive liganden der eph familie

Info

Publication number: DE69635667T2
Application number: DE69635667T
Authority: DE
Inventors: Samuel Davis; W. Nicholas GALE; D. George YANCOPOULOS
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-10-25
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2016-10-26
Also published as: WO1997015667A1; JPH11514238A; DE69635667D1; ATE314470T1; AU7477896A; US6602683B1; IL124202A; US20030215918A1; AU712737B2; EP0859840B1; EP0859840A1

Description

Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Liganden, welcher Proteine bindet, die zur EPH-Unterfamilie von rezeptorartigen Protein-Tyrosinkinasen gehören, wie den Elk-Rezeptor und Verfahren zur Herstellung löslicher Formen dieses Liganden, welche biologisch aktiv sind, bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Fähigkeit von Polypeptidliganden, Zellen zu binden und dadurch eine phänotypische Antwort wie Zellwachstum, Überleben oder Differenzierung hervorzurufen, wird oft durch Transmembran-Tyrosinkinasen vermittelt. Der extrazelluläre Teil jeder Rezeptortyrosinkinase (RTK) ist im Allgemeinen der kennzeichnendste Teil des Moleküls, da er dem Protein seine Liganden erkennende Eigenschaft verleiht. Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne führt zu einer Signaltransduktion über eine katalytische intrazelluläre Tyrosinkinasedomäne, welche ein biologisches Signal auf intrazelluläre Zielproteine überträgt. Die besondere Anordnung von Sequenzmotiven dieser cytoplasmatischen, katalytischen Domäne bestimmt ihren Zugang zu möglichen Kinasesubstraten (Mohammadi et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1990), 5068–5078; Fantl et al., Cell, 69 (1992), 413–413).
RTKs scheinen in Folge der Ligandenbindung eine Dimerisierung oder eine verwandte konformationelle Änderung durchzumachen (Schlessinger J., Trend Biochem. Sci. 13 (1988), 443–447; Ullrich und Schlessinger, Cell 61 (1990), 203–212; Schlessinger und Ullrich, Neuron 9 (1992), 383–391); molekulare Wechselwirkungen zwischen dimerisierenden cytoplasmatischen Domänen führen zur Aktivierung der Kinasefunktion. In einigen Fällen wie dem Wachstumsfaktor von Blutplättchen abstammender Wachstumsfaktor (PDGF) ist der Ligand ein Dimer, welches zwei Rezeptormoleküle bindet (Hart et al., Science 240 (1988), 1529–1531; Heldin, J. Biol. Chem. 264 (1989), 8905–8912), während zum Beispiel im Fall von EGF der Ligand ein Monomer ist (Weber et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 14631–14636).
Die Gewebeverteilung eines bestimmten Tyrosinkinaserezeptors in höheren Organismen stellt wichtige Daten in Bezug auf die biologische Funktion des Rezeptors bereit. Die Tyrosinkinaserezeptoren für einige Wachstums- und Differenzierungsfaktoren wie Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) werden verbreitet exprimiert und scheinen deshalb eine allgemeine Rolle bei Wachstum und Erhalt von Geweben zu spielen. Mitglieder der Trk-RTK-Familie (Glass & Yancopoulos, Trends in Cell Biol 3 (1993), 262–268) von Rezeptoren sind im Allgemeinen eher auf Zellen des Nervensystems begrenzt und die Nervenwachstumsfaktor-Familie, bestehend aus NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5 (bekannt als die Neurotrophine), welche diese Rezeptoren bindet, fördert die Differenzierung von verschiedenen Gruppen von Nervenzellen in Hirn und Peripherie (Lindsay R. M. in Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin & J.H. Fallon, Hrsg., (1993) Seiten 257–284 (San Diego, CA: Academic Press). Die Lokalisierung eines solchen Rezeptors der Trk-Familie, trkB, im Gewebe stellt einen gewissen Einblick in die mögliche biologische Rolle dieses Rezeptors genauso wie der Liganden, welche diesen Rezeptor binden (hier als Verwandte bezeichnet), bereit. So wurde zum Beispiel von trkB in erwachsenen Mäusen herausgefunden, dass es bevorzugt in Hirngewebe exprimiert wird, obwohl wesentliche Spiegel von trkB-mRNAs auch in Lunge, Muskel und Eierstöcken beobachtet wurden. Weitere trkB-Transkripte wurden in Embryos aus der mittleren und späten Gestationsphase gefunden. In situ-Hybridisierungsuntersuchungen von 14 und 18 Tage alten Mausembryos zeigten auf, dass trkB-Transkripte in den zentralen und peripheren Nervensystemen, einschließlich des Hirns, des Rückenmarks, der Rückenmarks- und Schädelganglien, des Truncus paravertebralis des sympathischen Nervensystems und verschiedener Innervationswege lokalisiert waren, was nahe legt, dass das trkB-Genprodukt ein an der Neurogenese und frühen neuralen Entwicklung beteiligter Rezeptor sein könnte und genauso eine Rolle im reifen Nervensystem spielen könnte.
Die zelluläre Umgebung, in welcher eine RTK exprimiert wird, kann die bei Bindung eines Liganden an den Rezeptor gezeigte biologische Antwort beeinflussen. So ergibt sich zum Beispiel, wenn eine einen Trk-Rezeptor exprimierende Nervenzelle einem Neurotrophin ausgesetzt wird, welches diesen Rezeptor bindet, Überleben und Differenzierung der Nervenzelle. Wenn der gleiche Rezeptor von einem Fibroblasten exprimiert wird, ergibt die Exposition gegenüber dem Neurotrophin eine Vermehrung des Fibroblasten (Glass et al., Cell 66 (1991), 405–413). Somit scheint es, dass die extrazelluläre Domäne den bestimmenden Faktor in Bezug auf die Ligandenspezifität bereitstellt und, sobald die Signaltransduktion ausgelöst ist, die zelluläre Umgebung das phänotypische Ergebnis dieser Signaltransduktion bestimmen wird.
Basierend auf Sequenzhomologien in ihrer intrazellulären Domäne wurde eine Anzahl von RTK-Familien identifiziert. Die von NGF verwendeten Rezeptor- und Signaltranduktionswege schließen das Produkt des trk-Protoonkogens ein (Kaplan et al., Nature 350 (1991), 156–160; Klein et al., Cell 65 (1991), 189–197). Klein et al. (EMBO J. 8 (1989), 3701–3709) berichteten über die Isolierung von trkB, welches ein zweites Mitglied der Protein-Tyrosinkinase-Familie von Rezeptoren codiert, von denen herausgefunden wurde, dass sie in hohem Maße mit dem menschlichen trk-Protoonkogen verwandt ist. TrkB bindet und vermittelt die funktionellen Antworten auf BDNF, NT-4 und in einem geringeren Ausmaß NT-3 (Squinto et al., Cell 65 (1991), 885–903; Ip et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 89 (1992), 3060–3064; Klein et al., Neuron, 8 (1992), 947–956). Auf der Aminosäureebene wurde von den Produkten von trk und trkB herausgefunden, dass sie, einschließlich 9 der 11 in trk vorhandenen Cysteine, eine Homologie von 57 Prozent in ihren extrazellulären Regionen teilen. Es wurde herausgefunden, dass diese Homologie in ihren jeweiligen katalytischen Tyrosinkinasedomänen auf 88 Prozent zunimmt. Die Trk-Genfamilie wurde nun ausgeweitet, um den trkC-Lokus einzuschließen, wobei NT-3 als der bevorzugte Ligand für trkC identifiziert wurde (Lamballe et al., Cell 66 (1991), 967–979; Valenzuela et al., Neuron 10 (1993), 963–974).
Die mit Eph verwandten Transmembran-Tyrosinkinasen umfassen die größte bekannte Familie von rezeptorartigen Tyrosinkinasen, wobei viele Mitglider eine spezifische Expression im sich entwickelnden und im reifen Nervensystem zeigen.
Zwei neue Mitglieder der Eph-RTK-Familie, bezeichnet als Ehk (Eph Homology Kinase) –1 und –2 wurden unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR)-basierten Durchmusterung von im Hirn exprimierten Genen identifiziert (Maisonpierre et al., Oncogene 8 (1993), 3277–388). Diese Gene scheinen ausschließlich im Nervensystem exprimiert zu werden, wobei die Expression von Ehk-1 früh in der Entwicklung des Nervensystems beginnt. Kürzlich wurde ein neues Mitglied dieser Gruppe von verwandten Rezeptoren, Ehk-3, cloniert (Valenzuela et al., Oncogene 10 (1995), 1573–1580).
Das elk-Gen codiert eine rezeptorartige Protein-Tyrosinkinase, welche auch zur eph-Unterfamilie gehört und welche fast ausschließlich im Hirn (und auf niedrigeren Niveaus in den Hoden) exprimiert wird (Letwin et al., Oncogene 3 (1988), 621–678; Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991), 2496–2502). Gründend auf seinem Expressionsprofil wird von dem Elk-Rezeptor und seinem verwandten Liganden erwartet, dass sie einen Rolle bei Interaktionen von Zelle zu Zelle im Nervensystem spielen. Andere Mitglieder der Eph-Familie von Rezeptoren, die in die gleiche Unterklasse wie Elk fallen, schließen die Nuk/Cek5-, Hek2/Sek4- und Htk-Rezeptoren ein (Brambilla und Klein, Mol. Cell. Neurosci. 6 (1995), 487–495; Gale et al., Neuron 17 (1996), 9–19).
Ungleich den Ehks und Elk-Rezeptoren scheint der eng verwandte Eck-Rezeptor in einer eher pleiotropen Weise zu funktionieren; er wurde in Nerven-, Epithel- und Skelettgeweben identifiziert und scheint bei der Gastrulation und bei craniofacialen Stellen der Musterbildung und Stellen der Musterbildung an den Extremitätenknospen im Mausembryo beteiligt zu sein (Ganju et al., Oncogene 9 (1994), 1613–1624).
Die Identifizierung einer großen Zahl von Rezeptortyrosinkinasen hat die Identifizierung ihrer verwandten Liganden weit übertroffen. Im besten Fall stellt die Bestimmung der Gewebe, in welchen solche Rezeptoren exprimiert werden, einen Einblick in die Regulation des Wachstums, der Vermehrung und Regeneration von Zellen in Zielgeweben bereit. Weil die RTKs eine Anzahl von wichtigen Funktionen während der Entwicklung zu vermitteln scheinen, werden ihre verwandten Liganden unvermeidlich eine entscheidende Rolle in der Entwicklung spielen.
Obwohl eine Zahl von Schemata zur Identifizierung von verwandten Liganden für die vielen verwaisten Rezeptoren, welche identifiziert worden sind, entwickelt wurde, wurden sehr wenige solcher Liganden identifiziert und die Liganden, welche bis jetzt identifiziert worden sind, scheinen keine andere Aktivität zu haben, als ihren verwandten Rezeptor zu binden. Zum Beispiel beschreibt die Internationale Veröffentlichung Nummer WO/94/11020, veröffentlicht am 26. Mai 1994, Liganden, welche an den Eck-Rezeptor binden. Insbesondere wird der Ligand EBP (auch bekannt als B61) beschrieben. Obwohl jedoch die Bindung von B61 an den Eck-Rezeptor offenbart wird, wird keine biologische Aktivität beschrieben. Ähnlich wurde trotz der Beschreibung eines Liganden in der PCT Veröffentlichung Nummer WO94/11384 (veröffentlicht am 26. Mai 1994), welcher den Elk-Rezeptor bindet, keine biologische Aktivität beobachtet, ungeachtet ob der Ligand membrangebunden oder in Form eines Fc-Dimers des löslichen Liganden präsentiert wurde. Im Hinblick auf den Elk-Rezeptor wurden jedoch chimäre EGFR-Elk-Rezeptoren (bei welchen die extrazelluläre Domäne des EGFR mit der cytoplasmatischen Domäne von Elk verknüpft ist) verwendet, um die funktionelle Intaktheit (gemessen durch die durch EGF stimulierte Selbstphosphorylierung) der enzymatischen Domäne dieses Rezeptors zu zeigen (Lhotak und Pawson, Mol. Cell. Biol. 13 (1993), 7071–7079).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen als Efl-6 bezeichneten Polypeptidliganden, welcher an die Elk-, Nuk/Cek5, Hek2/Sek4-, Htk- und Sek1-Rezeptoren auf Zellen bindet, und solche Liganden codierende Nucleinsäuren bereit. Wichtiger ist, dass die Erfindung ein Mittel zur Herstellung von biologisch aktiven, löslichen Formen dieses Liganden bereitstellt, welche zur Förderung einer besonderen Funktion und/oder Beeinflussung des Phänotyps wie Wachstum und/oder Vermehrung von den Rezeptor tragenden Zellen nützlich sind.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung deshalb ein isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, welches das Efl-6 [Eph transmembrane tyrosine kinase family ligands-6]-Protein codiert, bereit, wobei die Sequenz der Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) der Sequenz der DNA, die reifes Efl-6-Protein codiert, enthalten in dem Plasmid pBluescriptSK^–Efl-6, das am 19. Oktober 1995 bei der American Type Culture Collection hinterlegt wurde und die Bezeichnung 97319 hat;
(b) der Sequenz der DNA, die reifes Efl-6-Protein mit der Aminosäuresequenz, wie in 1 dargestellt, codiert; und
(c) DNA-Sequenzen, die als Folge des genetischen Codes zu einer DNA-Sequenz von (a) oder (b) degeneriert sind und welche ein Efl-6-Protein codieren, das an die Elk-Unterfamilie von Eph-Rezeptoren: Elk, Nuk/Cek5, Hek 2/Sek 4, Htk, und Sek 1 bindet.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung isoliertes und gereinigtes reifes Efl-6-Protein mit einer Aminosäuresequenz, wie in 1 dargestellt, oder ein Fragment davon, das zum Binden an den Elk-Rezeptor fähig ist, bereit.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nucleinsäure, codierend die extrazelluläre Domäne von Efl-6 (sEfl-6) mit einer Sequenz, ausgewählt aus den Folgenden bereit:

(a) der Sequenz, dargestellt von Nucleotid 274 bis Nucleotid 873 der 1; und
(b) einer Sequenz, die die extrazelluläre Domäne von Efl-6, wie dargestellt in 1, codiert.

Die Erfindung stellt auch Vektoren, welche eine erfindungsgemäße Nucleinsäure umfassen, und Wirtszellen, welche solche Vektoren enthalten, bereit. Sie stellt weiterhin Verfahren für die Herstellung von Efl-6 oder sEfl-6-Liganden bereit, umfassend die Züchtung von Wirtszellen unter Bedingungen, welche die Herstellung des Liganden erlauben, und das Gewinnen des so hergestellten Liganden. Die Erfindung stellt auch Antikörper bereit, welche spezifisch an diese Liganden binden.
Gemäß der Erfindung können hier beschriebene lösliche Formen der Liganden verwendet werden, um biologische Reaktionen in Elk-, Nuk/Cek5-, Hek2/Sek4-, Htk- und Sek1-Rezeptoren exprimierenden Zellen zu fördern.
Insbesondere wird hier ein allgemeines Verfahren beschrieben, welches eine „Clusterbildung" von Liganden für mit Eph verwandte Rezeptoren bewirkt, was bewirkt, dass ansonsten inaktive lösliche Liganden biologisch aktiv gemacht werden, oder was die biologische Aktivität von Liganden steigert, welche in Abwesenheit einer solchen Clusterbildung nur niedrige Niveaus biologischer Aktivität hätten.
Die hier beschriebenen Liganden haben auch eine diagnostische Nutzbarkeit. Insbesondere können Verfahren zum Nachweis von Abweichungen in ihrer Funktion oder Expression verwendet werden, um neurologische oder andere Erkrankungen zu diagnostizieren.
In anderen Ausführungsformen kann die Manipulation der Wechselwirkung zwischen den Liganden und ihren verwandten Rezeptoren in Testsystemen, welche dazu ausgelegt sind, sowohl Agonisten als auch Antagonisten von Eph-Rezeptorliganden zu identifizieren, verwendet werden. Solche Agonisten und Antagonisten können zur Verwendung bei der letztendlichen Behandlung von neurologischen oder anderen Erkrankungen entwickelt werden.
Die Erfindung stellt weiterhin Arzneimittel, umfassend ein Efl-6-Protein oder ein Fragment davon, welches an den Elk-Rezeptor bindet, und einen pharmakologisch verträglichen Träger bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Nucleotid- und codierte Proteinsequenz von Efl-6. Die mutmaßliche Signalsequenz wird durch etwa Nucleotid 202 bis etwa Nucleotid 273 codiert. Die codierende Region des reifen Proteins beginnt bei etwa Nucleotid 274 und endet bei etwa Nucleotid 1224. Der hinterlegte Clon hat ein A bei Position 698. Diese Änderung erzeugte eine Aminosäureveränderung von Q (Gln) nach R (Arg). Die codierende Region für die mutmaßliche Transmembrandomäne wird unterstrichen gezeigt. Die Aminosäuresequenz der codierten extrazellulären Domäne, welche durch etwa Nucleotid 274 bis etwa Nucleotid 873 codiert wird, wird in Fettdruck gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Polypeptidliganden bereit, welcher an den Elk-Rezeptor bindet. Der neue erfindungsgemäße Polypeptidligand ist auch fähig andere Mitglieder der Elk-Unterklasse von Eph-Rezeptoren, einschließlich Nuk/Cek5, Hek2/Sek4 und Htk, genauso wie den einzigen Rezeptor, von welchem bekannt ist, dass er „Subklassen überschreitet", bekannt als Sek1 (Brambilla und Klein, Mol. Cell. Neurosci., 6 (1995), 487–495; Gale et al., Neuron 17 (1996), 9–19), zu binden. Entsprechend bezieht sich, wie hier verwendet, der „Elk"-Rezeptor auf Elk genauso wie auf die vorstehenden Rezeptoren, von denen bekannt ist, dass sie die Elk-Liganden binden.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Mittel bereit, um biologisch aktive, lösliche Formen des Efl-6-Liganden herzustellen, welche nützlich sind eine bestimmte Funktion von den Rezeptor tragenden Zellen zu fördern und/oder den Phänotyp wie Wachstum und/oder Vermehrung von den Rezeptor tragenden Zellen zu beeinflussen. Die Erfindung stellt auch einen solchen Polypeptidliganden codierende Nucleinsäuren und sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Expressionssysteme zur Herstellung dieses Proteins bereit. Die Erfindung stellt auch Antikörper gegen diesen Liganden bereit.
Der neue hier beschriebene Ligand wird als Efl (Eph transmembrane tyrosine kinase family ligands)-6 bezeichnet. Eine als pbluescript SK^– encoding Efl-6 bezeichnete Hinterlegung wurde am 19. Oktober 1995 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer 97319.
Entsprechend der Erfindung können lösliche Formen des Elk-Liganden (hier als Efl-6 bezeichnet) dazu verwendet werden, biologische Antworten in den Elk-Rezeptor exprimierenden Zellen zu fördern. Insbesondere wir hier ein allgemeines Verfahren beschrieben, welches eine „Clusterbildung" des Efl-6-Liganden erzeugt, was bewirkt, dass der ansonsten inaktive lösliche Ligand biologisch aktiv wird, oder was die biologische Aktivität des Liganden, welcher ohne eine solche Clusterbildung nur geringe Niveaus biologischer Aktivität hätte, verstärkt.
Der hier beschriebene Efl-6-Ligand kann auch eine diagnostische Nutzbarkeit haben. In bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen können Verfahren zum Nachweis von Abweichungen in seiner Funktion oder Expression bei der Diagnose neurologischer oder anderer Erkrankungen verwendet werden. In anderen Ausführungsformen kann die Manipulation der Wechselwirkung zwischen dem Liganden und seinem verwandten Rezeptor bei der Behandlung von neurologischen oder anderen Erkrankungen verwendet werden.
Wenn es hier verwendet wird, schließt Efl-6 funktionell gleichwertige Moleküle ein, in welchen Aminosäurereste Reste in der Sequenz ersetzen, was eine stille Veränderung ergibt. Zum Beispiel kann ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenz durch eine andere Aminosäure gleicher Polarität ersetzt werden, welche als funktionelles Äquivalent wirkt, was eine stille Änderung ergibt. Ersatz für eine Aminosäure in der Sequenz kann aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu welcher die Aminosäure gehört, ausgewählt werden. Zum Beispiel schließen die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. Proteine oder Fragmente davon, welche die gleiche oder eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen, und Abkömmlinge, welche während oder nach der Translation zum Beispiel durch Glycosylierung, proteolytische Spaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder an einen anderen zellulären Liganden und so weiter unterschiedlich modifiziert werden, sind im Umfang der Erfindung auch eingeschlossen.
Zellen, welche Efl-6 exprimieren, können dies natürlicherweise tun oder können, wie vorstehend beschrieben, durch Transfektion, Transduktion, Elektroporation, Mikroinjektion, über ein transgenes Tier und so weiter von Nucleinsäuren in einem geeigneten Expressionsvektor, welche, wie hier beschrieben, Efl-6 codieren, genetisch verändert sein, um diesen Liganden herzustellen. Ein die Efl-6 codierende cDNA enthaltender Vektor, welcher bei der American Type Culture Collection unter den Bedingungen des Budapester Vertrages am 19. Oktober 1995 als pBluescriptSK^–Efl-6 hinterlegt wurde, erhielt die ATCC-Bezeichnung 97319.
Die Nucleinsäuren, mit welchen sich die Erfindung befasst, schließen die Sequenzen, wie sie in der Hinterlegung enthalten sind und wie sie in 1 dargestellt werden, und Nucleinsäuresequenzen, welche zu den vorstehenden Sequenzen als Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind, welche aber (einen) Liganden) codieren, der (die) an den Elk-Rezeptor bindet (binden), ein.
Zusätzlich befasst sich die vorliegende Erfindung mit der Verwendung der hier beschriebenen Liganden in löslichen Formen, verkürzten Formen und markierten Formen. Dies schließt monomere Formen des Liganden ein, welche an den Rezeptor binden und als Antagonist wirken können.
Jegliches der dem Fachmann bekannten Verfahren zum Einfügen von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um unter Verwendung geeigneter Transcriptions/Translations-Kontrollsignale und der das Protein codierenden Sequenzen Efl-6 codierende Expressionsvektoren zusammenzusetzen. Diese Verfahren können rekombinante DNA- und Synthesetechniken in vitro und Rekombinationen in vivo (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression von Efl-6 oder Peptidfragmente davon codierenden Nucleinsäuresequenzen kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz reguliert werden, so dass das Protein oder Peptid in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird. Zum Beispiel kann die Expression des hier beschriebenen Efl-6 durch jegliches im Fachgebiet bekanntes Promotor/Enhancer-Element kontrolliert werden. Promotoren, welche zur Kontrolle der Expression der Liganden verwendet werden können, schließen die lange terminale Wiederholung, wie in Squinto et al. beschrieben (Cell 65 (1991), 1–20), die Region des frühen SV40-Promotors (Bernoist und Chambon, Nature 290 (1981), 304–310), den CMV-Promotor, die 5'-terminale M-MuLV-Wiederholung, den in der 3'-terminalen langen Wiederholung enthaltenen Promotor des Rous-Sarcom-Virus (Yamamoto et al., Cell 22 (1980), 787–797), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 78 (1981), 144–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., Nature 296 (1982), 39–42), prokaryontische Expressionsvektoren wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 75 (1978), 3727–3731) oder den tas-Promotor (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 80 (1983), 21–25), siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American 242 (1980), 74–94, Promtorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen wie den Gal 4-Promotor, den ADH (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, PGK (Phosphoglycerinkinase)-Promotor, den Promotor der alkalischen Phosphatase und die folgenden tierischen Transkriptionskontrollregionen, welche Gewebespezifität zeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden: die Kontrollregion des Elastase I-Gens, welche in den Azinuszellen des Pankreas aktiv ist (Swift, et al., Cell 38 (1984), 639–646; Ornitz, et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 (1986), 399–409; MacDonald, Hepatology 7 (1987), 425–515); die Kontrollregion des Insulingens, welche in den Beta-Zellen des Pankreas aktiv ist (Hanahan, Nature 315 (1985), 115–122); die Kontrollregion des Immunglobulingens, welche in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., Cell 38 (1984), 647–658; Adames et al., Nature 318 (1985), 533–538; Alexander et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 1436–1444), die Kontrollregion des Maus-Brusttumor-Virus, welche in Hoden-, Brust-, lymphoiden und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., Cell 45 (1986), 485–495), die Kontrollregion des Albumingens, welche in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., Genes and Devel. 1 (1987), 268–276), die Kontrollregion des Alpha-Fetoproteingens, welche in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1985), 1639–1648; Hammer et al., Science 235 (1987), 53–58); die Kontrollregion des Alpha 1-Antitrypsingens, welche in der Leber aktiv ist (Kelsey et al, Genes and Devel. 1 (1987), 161–171), die Kontrollregion des Beta-Globingens, welche in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., Nature 315 (1985), 338–340; Kollias et al., Cell 46 (1986), 89–94); die Kontrollregion des Gens des basischen Myelinproteins, welche in oligodendrocytischen Zellen im Hirn aktiv ist (Readhead et al., Cell 48 (1987), 703–712); die Kontrollregion des Gens der leichten Myosinkette-2, welche im Skelettmuskel aktiv ist (Shani, Nature 314 (1985), 283–286) und die Kontrollregion des Gens des Gonadotropinreleasinghormons, welche im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., Science 234 (1986), 1372–1378) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Somit werden gemäß der Erfindung Expressionsvektoren, welche zur Replikation in einem bakteriellen oder eukaryontischen Wirt fähig sind und Efl-6 codierende Nucleinsäure, wie hier beschrieben, umfassen, verwendet, um den Wirt zu transfizieren und dadurch die Expression einer solchen Nucleinsäure zu steuern, um die Efl-6-Proteine herzustellen, welche dann in einer biologisch aktiven Form gewonnen werden können. Wie hier verwendet, schließt eine biologisch aktive Form eine Form ein, welche zur Bindung an den entsprechenden Rezeptor wie Elk fähig ist und eine bestimmte Funktion auslöst und/oder den Phänotyp der den Rezeptor exprimierenden Zellen beeinflusst. Solche biologisch aktiven Formen würden zum Beispiel die Phosphorylierung der Tyrosinkinasedomäne des Elk-Rezeptors oder die Stimulation der Synthese zellulärer DNA auslösen. Alternativ schließen biologisch aktive Elf-6-Liganden monomere Formen ein, welche den Rezeptor binden und als Antagonisten wirken.
Expressionsvektoren, welche die Geninsertionen enthalten, können durch drei allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Anwesenheit oder Abwesenheit von „Markierungs"-Genfunktionen und (c) Expression der eingefügten Sequenzen. Im ersten Ansatz kann die Anwesenheit eines fremden Gens, welches in einen Expressionsvektor eingefügt wurde, durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden, welche Sequenzen umfassen, die homolog zu einem eingefügten efl-6-Gen sind, nachgewiesen werden. Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirt-System basierend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von bestimmten „Markierungs"-Genfunktionen (zum Beispiel der Tymidinkinaseaktivität, der Resistenz gegen Antibiotika, dem Transformationsphänotyp, der Einschlusskörperbildung in Baculoviren und so weiter), welche durch das Einfügen des fremden Gens in den Vektor bedingt wird, identifiziert und selektioniert werden. Wenn zum Beispiel das efl-6-Gen in die Markierungsgensequenz des Vektors eingefügt wird, können Rekombinanten, welche die Insertion enthalten, durch die Abwesenheit der Markierungsgenfunktion identifiziert werden. Im dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch die Testung auf das durch die Rekombinante exprimierte fremde Genprodukt identifiziert werden. Solche Tests können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des efl-6-Genprodukts zum Beispiel durch Bindung des Liganden an den Elk-Rezeptor oder einen Teil davon, welcher zum Beispiel mit einem nachweisbaren Antikörper oder einem Teil davon markiert sein kann, oder durch Bindung an Antikörper, welche gegen das Elf-6-Protein oder einen Teil davon hergestellt wurden, aufgebaut sein.
Efl-6 scheint ein konventionelles Transmembranprotein mit einer cytoplasmatischen Domäne zu sein. Die Transmembrandomäne wird in 1 unterstrichen gezeigt. Entsprechend wird die lösliche oder extrazelluläre Domäne des Liganden (sEfl-6) durch die Nucleotidsequenz von etwa Nucleotid 274 bis etwa Nucleotid 873 codiert.
Die hier beschriebenen Liganden können als membrangebundene Formen in Expressionssystemen mit tierischen Zellen oder können in löslicher Form exprimiert werden. Lösliche Formen der Liganden können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren exprimiert werden. Eine gängig verwendete Strategie schließt die Verwendung von Oligonucleotidprimern ein, von welchen einer den N-Terminus der Proteins umfasst und der andere die Region genau stromaufwärts von einem hydrophoben Abschnitt des Proteins, welcher entweder die GPI-Linker-Erkennungsdomäne oder eine Transmembrandomäne des Proteins darstellt, umfasst. Das die C-Terminusregion umfassende Oligonucleotid wird modifiziert, so dass es ein Stoppcodon vor der hydrophoben Domäne enthält. Die zwei Oligonucleotide werden verwendet, um eine modifizierte Version des Gens zu vervielfältigen, welche ein Protein codiert, das sezerniert wird anstatt membrangebunden zu sein. Alternativ kann eine gut geeignete Restriktionsstelle im Vektor verwendet werden, um eine veränderte Sequenz einzufügen, welche die GPI-Linker-Erkennungsregion oder die Transmembrandomäne entfernt und so einen Vektor ergibt, welcher fähig ist, eine sezernierte Form des Proteins zu exprimieren. Das so hergestellte lösliche Protein würde die Region des Proteins vom N-Terminus bis zur der GPI-Erkennungsdomäne oder Transmembrandomäne vorangehenden Region einschließen.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass, obwohl die entsprechend der Erfindung hergestellten löslichen Liganden an die Rezeptoren in der Eph-Unterfamilie binden, solche löslichen Liganden oft geringe oder keine biologische Aktivität haben. Solche lösliche Liganden werden entsprechend der vorliegenden Erfindung durch Liganden-„Clusterbildung" aktiviert. „Clusterbildung" bezieht sich, wie hier verwendet, auf jegliches dem Fachmann bekannte Verfahren zur Erzeugung von Multimeren der hier beschriebenen löslichen Abschnitte der Liganden.
In einer Ausführungsform ist ein „geclustertes" elf-6 ein Dimer, welches zum Beispiel entsprechend der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Fc-Domäne von IgG hergestellt wurde (Aruffo et al., Cell 67 (1991), 35–44), was die Expression des löslichen Liganden als über Disulfide verbundenes Homodimer ergibt. In einer anderen Ausführungsform werden sezernierte Formen des Liganden mit Epitopmarkierungen an ihren C-Termini erstellt; anti-Markierungs-Antikörper werden dann verwendet, um die Liganden zu aggregieren.
Zusätzlich befasst sich die Erfindung mit anderen „erstellten" Ligandenmolekülen, welche als Multimere vorliegen oder solche bilden. Zum Beispiel können Dimere der extrazellulären Domänen unter Verwendung von Leucin-Zippern erstellt werden. Von den Leucin-Zipper-Domänen der menschlichen Transcriptionsfaktoren c-jun und c-fos wurde gezeigt, dass sie mit einer 1:1-Stöchiometrie stabile Heterodimere bilden (Busch und Sassone-Corsi, Trends Genetics 6 (1990), 36–40; Gentz et al., Science 243 (1989): 1695–1699). Obwohl von jun-jun-Homodimeren auch gezeigt worden ist, dass sie gebildet werden, sind sie etwa 1000-fach weniger stabil als jun-fos-Heterodimere. Fos-fos-Homodimere wurden nicht nachgewiesen. Die Leucin-Zipper-Domäne von entweder c-jun oder c-fos werden durch genetische Erstellung chimärer Gene im Leserahmen mit dem C-Terminus der löslichen oder extrazellulären Domänen der vorstehend erwähnten Liganden verknüpft. Die Fusionen können direkt sein oder sie können eine flexible Linkerdomäne wie die Gelenkregion des menschlichen IgG oder Polypeptidlinker, welche aus kleinen Aminosäuren wie Glycin, Serin, Threonin oder Alanin bestehen, in verschiedenen Längen und Kombinationen verwenden. Zusätzlich können die chimären Proteine durch His-His-His-His-His-His (His6) markiert sein, um eine schnelle Reinigung durch Metall-Chelat-Chromatographie zu erlauben, und/oder durch Epitope markiert sein, gegen welche Antikörper verfügbar sind, um einen Nachweis durch Western-Blots, Immunpräzipitation oder Aktivitäts-Entzug/Blockierung in Biotests zu erlauben.
Alternativ können Multimere durch genetische Erstellung und Expression von Molekülen hergestellt werden, welche aus dem löslichen oder extrazellulären Abschnitt des Liganden, gefolgt von der Fc-Domäne des hlgG und gefolgt von entweder den vorstehend beschriebenen c-jun- oder den vorstehend beschriebenen c-fos-Leucin-Zippern (Kostelny et al., J. Immunol. 148 (1992), 1547–1553) bestehen. Da diese Leucin-Zipper überwiegend Heterodimere bilden, können sie verwendet werden, um, wo dies erwünscht ist, die Bildung der Heterodimere zu bewirken. Im Fall der beschriebenen, Leucin-Zipper verwendenden, chimären Proteine können diese auch mit Metallchelaten oder einem Epitop markiert sein. Diese Markierungsdomäne kann zur schnellen Reinigung durch Metallchelatchromatographie und/oder Antikörper verwendet werden und um den Nachweis durch Western-Blots, Immunpräzipitation oder Aktivitäts-Entzug/Blockierung in Biotests zu erlauben.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden multimere, lösliche Liganden durch Expression als chimäre Moleküle unter Verwendung flexibler Linkerschleifen hergestellt. Ein das chimäre Protein codierendes DNA-Konstrukt wird so entworfen, dass es zwei oder mehr lösliche oder extrazelluläre Domänen, welche miteinander in einer Tandem-Form („Kopf-an-Kopf") durch eine flexible Schleife verknüpft sind, exprimiert. Diese Schleife kann vollständig künstlich (zum Beispiel in einem bestimmten Abstand durch Serin oder Threonin unterbrochene Polyglycin-Wiederholungen) oder aus natürlich auftretenden Proteinen (zum Beispiel der Gelenkregion von hlgG) „entliehen" sein. Moleküle können erstellt werden, in welchen die Länge und Zusammensetzung der Schleife variiert wird, um die Auswahl von Molekülen mit gewünschten Eigenschaften zu erlauben. Obwohl die Anmelder nicht wünschen durch eine Theorie gebunden zu sein, glauben sie, dass die Membranbindung der Liganden die Clusterbildung erleichtert, was wiederum die Multimerisierung und Aktivierung von Rezeptoren fördert. So wird entsprechend der Erfindung die biologische Aktivität des löslichen Liganden durch die Imitation der Clusterbildung von membranassoziierten Liganden in Lösung erreicht. Somit umfasst ein biologisch aktiver, „geclusterter", löslicher Ligand der eph-Familie (lösliches Efl)n, wobei das lösliche efl die extrazelluläre Domäne eines Liganden ist, welcher einen Rezeptor der eph-Familie bindet und n gleich 2 oder größer ist. Wie hier beschrieben, wird Elf-6 entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren biologisch aktiv gemacht.
In jedem Fall wird ein Fachmann erkennen, dass der Erfolg der Clusterbildung die Untersuchung der biologischen Aktivität unter Verwendung von Biotests wie jene, die hier beschrieben sind, erfordert. Zum Beispiel kann die durch Stimulierung von Rezeptoren exprimierenden Reporterzellen mit die Membranformen der Liganden überexprimierenden COS-Zellen, löslichen Formen der Liganden und „geclusterten" Liganden ausgelöste Phosphorylierung von Rezeptoren verglichen werden.
Obwohl in manchen Fällen die Dimerisierung des Liganden ausreichend ist, um biologische Aktivität auszulösen, werden in bestimmten Fällen die hier beschriebenen Verfahren verwendet, um die Hinlänglichkeit eines bestimmten Clusterbildungsverfahrens zu bestimmen. Oft scheint die Dimerisierung eines löslichen Liganden unter Verwendung von Fc unzureichend zu sein, um eine biologische Antwort zu erreichen, doch kann noch weitere erfindungsgemäße Clusterbildung des Liganden unter Verwendung von anti-Fc-Antikörpern eine wesentliche Zunahme der biologischen Aktivität ergeben.
Erfindungsgemäße Zellen können transient oder bevorzugt konstitutiv und anhaltend Efl-6 in seiner natürlichen Form oder in löslicher Form als markiertes Efl-6 oder „geclustertes" Elf-6, wie hier beschrieben, exprimieren.
Der rekombinante Faktor kann durch jegliches Verfahren gereinigt werden, welches die nachfolgende Bildung von stabilem, biologisch aktivem Protein erlaubt. Zum Beispiel und nicht im Sinne einer Eingrenzung kann der Faktor entweder als lösliches Protein oder als Einschlusskörperchen, aus welchen es quantitativ durch 8 M Guanidiniumhydrochlorid und Dialyse extrahiert werden kann, aus Zellen gewonnen werden. Um den Faktor weiter zu reinigen, kann die konventionelle Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie oder Gelfiltration verwendet werden.
In zusätzlichen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann rekombinantes efl-6 verwendet werden, um das endogene Gen durch homologe Rekombination zu inaktivieren oder ein „Knock-out" zu erzeugen und dadurch eine für das Efl-6-Protein defiziente Zelle, defizientes Gewebe oder Tier zu erzeugen. Zum Beispiel und nicht im Sinne einer Eingrenzung kann rekombinantes efl erstellt werden, um eine Einschubmutation, zum Beispiel das neo-Gen, welches das natürliche efl-6-Gen inaktivieren würde, zu enthalten. Solch ein Konstrukt unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors kann in eine Zelle wie eine embryonale Stammzelle durch ein Verfahren wie Transfektion, Transduktion, Injektion und so weiter eingebracht werden. Zellen, welche das Konstrukt enthalten, können dann durch G418-Resistenz selektioniert werden. Zellen, welchen ein intaktes elf-6 fehlt, können dann zum Beispiel durch Erstellen von Southern-Blots oder Northern-Blots oder durch Testung der Expression identifiziert werden. Zellen, welchen ein intaktes efl-6 fehlt, können dann mit frühen Embryozellen fusioniert werden, um transgene Tiere zu erzeugen, welche für einen solchen Liganden defizient sind. Ein Vergleich eines solchen Tiers mit einem Tier, welches endogenes Efl-6 exprimiert, würde bei der Aufklärung der Rolle der Liganden in Entwicklung und Erhaltung helfen. Solch ein Tier kann verwendet werden, um spezifische Nervenzellpopulationen oder jegliche andere in vivo-Prozesse, welche normalerweise von diesem Liganden abhängen, zu definieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper gegen das hier beschriebene Efl-6 bereit, welche zum Nachweis des Liganden in zum Beispiel diagnostischen Anwendungen nützlich sind. Antikörper gegen den Liganden können auch zum Erreichen einer Clusterbildung gemäß der Erfindung nützlich sein. In Fällen, in denen ein endogener Ligand existiert, kann der Antikörper selbst als therapeutisch wirksame Substanz durch die Aktivierung von existierendem Liganden wirken.
Zur Herstellung gegen Elf-6 gerichteter monoclonaler Antikörper kann jegliches Verfahren, welches die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bereitstellt, verwendet werden. Zum Beispiel das ursprünglich von Köhler und Milstein entwickelte Hybridomverfahren (Nature 256 (1975), 495–497) genauso wie das Triom-Verfahren, das menschliche B-Zell-Hybridom-Verfahren (Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72) und das EBV-Hybridom-Verfahren zur Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper (Cole et al., in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy," Alan R. Liss, Inc. (1985), Seiten 77–96) und Ähnliches liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die monoclonalen Antikörper zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung können menschliche monoclonale Antikörper oder chimäre monoclonale Mensch-Maus (oder andere Arten)-Antikörper sein. Menschliche Antikörper können durch jegliches der zahlreichen im Fachgebiet bekannten Verfahren (zum Beispiel Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 80 (1983), 7308–7312; Kozbor et al., Immunology Today 4 (1983), 72–79; Olsson et al., Meth. Enzymol. 92 (1982), 3–16) hergestellt werden. Chimäre Antikörpermoleküle, welche eine antigenbindende Domäne aus der Maus mit menschlichen konstanten Regionen enthalten, können hergestellt werden (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U,S,A 81 (1984), 6851; Takeda et al., Nature 314 (1985), 452).
Verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Herstellung von polyclonalen Antikörpern gegen Epitope des hier beschriebenen Elf-6 verwendet werden. Für die Herstellung von Antikörper können verschiedene Wirtstiere, einschließlich, aber nicht auf diese begrenzt, Kaninchen, Mäuse, Ratten und so weiter durch Injektion von Elf-6 oder einem Fragment davon immunisiert werden. Verschiedene Adjuvantien können verwendet werden, um abhängig von der Wirtsspezies und einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Freudsches Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktiver Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl-Emulsionen, KLH („keyhole limpet hemocyanins"), Dinitrophenol und möglicherweise nützliche menschliche Adjuvantien wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum, die immunologische Antwort zu steigern.
Ein molekularer Clon eines Antikörpers gegen ein ausgewähltes Efl-6-Epitop kann durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Rekombinante DNA-Methodik (siehe zum Beispiel Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Cold Spring Harbor, New York) kann verwendet werden, um Nucleinsäuresequenzen zu erstellen, welche ein monoclonales Antikörpermolekül oder eine Antigenbindungsregion davon codieren.
Antikörpermoleküle können durch bekannte Verfahren zum Beispiel Immunabsorption oder Immunaffinitätschromatographie, chromatographische Verfahren wie HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) oder eine Kombination davon und so weiter gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Antikörpermoleküle sowie Fragmente solcher Antikörpermoleküle bereit. Antikörperfragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Verfahren erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente, sind aber nicht darauf beschränkt: das F(ab')₂-Fragment, welches durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, welche durch Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')₂- Fragmentes erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, welche durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können, ein.
Die erfindungsgemäßen Liganden können zur Behandlung von Patienten, welche an einer neurologischen Erkrankung leiden, durch Behandlung des Patienten mit einer wirksamen Menge des Efl-6 oder Peptidfragmenten davon, welche zur Bindung des Elk-Rezeptors fähig sind, verwendet werden.
Der Elk-Rezeptor wird auch hauptsächlich im Hirn exprimiert. Entsprechend wird angenommen, dass der hier beschriebene Elk-bindende Ligand bei diesen Rezeptor exprimierenden Nervenzellen die Auslösung einer bestimmten Funktion unterstützen wird und/oder den Phänotyp wie Wachstum und/oder Überleben beeinflussen wird. Wie in Gale et al., Oncogene 13 (1996), 1343–1352, beschrieben, ist Efl-6 (im Zitat als Elk-Ligand 3 beschrieben) wegen seiner bemerkenswert beschränkten und ausgeprägten Expression in der Bodenplatte und Dachplatte des sich entwickelnden Neuralrohres und seiner für das Rhombomer spezifischen Expression im sich entwickelnden Rautenhirn beachtenswert. Diese Verteilung legt eine Rolle von Efl-6 und seinem reziproken Rezeptor in der Leitung und Grenzbildung im Nervensystem, kritischen Punkten in der Organisation des sich entwickelnden zentralen Nervensystems des Wirbeltiers, nahe.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel, umfassend das hier beschriebene Elf-6 oder Peptidfragmente davon, in einem geeigneten pharmakologischen Träger, bereit.
Die Elf-6-Proteine oder Peptidfragmente können systemisch oder lokal verabreicht werden. Jeglicher im Fachgebiet bekannte, geeignete Verabreichungsweg kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, intravenös, intrathekal, intraarteriell, intranasal, oral, subkutan, intraperitoneal oder durch lokale Injektion oder chirurgisches Implantat. Formulierungen mit verzögerter Freisetzung werden ebenfalls bereitgestellt.
Wenn unser Verständnis von neurodegenerativen Erkrankungen/Neurotraumata klarer wird, kann es offenbar werden, dass es vorteilhaft wäre, die Wirkung von endogenem Elf-6 zu verringern. Deshalb kann es wünschenswert sein, in Gebieten von Verletzungen des Nervensystems Efl-6- Antagonisten bereitzustellen, einschließlich, aber nicht auf diese beschränkt, löslicher Formen von Efl-6, welche mit zellgebundenem Liganden um die Interaktion mit dem Elk-Rezeptor konkurrieren können. Alternativ können lösliche Formen der Elk-Rezeptoren (zum Beispiel exprimiert als „Rezeptorkörper" und, wie hier beschrieben, hergestellt) durch Bindung und dadurch Inaktivierung des Liganden als Antagonisten wirken. Es kann wünschenswert sein, solche Antagonisten anstatt systemisch lokal an der Stelle der Verletzung bereitzustellen. Die Verwendung eines den Efl-6-Antagonisten bereitstellenden Implantats kann wünschenswert sein.
Alternativ können bestimmte Krankheiten von einer Steigerung der Ansprechbarkeit von Elf-6 profitieren. Es kann daher vorteilhaft sein, die Zahl oder Bindungsaffinität von Efl-6 in Patienten die, an solchen Zuständen leiden, zu steigern. Dies könnte durch Gentherapie unter Verwendung von entweder Efl-6, Elf-6 exprimierenden Zellen, Elk-Rezeptor oder Rezeptor-Chimären (Zellen, welche die extrazelluläre Domäne des Elk-Rezeptors exprimieren) erreicht werden. Die selektive Expression solcher rekombinanter Proteine in geeigneten Zellen könnte durch die Verwendung ihrer durch gewebespezifische oder induzierbare Promotoren gesteuerten codierenden Gene oder durch das Hervorrufen einer lokalisierten Infektion mit für die Replikation defizienten und die rekombinanten Gene tragenden Viren erreicht werden.
Die Efl-6 codierende DNA, wie sie bei der ATCC hinterlegt wurde und die Zugangsnummer 97319 hat, wurde aus einer Genbibliothek von menschlichem Him (frontaler Cortex) von Stratagene (La Jolla, Kalifornien) (Katalognummer 936212) isoliert. Die Genbibliothek ist im Vektor λZAPII. Die Sequenz der Efl-6 codierenden Region dieses Vektors ist in 1 dargestellt.
Tests oder eine Aufreinigung des Efl-6-Proteins können unter Verwendung eines Elk-Rezeptorkörpers, welcher aus der extrazellulären Domäne von Elk, verknüpft mit der konstanten Region von IgG1, besteht, durchgeführt werden. Dieser Rezeptorkörper wird wie folgt hergestellt: Der Fc-Teil von menschlichem IgG1, beginnend von der Gelenkregion und sich bis zum Carboxy-Terminus des Moleküls erstreckend, wurde aus Plazenta-cDNA unter Verwendung von PCR mit Oligonucleotiden, welche der veröffentlichten Sequenz von menschlichem IgG1 entsprechen, cloniert. Günstige Restriktionsstellen wurden ebenfalls in die Oligonucleotide eingeschlossen, um so die Clonierung des PCR-Fragmentes in einen Expressionsvektor zu erlauben. Die Rezeptoren voller Länge enthaltenden Expressionsvektoren wurden entweder durch Restriktionsenzymspaltungen oder durch PCR-Strategien verändert, um so die Transmembran- und intrazellulären Domänen durch Restriktionsschnittstellen zu ersetzen, die eine Clonierung des menschlichen IgG1-Fragmentes in diese Stellen erlauben; dies wurde so durchgeführt, um ein Fusionsprotein mit der Rezeptorektodomäne als seinem Amino-Terminus und dem Fc-Teil des menschlichen IgG1 als seinem Carboxy-Terminus zu erzeugen. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Rezeptorkörpern wird in Goodwin et al., Cell 73 (1993), 447–456, beschrieben.
HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Der folgende Vektor wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag hinterlegt.

HINTERLEGUNG ZUGANGSNUMMER

pBluescript SK^–Efl-6 97319
Die vorliegende Erfindung ist im Umfang nicht durch die bestimmten, hier beschriebenen Ausführungsformen zu begrenzen. Tatsächlich werden verschiedene Veränderungen der Erfindung, zusätzlich zu denen, die hier beschrieben sind, aus der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Figuren für den Fachmann offensichtlich werden. Von solchen Veränderungen ist beabsichtigt, dass sie in den Umfang der anhängenden Ansprüche fallen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes und gereinigtes Nucleinsäuremolekül, das ein Efl-6 [Eph transmembrane tyrosine kinase family ligands-6]-Protein codiert, wobei die Sequenz der Nucleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: (a) der Sequenz der DNA, die reifes Efl-6-Protein codiert, enthalten in dem Plasmid pBluescriptSK^–Efl-6, das am 19. Oktober 1995 bei der American Type Culture Collection hinterlegt wurde und die Bezeichnung 97319 hat; (b) der Sequenz der DNA, die reifes Efl-6-Protein mit der Aminosäuresequenz wie in 1 dargestellt codiert; und (c) DNA-Sequenzen, die als Folge des genetischen Codes zu einer DNA-Sequenz von (a) oder (b) degeneriert sind und welche ein Efl-6-Protein codieren, das an die Elk-Unterfamilie von Eph-Rezeptoren: Elk, Nuk/Cek 5, Hek 2/Sek 4, Htk und Sek 1 bindet.
Isoliertes und gereinigtes Efl-6-Protein, das von einer Nucleinsäure gemäß Anspruch 1 codiert wird.
Isoliertes und gereinigtes reifes Efl-6-Protein mit einer Aminosäuresequenz wie in 1 dargestellt oder ein Fragment davon, das zum Binden an den Elk-Rezeptor fähig ist.
Isolierte Nucleinsäure, codierend die extrazelluläre Domäne von Efl-6 (sEfl-6) mit einer Sequenz ausgewählt aus den Folgenden: (a) der Sequenz, dargestellt von etwa Nucleotid 274 bis etwa Nucleotid 873 der 1; und (b) einer Sequenz, die die extrazelluläre Domäne von Efl-6 wie dargestellt in 1 codiert.
Gereinigtes sEfl-6, codiert von der Nucleotidsequenz gemäß Anspruch 4.
(sEfl-6)n, umfassend das sEfl-6-Protein gemäß Anspruch 5, wobei n 2 oder mehr ist.
Efl-6-Ligand-Körper, umfassend lösliches Efl-6-Protein gemäß Anspruch 5 und den Fc-Teil von IgG.
Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 8, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die zum Regeln seiner Expression in einer Wirtszelle fähig ist.
Wirtszelle, enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 9.
Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül gemäß Anspruch 4 umfasst.
Vektor gemäß Anspruch 11, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die zum Regeln seiner Expression in einer Wirtszelle fähig ist.
Wirtszelle, enthaltend einen Vektor gemäß Anspruch 12.
Verfahren zum Herstellen eines Efl-6-Liganden, umfassend das Züchten von Zellen eines Wirts gemäß Anspruch 9 unter Bedingungen, die die Herstellung des Liganden erlauben, und das Gewinnen des so hergestellten Liganden.
Verfahren zum Herstellen eines Efl-6-Liganden, umfassend das Züchten von Zellen eines Wirts gemäß Anspruch 12 unter Bedingungen, die die Herstellung des Liganden erlauben, und das Gewinnen des so hergestellten Liganden.
Antikörper, der spezifisch den Ligand gemäß Anspruch 2, 3 oder 5 bindet.
Antikörper gemäß Anspruch 16, der ein monoc lonaler Antikörper ist.
Arzneimittel, umfassend ein Efl-6-Protein oder ein Fragment davon, welches an den Elk-Rezeptor, wie definiert in Anspruch 2, 3 oder 5, bindet, und einen pharmakologisch verträglichen Träger.