DE69838334T2

DE69838334T2 - Kdr, ein menschlicher tyrosin kinase rezeptor

Info

Publication number: DE69838334T2
Application number: DE69838334T
Authority: DE
Inventors: Richard L. Rahway KENDALL; Kenneth A. Rahway THOMAS; Xianzhi Rahway MAO; Andrew Rahway TEBBEN
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1997-06-18
Filing date: 1998-06-17
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2018-06-18
Also published as: US6204011B1; DE69838334D1; US6841367B2; ATE371727T1; CA2293723A1; US20030032160A1; EP1009814A1; JP4405597B2; EP1009814B1; US6841382B2; WO1998058053A1; JP2002507119A; WO1998058053A9; US6359115B1; ES2292204T3; EP1009814A4; US20030055239A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül (Polynukleotid), welches für eine humane Rezeptor-Tyrosinkinase, KDR, codiert, die auf humanen Endothelzellen exprimiert wird. Dieser Rezeptor wird durch VEGF aktiviert und vermittelt ein mitogenes Signal. Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren und rekombinante Wirte, die ein DNA-Fragment, codierend für Human-KDR, ein DNA-Fragment, codierend für den intrazellulären Abschnitt von KDR, ein DNA-Fragment, codierend für den extrazellulären Abschnitt von KDR mit einer oder ohne eine Membranankersequenz, enthalten, im Wesentlichen gereinigte Formen von assoziierter Human-KDR und humane Mutantenformen von KDR.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gefäßendothelzellen bilden eine luminale, nicht-thrombogene Monoschicht überall im Gefäßsystem. Mitogene fördern embryonale Gefäßentwicklung, Wachstum, Wiederherstellung und Angiogenese in diesen Zellen. Angiogenese beinhaltet den proteolytischen Abbau der Basalmembran, auf der sich die Endothelzellen befinden, gefolgt von der anschließenden chemotaktischen Migration und Mitose dieser Zellen, um ein anhaltendes Wachstum eines neuen Kapillarsprosses zu unterstützen. Eine Klasse von Mitogenen, welche für Gefäßendothelzellen selektiv sind, umfassen Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (bezeichnet als VEGF oder VEGF-A) und die Homologen Plazenta-Wachstumsfaktor (PIGF), VEGF-B und VEGF-C.
Human-VEGF liegt als glycosyliertes Homodimer in einer von vier reifen prozessierten Formen vor, die 206, 189 (siehe US-Patent Nr. 5,240,848 ), 165 (siehe US-Patent Nr. 5,332,671 ) und 121 ( US-Patent Nr. 5,332,671 ) Aminosäuren enthalten, wobei die häufigste die 165-Aminosäuren-Form ist. Die 206-Aminosäuren- und 189-Aminosäuren-Formen von Human-VEGF enthalten jeweils ein hochbasisches 24-Aminosäuren-Insert, das eine feste Bindung an Heparin und mutmaßlich Heparin-Proteoglycane auf zellulären Oberflächen und innerhalb extrazellulärer Matrices fördert (Ferrara et al., 1991, J. Cell. Biochem. 47: 211–218).
Human-PIGF ist ebenfalls ein glycosyliertes Homodimer, welches 46 % Homologie mit VEGF auf der Proteinebene gemeinsam hat. Ein unterschiedliches Spleissen von Human-PIGF-mRNA führt zu Vorläufer von entweder 170 oder 149 Aminosäuren, welche proteolytisch zu reifen Formen von 152 bzw. 131 Aminosäureresten Länge prozessiert werden (Maglione et al., 1993, Oncogene 8: 925–931; Bayne und Thomas, 1992, EP-Veröffentlichung Nr. 0 506 477 A1 ; Hauser und Weich, 1993, Growth Factors 9: 259–268).
VEGF-B wurde isoliert und charakterisiert (Grimmond et al., 1996, Genome Research 6: 124–131; Olofsson et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2576–2581). Die Volllängen-Human-cDNAs codieren für Vorläufer von 188 und 207 Aminosäureresten, während die NH₂-terminalen Abschnitte proteolytisch zu den reifen Formen von 167 und 186 Aminosäuren Länge prozessiert werden. Human-VEGF-B-Expression wurde überwiegend im Herzen und Skelettmuskel als disulfid-verknüpftes Homodimer gefunden. Jedoch kann Human-VEGF-B auch ein Heterodimer mit VEGF bilden (ebendort bei 2580).
VEGF-C wurde ebenfalls isoliert und charakterisiert (Joukov et al., 1996, EMBO J. 15: 290–298). Eine cDNA, codierend für VEGF-C, wurde aus einer Human-Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie erhalten. Ein 32-kD-Vorläuferprotein wird proteolytisch prozessiert, um die reife 23-kD-Form zu bilden, welche die Rezeptor-Tyrosinkinase Flt-4 bindet.
VEGF und dessen Homologe entfalten Aktivität durch Bindung an Gefäßendothelzell-Plasmamembran überspannende Tyrosinkinase-Rezeptoren, welche dann ein intrazelluläres mitogenes Signal aktivieren. Die KDR-Rezeptorfamilie ist der Haupt-Tyrosinkinase-Rezeptor, welcher das von VEGF initiierte mitogene Signal übermittelt.
Shibuya et al. (1990, Oncogene 5: 519–524) offenbaren ein Human-Rezeptortyp-Tyrosinkinasegen fit, welches einen offenen Leserahmen von 4,2 kb umfasst, codierend für ein 1338-Aminosäuren-Protein, welches eine glycosylierte extrazelluläre Domäne, eine membran-überspannende Region und eine vorausgesagte Tyrosinkinase-Domäne umfasst.
Pajusola et al. (1992, Cancer Res. 52: 5738–5743) offenbaren ein Human-Rezeptortyp-Tyrosinkinasegen, welches, wie oben festgestellt, Human-VEGF-C bindet.
Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) bindet die hoch affinen membran-überspannenden Tyrosinkinase-Rezeptoren KDR und Flt-1. Zellkultur- und Gen-Knockout-Experimente weisen darauf hin, dass jeder Rezeptor zu unterschiedlichen Aspekten der Angiogenese beiträgt. KDR vermittelt die mitogene Funktion von VEGF, während Flt-1 nicht-mitogene Funktionen, wie z.B. die mit zellulärer Adhäsion assoziierten, zu modulieren scheint. Die Inhibierung von KDR verringert somit signifikant das Niveau mitogener VEGF-Aktivität.
Gefäßwachstum in der Retina führt zu einer visuellen Degeneration, die in Blindheit kulminiert. VEGF ist verantwortlich für den größten Teil der angiogenen Aktivität, die in oder nahe der Retina bei der diabetischen Retinopathie entfaltet wird. Okulare VEGF-mRNA und -Protein werden durch Bedingungen wie Retinalvenenverschluss bei Primaten und verringerte pO₂-Niveaus in Mäusen erhöht, was zur Gefäßneubildung führt. Intraokulare Injektionen von entweder monoklonalen Anti-VEGF-Antikörpern oder VEGF-Rezeptor-Immunfusionen inhibieren die Okulare Gefäßneubildung bei Nager- und Primatenmodellen. Unabhängig von dem Grund der Induktion von VEGF bei humaner diabetischer Retinopathie ist die Inhibierung von okularem VEGF bei der Behandlung der Krankheit von Nutzen.
Die Expression von VEGF ist auch in hypoxischen Regionen von tierischen und humanen Tumoren neben Nekrosegebieten signifikant erhöht. Monoklonale und polyklonale Anti-VEGF-Antikörper inhibieren das Wachstum humaner Tumoren bei nackten Mäusen. Obwohl dieselben Tumorzellen fortfahren, VEGF in Kultur zu exprimieren, verringen die Antikörper die mitotische Rate der meisten, wenn nicht aller Tumorzellen, die von anderen Zellen als den Gefäßendothelzellen selbst stammen, nicht. Somit fungiert tumor-abgeleiteter VEGF nicht als autokriner mitogener Faktor für die meisten Tumore. Deshalb trägt VEGF zum Tumorwachstum in vivo bei durch Förderung der Angiogenese durch seine parakrinen Gefäßendothelzellaktivitäten chemotaktischer und mitogener Natur. Diese monoklonalen Antikörper inhibieren auch das Wachstum von typischerweise weniger gut vaskularisierten Human-Dickdarmtumoren bei Mäusen ohne Thymus und verringern die Anzahl der Tumore, die aus überimpften Zellen entsteht. Die virale Expression eines VEGF-bindenden Konstrukts von Flk-1, dem Maus-KDR-Rezeptor-Homologen, verkürzt, um die zytoplasmatischen Tyrosinkinase-Domänen zu eliminieren, jedoch einen Membrananker zu behalten, eliminiert praktisch das Wachstum eines transplantierbaren Glioblastoms in Mäusen, mutmaßlich durch den dominanten negativen Mechanismus von Heterodimerbildung mit membran-überspannenden Endothelzell-VEGF-Rezeptoren. Embryonale Stammzellen, welche normalerweise als feste Tumore in nackten Mäusen wachsen, produzieren keine nachweisbaren Tumore, falls beide VEGF-Allele ausgeschaltet werden. Zusammengenommen deuten diese Daten auf eine Rolle von VEGF beim Wachstum fester Tumore hin. KDR und Flt-1 werden in Zusammenhang mit der pathologischen Neoangiogenese gebracht und Inhibitoren dieser Rezeptoren sind von Nutzen bei der Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine Neoangiogenese Teil der Gesamtpathologie ist, z.B. diabetische retinale Vaskularisation, verschiedene Formen von Krebs sowie Entzündungsformen, wie z.B. rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Kontaktdermatitis und Überempfindlichkeitsreaktion.
Terman et al. (1991, Oncogene 6: 1677–1683; 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579–1586) offenbaren eine Volllängen-cDNA, die für eine Form von KDR codiert. Jedoch wird bei der Offenbarung von Terman et al. kein neues optimales Nukleinsäurefragment identifiziert, welches für die humane Form des Rezeptortyp-Tyrosinkinasegens, KDR, codiert. Es wird vorteilhaft sein, eine humane cDNA-Sequenz, die für eine optimierte Form von humaner KDR codiert, zu identifizieren und isolieren. Ein Nukleinsäuremolekül, welches das humane KDR-Protein exprimiert, wird beim Screenen hinsichtlich Verbindungen, die als Modulator der Proteinkinase-Domäne dieses Proteins fungieren, von Nutzen sein. Eine solche Verbindung oder solche Verbindungen wird/werden von Nutzen sein bei der Modulation des mitogenen Signals von VEGF und VEGF-verwandten Proteinen auf Gefäßendothelzellen. Die KDR-Nukleinsäuresequenz kann auch für die Gentherapie von Nutzen sein, da sie für einen Teil des KDR-Proteins codiert, der funktionelle ligandenbindende und membranverankernde Gruppierungen enthalten würde, jedoch keine Tyrosinkinase-Aktivität. Entweder die Gesamtheit oder ein Teil des KDR-Proteins ist auch zum Screenen hinsichtlich VEGF-Antagonisten von Nutzen. Die KDR-Nukleinsäuresequenz kann in Zellen für die Analyse der Funktion in Abwesenheit von Flt-1 transfiziert werden. Das KDR-Protein ist auch von Nutzen für eine Röntgenstrukturanalyse in Anwesenheit oder Abwesenheit von Liganden und/oder Inhibitoren. Die vorliegende Erfindung betrifft und erfüllt diese Bedürfnisse durch Offenbarung eines isolierten Nukleinsäurefragments, welches eine Form von Human-KDR exprimiert, von der durch Computermodelle gezeigt wird, dass sie eine höhere Aktivität und Funktionalität als die früher offenbarte KDR besitzen wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül (Polynukleotid), welches für ein neues Human-Rezeptortyp-Tyrosinkinasegen, KDR, wie in Anspruch 1 angegeben, codiert. Diese Patentbeschreibung offenbart ein neues optimiertes DNA-Molekül mit der in SEQ-ID-Nr. 1 angegebenen Sequenz, welches für KDR codiert, eine Rezeptor-Tyrosinkinase, die auf humanen Endothelzellen exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch biologisch aktive Fragmente oder Mutanten von SEQ-ID-Nr. 1, codierend für mRNA, die ein neues Human-Rezeptortyp-Tyrosinkinasegen, KDR, exprimiert. Jedes solches biologisch aktive Fragment und/oder jede solche Mutante wird entweder für ein Protein oder ein Proteinfragment codieren, das mindestens eine intrazelluläre Kinasedomäne des Human-KDR-Proteins, wie in SEQ-ID-Nr. 2 angegeben, umfasst. Ein solches Polynukleotid umfasst, ist jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Nukleotid-Substitutionen, -Deletionen, -Additionen, aminoterminale Verkürzungen und carboxyterminale Verkürzungen, so dass diese Mutationen für mRNA codieren, welche das genannte Protein oder Proteinfragment von diagnostischem, therapeutischem oder prophylaktischem Nutzen exprimieren und zum Screenen hinsichtlich Agonisten und/oder Antagonisten für die KDR-Funktion von Nutzen sind.
Das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann ein Desoxyribonukleinsäuremolekül (DNA) einschließen, wie z.B. genomische DNA und komplementäre DNA (cDNA), welche einzelsträngig (codierender oder nicht-codierender Strang) oder doppelsträngig sein kann, sowie synthetische DNA, z.B. ein synthetisiertes einzelsträngiges Polynukleotid. Das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann auch ein Ribonukleinsäuremolekül (RNA) einschließen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren und rekombinante Wirte, sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch, welche die im Wesentlichen gereinigten Nukleinsäuremoleküle enthalten, die in dieser gesamten Patentbeschreibung offenbart werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch subzelluläre Membranfraktionen der rekombinanten Wirtszellen (sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen ebenso wie stabil oder transient transformierte Zellen), umfassend die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung. Diese subzellulären Membranfraktionen werden entweder Wildtyp- oder Human-Mutantenformen von KDR auf Niveaus umfassen, die wesentlich oberhalb der Wildtypniveaus liegen, und werden somit in verschiedenen Assays, die in dieser gesamten Patentbeschreibung beschrieben werden, von Nutzen sein.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung wird in 1A und 1B und SEQ-ID-Nr. 1 offenbart, eine humane cDNA, die für ein neues Rezeptortyp-Tyrosinkinasegen, KDR, codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine im Wesentlichen gereinigte Form des Rezeptortyp-Tyrosinkinasegens, KDR, welches in 2 offenbart und in SEQ-ID-Nr. 2 angegeben ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch definierte biologisch aktive Fragmente des KDR-Proteins, wie ursprünglich in SEQ-ID-Nr. 2 angegeben, derart, dass diese Mutationen einen diagnostischen, therapeutischen oder prophylaktischen Nutzen bieten und zum Screenen hinsichtlich Agonisten und/oder Antagonisten für die KDR-Funktion geeignet sind.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung wird in 2 offenbart und in SEQ-ID-Nr. 2 angegeben, die Aminosäuresequenz des neuen Rezeptortyp-Tyrosinkinasegens, KDR.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche Fusionskonstrukte sind, die Fusionsproteine exprimieren, welche in Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche Wildtyp-Human-KDR-Aktivität modulieren, von Nutzen sind. Ein bevorzugter Aspekt dieses Teils der Erfindung umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, Glutathion-S-Transferase (GST)-KDR-Fusionskonstrukte. Diese Fusionskonstrukte umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die intrazelluläre Tyrosinkinase-Domäne von Human-KDR als Fusion im Leserahmen am Carboxyterminus des GST-Gens nach Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Lösliche rekombinante GST-Kinasedomäne-Fusionsproteine können in verschiedenen Expressionssystemen exprimiert werden, einschließlich Spodoptera frugiperda (Sf21)-Insektenzellen (Invitrogen) unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors (pAcG2T, Pharmingen).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für Human-KDR-Proteinfragmente codieren, die einen Teil der intrazellulären KDR-Domäne umfassen. Die Proteinfragmente sind von Nutzen in Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche Wildtyp-Human-KDR-Aktivität modulieren. In diesem Aspekt stellt die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt bereit, welches für den intrazellulären Teil von Human-KDR codiert, von Aminosäure 790 bis Aminosäure 1356.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Expression des Rezeptortyp-Tyrosinkinasegens, KDR, und der hier offenbarten biologischen Äquivalente, Assays unter Verwendung dieser Rezeptortyp-Tyrosinkinasegene, Zellen, welche diese Rezeptortyp-Tyrosinkinasegene exprimieren, und Verbindungen, welche durch den Einsatz von diesen Rezeptortyp-Tyrosinkinasegenen und exprimiertem Human-KDR-Protein identifiziert wurden, einschließlich eines oder mehrerer Modulatoren der Human-KDR-abhängigen Kinase, entweder durch direkten Kontakt mit der Kinasedomäne von Human-KDR oder einer Verbindung, welche die Bindung von VEGF an Human-KDR oder eine angemessene Dimerisierung des KDR-Rezeptors verhindert, was der Transduktion der normalen intrazellulären Signale, die mit VEGF-induzierter Angiogenese assoziiert sind, entgegenwirkt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist auch die Bereitstellung von KDR-basierten Fusionskonstrukten im Leserahmen, Verfahren zur Expression des Rezeptortyp-Tyrosinkinasegens, KDR, und der hier offenbarten biologischen Äquivalente, diesbezügliche Assays, rekombinante Zellen, welche diese Rezeptortyp-Tyrosinkinasegene exprimieren, und agonistische und/oder antagonistische Verbindungen, welche durch den Einsatz von diesen Rezeptortyp-Tyrosinkinasegenen und exprimiertem Human-KDR-Protein identifiziert wurden.
Wie hier verwendet, bezieht sich "VEGF" oder "VEGF-A" auf Gefäßendothel-Wachstumsfaktor.
Wie hier verwendet, bezieht sich "KDR" oder "FLK-1" auf einen eine Kinase-Insert-Domäne enthaltenden Rezeptor.
Wie hier verwendet, bezieht sich "FLT-1" auf einen fms-ähnlichen Tyrosinkinase-Rezeptor.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Säugerwirt" auf jeden Säuger, einschließlich eines Menschen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B zeigen die Nukleotidsequenz, welche für Human-KDR codiert, wie in SEQ-ID-Nr. 1 angegeben.
2 zeigt die Aminosäuresequenz von Human-KDR, wie ebenfalls in SEQ-ID-Nr. 2 angegeben. Unterstrichene Aminosäurereste repräsentieren Unterschiede im Vergleich zu einer früher offenbarten Form von Human-KDR.
3A zeigt die ATP-Bindungsdomäne von dem KDR-V848E-Mutanten-Homologiemodell mit gebundenem AMP-POP. Die Seitenkette von E848 befindet sich in Kontakt mit dem Adenin von AMP-PCP. Das Gamma-Phosphat von AMP-PCP ist nicht sichtbar. Die Protein-Alphakohlenstoff-Spur ist in Schläuchen gezeigt, das AMP-PCP als Zweige und die E848-Seitenkette raumfüllend. Der N-terminale Lappen ist blau gefärbt (oder alternativ mit hellen (unausgefüllten) Kreisen markiert) mit Ausnahme des glycin-reichen Lappens, der grün gefärbt (oder alternativ als gestrichelte Region markiert) ist. Der C-terminale Lappen ist rot gefärbt (oder alternativ mit dunklen (ausgefüllten) Kreisen markiert).
3B zeigt die ATP-Bindungsdomäne von dem KDR-Homologie-Modell mit gebundenem AMP-PCP. Die Seitenkette von V848 bildet hydrophobe Kontakte mit dem Adenin von AMP-PCP. Das Gamma-Phosphat von AMP-PCP ist nicht sichtbar. Die Protein-Alphakohlenstoff-Spur ist in Schläuchen gezeigt, das AMP-PCP als Zweige und die V848-Seitenkette raumfüllend. Der N-terminale Lappen ist blau gefärbt (oder alternativ mit hellen (leeren) Kreisen markiert), mit Ausnahme des glycin-reichen Lappens, der grün gefärbt ist (oder alternativ als gestrichelte Region markiert). Der C-terminale Lappen ist rot gefärbt (oder alternativ mit dunklen (ausgefüllten) Kreisen markiert).
4A und 4B zeigen, dass das gereinigte GST-KDR_cytE848 nicht in der Lage war, in Gegenwart von 1 mM ATP zu autophosphorylieren, wohingegen 12 ng GST-KDR_cytV848 in Gegenwart von 1 mM ATP zu Autophosphorylierung führten (4A) und dass sowohl 120 ng GST-KDR_cytE848 als auch 12 ng GST-KDR_cytV848 mit Anti-KDR-Antikörper reagieren (4B).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäure- und Protein-Formen, welche Human-KDR repräsentieren. Diese Patentbeschreibung offenbart ein DNA-Molekül, das Human-KDR codiert, eine Rezeptor-Tyrosinkinase, die auf humanen Endothelzellen exprimiert wird. Der Rezeptor wird durch Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF) aktiviert und vermittelt ein mitogenes Signal. Diese Aktivierung und anschließende Mitogenese führt zu einer angiogenen Reaktion in vivo. Das in der Patentbeschreibung als SEQ-ID-Nr. 1 offenbarte Nukleinsäuremolekül codiert für ein Human-KDR-Protein (SEQ-ID-Nr. 2), welches zu 6 Aminosäureunterschieden von der veröffentlichten Sequenz (Terman et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579–1586; Terman et al., Internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 92/14748 , Internationale Anmeldung Nr. PCT/US92/01300 ) führt. Diese Änderungen sind Position 498 (Ala zu Glu), 772 (Thr zu Ala), 787 (Gly zu Arg), 835 (Asn zu Lys), 848 (Glu zu Val) und 1347 (Thr zu Ser). Diese 6 Aminosäureunterschiede beeinflussen die Aktivität des Rezeptors. Val 848 ist bei den meisten Mitglieder der Tyrosinkinase-Familie durchgehend konserviert und scheint von Bedeutung zu sein für die Bindung von ATP und mutmaßlichen ATP-kompetitiven Inhibitoren der KDR-Rezeptor-Kinase, wie durch Computermodelle abgeleitet. Eine Veränderung zu Glu an dieser Position führt zu einer nicht-funktionellen Kinase als Folge beeinträchtigter ATP-Bindung. Die anderen Veränderungen können ebenfalls Aktivitätsunterschiede verursachen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch entweder biologisch aktive Fragmente oder Mutanten von SEQ-ID-Nr. 1, codierend für mRNA, die ein neues Human-Rezeptortyp-Tyrosinkinasegen, KDR, exprimiert. Jedes solches biologisch aktives Fragment wird für ein Protein oder Proteinfragment codieren, das mindestens eine intrazelluläre Kinasedomäne des Human-KDR-Proteins, wie in SEQ-ID-Nr. 2 angegeben, umfasst und Val an Position 848 behalten. Es wird auch in Betracht gezogen, dass andere intrazellulär-basierte KDR-Domänen zu einem löslichen Proteinfragment führen werden, welches die Struktur und Funktion der intrazellulären Wildtyp-Domäne nachbildet. Jedes solche Proteinfragment kann ein Fusionsprotein sein, wie z.B. die beispielhaft erläuterte GST-KDR-Fusion, oder kann ausschließlich aus der intrazellulären KDR-Domäne bestehen, mit zunehmenden Deletionen vom COOH-terminalen Bereich. Es ist besonders bevorzugt, dass die folgenden Aminosäuren beibehalten werden, warm diese Domäne das jeweilige Protein oder Proteinfragment umfasst: Val an Position 848, Glu an Position 498, Ala an Position 772, Arg an Position 787, Lys an Position 835 und Ser an Position 1347. Deshalb umfasst ein solches Polynukleotid, ist jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Nukleotid-Substitutionen, -Deletionen, -Additionen, aminoterminale Verkürzungen und carboxyterminale Verkürzungen, derart, dass diese Mutationen für mRNA codieren, die ein Protein oder Proteinfragment von diagnostischem, therapeutischem oder prophylaktischem Nutzen exprimiert und zur Identifizierung von Modulatoren von KDR-Rezeptor-Aktivität von Nutzen ist.
Das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann ein Desoxyribonukleinsäuremolekül (DNA) einschließen, wie z.B. genomische DNA und komplementäre DNA (cDNA), welche einzelsträngig (codierender oder nicht-codierender Strang) oder doppelsträngig sein kann, sowie synthetische DNA, wie z.B. ein synthetisiertes, einzelsträngiges Polynukleotid. Das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann auch ein Ribonukleinsäuremolekül (RNA) einschließen.
Es ist bekannt, dass DNA-Sequenzen, die für ein Peptid codieren, verändert werden können, um so für ein Peptid mit Eigenschaften zu codieren, die sich von denjenigen des natürlich vorkommenden Peptids unterscheiden. Verfahren zur Änderung der DNA-Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, stellengerichtete Mutagenese. Beispiele veränderter Eigenschaften umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Veränderungen in der Affinität eines Enzyms für ein Substrat oder eines Rezeptors für einen Liganden.
Wie hier verwendet, werden "gereinigt" und "isoliert" austauschbar verwendet, um zu bedeuten, dass die betreffende Nukleinsäure, das betreffende Protein oder jeweilige Fragment davon, im Wesentlichen aus ihrer/seiner in vivo-Umgebung entfernt wurde, so dass sie/es vom geschulten Fachmann manipuliert werden kann, wie z.B., jedoch nicht beschränkt auf, Nukleotidsequenzierung, Restriktionsverdau, stellengerichtete Mutagenese und Subklonierung in Expressionsvektoren für ein Nukleinsäurefragment sowie zum Erhalt des Proteins oder Proteinfragments in reinen Mengen, um die Möglichkeit zu bieten, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper zu erzeugen, Aminosäuresequenzierung und Peptidverdauung. Deshalb können die hier beanspruchten Nukleinsäuren in ganzen Zellen oder in Zelllysaten oder in partiell gereinigter oder im Wesentlichen gereinigter Form vorliegen. Eine Nukleinsäure wird als im Wesentlichen gereinigt betrachtet, wenn sie von Umgebungsverunreinigungen gereinigt ist. Somit wird eine aus Zellen isolierte Nukleinsäuresequenz als im Wesentlichen gereinigt betrachtet, wenn sie nach Standardverfahren von zellulären Komponenten gereinigt wurde, während eine chemisch synthetisierte Nukleinsäuresequenz als im Wesentlichen gereinigt betrachtet wird, wenn sie von ihren chemischen Vorläufern gereinigt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren und rekombinante Wirte, sowohl prokaryotische als auch eukaryotische, welche die im Wesentlichen gereinigten Nukleinsäuremoleküle enthalten, die in dieser gesamten Beschreibung offenbart werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch subzelluläre Membranfraktionen der rekombinanten Wirtszellen (sowohl prokaryotische als auch eukaryotische sowie sowohl stabil wie auch transient transformierte Zellen), umfassend die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung. Diese subzellulären Membranfraktionen werden Wildtyp- oder humane Mutantenformen von KDR auf Niveaus umfassen, die wesentlich oberhalb von Wildtypniveaus liegen, und werden somit in verschiedenen Assays, die in dieser gesamten Beschreibung beschrieben werden, von Nutzen sein.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung wird in 1A und 1B und SEQ-ID-Nr. 1 offenbart, eine humane cDNA, die für ein neues Rezeptortyp-Tyrosinkinasegen, KDR, codiert, offenbart wie folgt:
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine im Wesentlichen gereinigte Form des Rezeptortyp-Tyrosinkinasegens, welches die KDR-Aminosäuresequenz umfasst, die in 2 offenbart und in SEQ-ID-Nr. 2 angegeben ist, welche Glu an Position 498, Ala an Position 772, Arg an Position 787, Lys an Position 835, Val an Position 848 und Ser an Position 1347 einschließt, offenbart wie folgt:
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für lösliche Teile der intrazellulären KDR-Domäne codieren. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuremoleküle, welche für ein KDR-Proteinfragment mit einer COOH-terminalen Deletion codieren, von Nutzen in Assays, um Verbindungen zu identifizieren, welche Wildtyp-Human-KDR-Aktivität modulieren. Jede solche Nukleinsäure wird für ein KDR-Proteinfragment codieren, welches die KDR-Wildtyp-Aktivität innerhalb der jeweiligen Domäne nachbildet, wie z.B. die Kinasedomäne von Human-KDR. Diese exprimierten löslichen Proteinfragmente können einen Teil der aminoterminalen Region von Human-KDR oder von einer heterologen Sequenz enthalten oder auch nicht. Diese Nukleinsäuren können in irgendeinem von einer Reihe von Expressionssystemen, die dem Fachmann zur Verfügung stehen, exprimiert werden. Jedes solches intrazellulär-basierte KDR-Konstrukt der vorliegenden Erfindung kann in Gentherapie-Anwendungen eingesetzt werden, wie z.B. als löslicher Agonist oder Antagonist von Kinaseaktivität wirkend, die normalerweise mit membran-assoziierter Wildtyp-Kinaseaktivität assoziiert ist.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, die für Human-KDR-Proteinfragmente codieren, welche einen Teil der intrazellulären KDR-Domäne umfassen. Die Proteinfragmente sind von Nutzen in Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche Wildtyp-Human-KDR-Aktivität modulieren. Dieser Aspekt der Erfindung stellt ein Nukleinsäurekonstrukt bereit, welches für den intrazellulären Teil von Human-KDR, von Aminosäure 790 bis Aminosäure 1356, codiert. Die im Beispielsabschnitt 3 beispielhaft angegebenen Daten zeigen, dass COOH-terminale Deletionen des löslichen intrazellulären Teils von KDR Kinaseaktivität aufweisen.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Expression des Rezeptortyp-Tyrosinkinasegens, KDR, und der hier offenbarten biologischen Äquivalente, Assays unter Verwendung dieser Rezeptortyp-Tyrosinkinasegene, Zellen, welche diese Rezeptortyp-Tyrosinkinasegene exprimieren, und agonistische und/oder antagonistische Verbindungen, welche durch den Einsatz von diesen Rezeptortyp-Tyrosinkinasegenen und exprimiertem Human-KDR-Protein identifiziert wurden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, einen oder mehrere Modulator(en) der Human-KDR-abhängigen Kinase, entweder durch direkten Kontakt mit der Kinasedomäne von Human-KDR oder einer Verbindung, welche die Bindung von VEGF an Human-KDR verhindert oder die Rezeptor-Dimerisation und/oder -Aktivierung entweder verhindert oder fördert, und dadurch die Transduktion der normalen intrazellulären Signale, die mit VEGF-induzierter Angiogenese assoziiert sind, entweder induziert oder antagonisiert.
Wie hier verwendet, besitzt ein "biologisch aktives Äquivalent" oder "funktionelles Derivat" einer Wildtyp-Human-KDR eine biologische Aktivität, die im Wesentlichen ähnlich der biologischen Aktivität der Wildtyp-Human-KDR ist. Der Begriff "funktionelles Derivat" soll die "Fragmente", "Mutanten", "Varianten", "Degenerationsvarianten", "Analoga" und "Homologe" oder "chemischen Derivate" des Wildtyp-Human-KDR-Proteins umfassen. Der Begriff "Fragment" soll sich auf jedes Polypeptid-Subset von Wildtyp-Human-KDR beziehen. Der Begriff "Mutante" soll sich auf ein Molekül beziehen, das im Wesentlichen der Wildtyp-Form ähnlich sein kann, jedoch unterscheidende biologische Charakteristiken aufweist. Solche geänderten Charakteristiken umfassen, sind jedoch keineswegs beschränkt auf, veränderte Substratbindung, veränderte Substrataffinität und veränderte Sensitivität gegenüber chemischen Verbindungen, welche die biologische Aktivität der Human-KDR oder des funktionellen Human-KDR-Derivats beeinflussen. Der Begriff "Variante" soll sich auf ein Molekül beziehen, das in Struktur und Funktion entweder dem gesamten Wildtyp-Protein oder einem Fragment davon im Wesentlichen ähnlich ist. Ein Molekül ist einem Wildtyp-Human-KDR-ähnlichen Protein "im Wesentlichen ähnlich", wenn beide Moleküle im Wesentlichen ähnliche Strukturen aufweisen oder wenn beide Moleküle ähnliche biologische Aktivität besitzen. Wenn somit die beiden Moleküle im Wesentlichen ähnliche Aktivität besitzen, werden sie als Varianten betrachtet, selbst wenn die Struktur eines der Moleküle nicht in dem anderen gefunden wird oder selbst wenn die beiden Aminosäuresequenzen nicht identisch sind. Der Begriff "analog" bezieht sich auf ein Molekül, das in der Funktion entweder dem Volllängen-Human-KDR-Protein oder einem biologisch aktiven Fragment davon im Wesentlichen ähnlich ist.
Jedes aus einer Vielfalt von Verfahren kann zur Klonierung von Human-KDR eingesetzt werden. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, (1) eine RACE-PCR-Klonierungstechnik (Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998–9002). Eine 5'- und/oder 3'-RACE kann durchgeführt werden, um eine Volllängen-cDNA-Sequenz zu generieren. Diese Strategie beinhaltet die Verwendung von genspezifischen Oligonukleotid-Primern für eine PCR-Amplifizierung von Human-KDR-cDNA. Diese genspezifischen Primer werden konstruiert durch Identifizierung einer EST ("expressed sequence tag")-Nukleotidsequenz, welche mittels Durchsuchung einer beliebigen Zahl öffentlich zur Verfügung stehender Nukleinsäure- und Protein-Datenbanken identifiziert wurde; (2) direkte funktionelle Expression der Human-KDR-cDNA nach der Erstellung einer Human-KDR enthaltenden cDNA-Bank in einem geeigneten Expressionsvektorsystem; (3) Screenen einer Human-KDR enthaltenden cDNA-Bank, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer markierten degenerierten Oligonukleotidsonde, konstruiert anhand der Aminosäuresequenz des Human-KDR-Proteins; und (4) Screenen einer Human-KDR enthaltenden cDNA-Bank, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer partiellen cDNA, welche für das Human-KDR-Protein codiert. Diese partielle cDNA wird erhalten durch die spezifische PCR-Amplifizierung von Human-KDR-DNA-Fragmenten über die Konstruktion degenerierter Oligonukleotid-Primer anhand der bekannten Aminosäuresequenz für andere Kinasen, die mit dem Human-KDR-Protein verwandt sind; (5) Screenen einer Human-KDR enthaltenden cDNA-Bank, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor erstellt wurde, mit einer partiellen cDNA, die für das Human-KDR-Protein codiert. Diese Strategie kann auch beinhalten die Verwendung genspezifischer Oligonukleotid-Primer für die PCR-Amplifizierung von Human-KDR-cDNA, identifiziert als ein EST wie oben beschrieben; oder (6) Konstruktion von genspezifischen 5'- und 3'-Oligonukleotiden unter Verwendung von SEQ-ID-Nr. 1 als Matrize, so dass entweder die Volllängen-cDNA durch bekannte RACE-Techniken erzeugt werden kann oder ein Teil der codierenden Region mit diesen selben bekannten RACE-Techniken generiert werden kann, um einen Teil der codierenden Region zu generieren und isolieren für die Verwendung als Sonde zum Screenen eines von zahlreichen Typen von cDNA-Banken und/oder genomischen Banken, um eine Volllängen-Version der Nukleotidsequenz, die für Human-KDR codiert, zu isolieren.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, dass andere Typen von Banken sowie Banken, die von anderen Zelltypen oder Speziestypen erstellt wurden, für die Isolierung einer Human-KDR-codierenden DNA oder eines Human-KDR-Homologen von Nutzen sein können. Andere Typen von Banken umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, cDNA-Banken, die von anderen Zellen oder Zelllinien als Humanzellen oder -gewebe abgeleitet sind, wie z.B. Mauszellen, Nagerzellen oder irgendein anderer derartiger Vertebratenwirt, der Human-KDR-codierende DNA enthalten kann. Zusätzlich können ein Human-KDR-Gen und Homologe isoliert werden durch oligonukleotid- oder polynukleotid-basiertes Hybridisierungsscreening einer genomischen Vertebraten-Bank, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, eine genomische Mausbank, eine genomische Nagerbank, sowie gleichzeitig genomische Human-DNA-Banken.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, dass geeignete cDNA-Banken von Zellen oder Zelllinien, die KDR-Aktivität aufweisen, hergestellt werden können. Die Selektion von Zellen oder Zelllinien zur Verwendung für die Herstellung einer cDNA-Bank zur Isolierung einer cDNA, die für Human-KDR codiert, kann erfolgen, indem zuerst die zellassoziierte KDR-Aktivität unter Verwendung irgendeines bekannten Assays, der für einen solchen Zweck zur Verfügung steht, gemessen wird.
Die Herstellung von cDNA-Banken kann nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren erfolgen. Wohlbekannte Techniken zur Erstellung einer cDNA-Bank sind beispielsweise in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laborstory Manual; Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York, zu finden. cDNA-Banken können auch aus zahlreichen kommerziellen Quellen erhalten werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Clontech Laborstories, Inc., und Stratagene.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist auch unschwer ersichtlich, dass DNA, die für Human-KDR codiert, auch aus einer geeigneten genomischen DNA-Bank isoliert werden kann. Die Erstellung von genomischen DNA-Banken kann nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Wohlbekannte Techniken zur Erstellung einer genomischen DNA-Bank sind in Sambrook et al., oben, zur finden.
Zur Klonierung des Human-KDR-Gens mit einem der bevorzugten Verfahren kann die Aminosäuresequenz oder DNA-Sequenz von Human-KDR oder einem homologen Protein erforderlich sein. Um diese zu erhalten, kann das KDR-Protein oder ein homologes Protein gereinigt und die partielle Aminosäuresequenz mit automatischen Sequenatoren bestimmt werden. Es ist nicht erforderlich, die gesamte Aminosäuresequenz zu bestimmen, sondern es kann die lineare Sequenz von zwei Regionen von 6 bis 8 Aminosäuren für die PCR-Amplifizierung eines partiellen Human-KDR-DNA-Fragments bestimmt werden. Sobald geeignete Aminosäuresequenzen identifiziert wurden, werden die DNA-Sequenzen, welche in der Lage sind, dafür zu codieren, synthetisiert. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon dazu verwendet werden, um für eine bestimmte Aminosäure zu codieren und deshalb kann die Aminosäuresequenz von irgendeinem aus einem Satz ähnlicher DNA-Oligonukleotide codiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der Human-KDR-Sequenz identisch sein, jedoch werden andere in dem Satz in der Lage sein, mit Human-KDR-DNA zu hybridisieren, sogar in Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen. Die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide könnten immer noch ausreichend mit der Human-KDR-DNA hybridisieren, um eine Identifizierung und Isolierung von Human-KDR-codierender DNA zu ermöglichen. Alternativ kann die Nukleotidsequenz einer Region einer exprimierten Sequenz mittels Durchsuchung einer oder mehrerer zur Verfügung stehender genomischer Datenbanken identifiziert werden. Genspezifische Primer können zur Durchführung einer PCR-Amplifizierung einer cDNA von Interesse aus entweder einer cDNA-Bank oder einer Population von cDNAs verwendet werden. Wie oben angemerkt, kann die geeignete Nukleotidsequenz zur Verwendung in einem PCR-basierten Verfahren von SEQ-ID-Nr. 1 erhalten werden, entweder für den Zweck der Isolierung überlappender 5'- und 3'-RACE-Produkte für die Generierung einer Volllängen-Sequenz, die für Human-KDR codiert, oder zur Isolierung eines Abschnitts der Nukleotidsequenz, die für Human-KDR codiert, zur Verwendung als Sonde für das Screenen von einer oder mehreren auf cDNA oder genomischer DNA basierenden Bank(en) zur Isolierung einer Volllängen-Sequenz, die für Human-KDR oder Human-KDR-ähnliche Proteine codiert.
In einem beispielhaft erläuterten Verfahren wurde die Human-KDR-Volllängen-cDNA der vorliegenden Erfindung erzeugt durch Screenen einer Human-Umbilikalvenen-Endothelzell (HUVEC)-Lambdaphagen-cDNA-Bank mit einer KDR-spezifischen 576-Rasenpaar-DNA-Sonde, hergestellt unter Verwendung der Primer KDR-A: 5'-GGAATTCCATCCAAGCGGCAAATGTGTC-3' (SEQ-ID-Nr. 3) und KDR-B: 5'-GGAATTCCGAGTCTTCTACAAGGGTCTC-3' (SEQ-ID-Nr. 4). Lambdaphagenklone, die nur einmal vorkommende Inserts enthielten, wurden durch drei Runden von Replattierung isoliert und dann charakterisiert. Die 3' gelegenen 110 Basenpaare, die in keinem der isolierten Klone repräsentiert waren, wurden mittels PCR aus derselben Bank wie oben unter Verwendung der Primer KDR-C: 5'-TTATGACAACACAGCAGG-3' (SEQ-ID-Nr. 5) und KDR-D: 5'-TTGGATCCTCGAGTTGGGGTGTGGATGC-3' (SEQ-ID-Nr. 6) kloniert. Überlappende Klone wurden zur Generierung eines Volllängen-KDR-Gens in dem Plasmidvektor pGEM7Z verwendet. Das Gen enthielt eine Xhol-Stelle am 5'-Ende, welche zu einer BamHI-Stelle verändert wurde, indem zuerst mit Xhol gespalten, dann ein glattes Ende mit DNA-Polymerase gebildet und ein Oligonukleotid-BamHI-Linker ligiert wurde und es schließlich als ein BamHI/-BamHI-Fragment zurück in pGEM7Z kloniert wurde. Das Gen wurde mit einem automatischen Sequenzierer Modell ABI Prism Nr. 377 sequenziert. Darüber hinaus wurde die zytoplasmatische Domäne von KDR, welches Tyrosinkinase-Aktivität enthält, separat als eine GST-Genfusion in einen Baculovirus-Expressionsvektor kloniert, um die Tyrosinkinase-Aktivität zu charakterisieren.
Eine Vielzahl von Säuger-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinanter Human-KDR in Säugerzellen verwendet werden. Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter DNA und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression von eukaryotischer DNA in einer Vielfalt von Wirten, wie z.B. Bakterien, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Tierzellen, verwendet werden. Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initiierung von RNA-Synthese veranlasst. Ein starker Promotor ist einer, welcher die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlasst. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren.
Im Handel erhältliche Säuger-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante Human-KDR-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pcDNA3.1 (Invitrogen), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 und pLITMUS39 (New England Biolabs), pcDNAl, pcDNAlamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und λZD35 (ATCC 37565).
Eine Vielzahl bakterieller Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinanter Human-KDR in Bakterienzellen verwendet werden. Im Handel erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, welche für die rekombinante Human-KDR-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pCR2.1 (Invitrogen), pET11a (Novagen), Lambda gt11 (Invitrogen) und pKK223-3 (Pharmacia).
Eine Vielfalt von Pilzzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinanter Human-KDR in Pilzzellen verwendet werden. Im Handel erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante Human-KDR-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen) und Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen).
Eine Vielfalt von Insektenzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem Rezeptor in Insektenzellen verwendet werden. Im Handel erhältliche Insektenzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante Expression von Human-KDR geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pBlueBacIII und pBlueBacHis2 (Invitrogen) und pAcG2T (Pharmingen).
Ein Expressionsvektor, der für ein Human-KDR-ähnliches Protein codierende DNA enthält, kann zur Expression von Human-KDR in einer rekombinanten Wirtszelle verwendet werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie z.B. Hefe, Säugerzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zelllinien, die von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagern stammen, und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, von Drosophila und der Seidenraupe abgeleitete Zelllinien. Von Säugerspezies abgeleitete Zelllinien, welche geeignet sein mögen und im Handel erhältlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, L-M(TK^-)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), Saos-2 (ATCC HTB-85), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), 01271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171) und CPAE (ATCC CCL 209).
Der Expressionsvektor kann mit irgendeinem einer Vielfalt von Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion und Elektroporation, in Wirtszellen eingeführt werden. Die Expressionsvektor enthaltenden Zellen werden individuell analysiert, um festzustellen, ob sie Human-KDR-Protein produzieren. Die Identifizierung von Human-KDR exprimierenden Zellen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-Human-KDR-Antikörpern, Bindung eines markierten Liganden und Anwesenheit von wirtszellassoziierter Human-KDR-Aktivität.
Die mit den oben beschriebenen Verfahren erhaltene klonierte Human-KDR-cDNA kann durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor (wie z.B. pcDNA3.1, pCR2.1, pBlueBacHis2 und pLITMUS28), enthaltend einen geeigneten Promotor und andere geeignete regulatorische Transkriptionselemente, rekombinant exprimiert und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen überführt werden, um rekombinante Human-KDR zu produzieren. Techniken für solche Manipulationen sind in Sambrook et al., oben, beschrieben zur finden, werden ausführlich im Beispielsabschnitt erörtert und sind dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet wohlbekannt und unschwer verfügbar.
Die Expression von Human-KDR-DNA kann auch unter Verwendung von in vitro hergestellter synthetischer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA kann effizient in verschiedenen zellfreien Systemen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte und Retikulozytenlysate, translatiert werden, ebenso wie in zellbasierten Systemen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Froschoozyten, wobei die Mikroinjektion in Froschoozyten bevorzugt ist.
Zur Bestimmung der Human-KDR-cDNA-Sequenz(en), welche optimale Niveaus an Human-KDR ergibt/ergeben, können cDNA-Moleküle konstruiert werden, welche Folgendes einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind: ein cDNA-Fragment, enthaltend den vollständigen offenen Leserahmen für Human-KDR, sowie verschiedene Konstrukte, die Teile der cDNA enthalten, welche nur für spezifische Domänen des Proteins oder umgelagerte Domänen des Proteins codieren. Alle Konstrukte können so gestaltet werden, dass sie nichts von, die Gesamtheit oder Teile der 5'- und/oder 3'-untranslatierten Region einer Human-KDR-cDNA enthalten. Die Expressionsniveaus und Aktivität von Human-KDR können nach der Einführung, sowohl einzeln als auch in Kombination, dieser Konstrukte in geeignete Wirtszellen bestimmt werden. Nach der Bestimmung der Human-KDR-cDNA-Kassette, die optimale Expression in transienten Assays ergibt, wird dieses KDR-cDNA-Konstrukt in eine Vielfalt von Expressionsvektoren (einschließlich rekombinanter Viren) überführt, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen für Säugerzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Oozyten, Bakterien und Hefezellen.
Niveaus an Human-KDR in Wirtszellen werden durch eine Vielfalt von Techniken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Immunaffinitäts- und/oder Ligandenaffinitätstechniken, quantitativ bestimmt. KDR-spezifische Affinitätsperlen oder KDR-spezifische Antikörper werden zur Isolierung von ³⁵S-Methionin-markierter oder unmarkierter KDR eingesetzt. Markiertes KDR-Protein wird mittels SDS-PAGE analysiert. Unmarkiertes KDR-Protein wird mittels Westernblots, ELISA- oder RIA-Assays unter Verwendung von KDR-Protein-spezifischen Antikörpern und/oder Antiphosphotyrosin-Antikörpern nachgewiesen.
Nach der Expression von KDR in einer Wirtszelle kann KDR-Protein gewonnen werden, um KDR-Protein in aktiver Form bereitzustellen. Mehrere Reinigungsverfahren für KDR-Protein stehen zur Verfügung und sind für den Einsatz geeignet. Rekombinantes KDR-Protein kann aus Zelllysaten und -extrakten oder aus konditioniertem Kulturmedium gereinigt werden durch verschiedene Kombinationen von oder individuelle Anwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie, Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie und Chromatographie hydrophober Wechselwirkung.
Darüber hinaus kann rekombinantes KDR-Protein von anderen zellulären Proteinen mit Hilfe einer Immunaffinitätssäule abgetrennt werden, die mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellt wurde, welche für KDR-Protein voller Länge oder Polypeptidfragmente von KDR-Protein spezifisch sind. Ferner können polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen ein synthetisches Peptid (gewöhnlich von etwa 9 bis etwa 25 Aminosäuren Länge) von einem Abschnitt des in SEQ-ID-Nr. 2 offenbarten Proteins induziert werden. Monospezifische Antikörper gegen Human-KDR werden aus Säuger-Antiseren gereinigt, welche Antikörper mit Reaktivität gegen Human-KDR enthalten, oder werden als monoklonale Antikörper mit Reaktivität gegen Human-KDR unter Anwendung der Technik von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497), hergestellt. Ein monospezifischer Antikörper, wie hier verwendet, ist definiert als eine einzelne Antikörperspezies oder multiple Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für Human-KDR. Homogene Bindung, wie hier verwendet, bezieht sich auf das Vermögen der Antikörperspezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop, wie z.B. den mit der Human-KDR assoziierten, wie oben beschrieben, zu binden. Human-KDR-spezifische Antikörper werden induziert durch Immunisierung von Tieren wie Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferden und dgl., mit einer geeigneten Konzentration an Human-KDR-Protein oder einem synthetischen Peptid, das von einem Abschnitt von Human-KDR erzeugt wurde, entweder mit oder ohne ein Immunadjuvans.
Vorimmunserum wird vor der ersten Immunisierung gewonnen. Jedes Tier erhält zwischen etwa 0,1 μg und etwa 1000 μg Human-KDR-Protein, assoziiert mit einem annehmbaren Immunadjuvans. Solche annehmbaren Adjuvanzien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, vollständiges Freund-Adjuvans, unvollständiges Freund-Adjuvans, Alaun-Präzipitat, Wasser-in-Öl-Emulsion, die Corynebacterium parvum und tRNA enthält. Die erste Immunisierung besteht aus dem Human-KDR-Protein oder Peptidfragment davon in, vorzugsweise, vollständigem Freund-Adjuvans an mehreren Stellen, entweder subkutan (SC), intraperitoneal (IP) oder beides. Jedem Tier wird in regelmäßigen Abständen, vorzugsweise wöchentlich, Blut entnommen, um Anti körpertiter zu bestimmen. Die Tiere können nach der ersten Immunisierung Booster-Injektionen erhalten oder nicht. Diejenigen Tiere, welche Booster-Injektionen erhalten, bekommen gewöhnlich eine gleiche Menge an Human-KDR in unvollständigem Freund-Adjuvans auf dem gleichen Weg. Booster-Injektionen werden in etwa dreiwöchigen Intervallen gegeben, bis maximale Titer erhalten werden. Nach etwa 7 Tagen nach jeder Booster-Immunisierung oder etwa wöchentlich nach einer Einzelimmunisierung wird den Tieren Blut entnommen, das Serum gewonnen und Aliquots werden bei etwa –20°C gelagert.
Monoklonale Antikörper (mAb), die mit Human-KDR reagieren können, werden durch Immunisierung von Inzucht-Mäusen, vorzugsweise Balb/c, mit Human-KDR-Protein hergestellt. Die Mäuse werden auf dem IP- oder SC-Weg mit etwa 1 μg bis etwa 100 μg, vorzugsweise etwa 10 μg, Human-KDR-Protein in etwa 0,5 ml Puffer oder Salzlösung, inkorporiert in einem gleichen Volumen eines annehmbaren Adjuvans wie oben erörtert, immunisiert. Vollständiges Freund-Adjuvans ist bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine erste Immunisierung am Tag 0 und etwa 3 bis etwa 30 Wochen Ruhe. Die immunisierten Mäuse erhalten eine oder mehrere Booster-Immunisierung(en) von etwa 1 bis etwa 100 μg KDR in einer Pufferlösung wie phosphatgepufferter Salzlösung auf dem intravenösen (IV) Weg. Lymphozyten aus antikörper-positiven Mäusen, vorzugsweise Milz-Lymphozyten, werden durch Entfernung der Milz aus immunisierten Mäusen nach auf diesem Gebiet bekannten Standardverfahren erhalten. Hybridomzellen werden erzeugt durch Mischen der Milz-Lymphozyten mit einem geeigneten Fusionspartner, vorzugsweise Myelomzellen, unter Bedingungen, welche die Bildung stabiler Hybridome erlauben. Fusionspartner können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Maus-Myelome P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 bevorzugt sind. Die antikörper-produzierenden Zellen und Myelomzellen werden in Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bei Konzentrationen von etwa 30 % bis etwa 50 % fusioniert. Die fusionierten Hybridomzellen werden durch Wachstum in mit Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin ergänztem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren selektioniert. Überstandsflüssigkeiten werden aus Vertiefungen mit positivem Wachstum etwa an den Tagen 14, 18 und 21 gewonnen und durch einen Immunoassay, wie z.B. Festphasen-Immunoradioassay (SPIRA), unter Verwendung von Human-KDR als Antigen auf Antikörperproduktion gescreent. Die Kulturflüssigkeiten werden auch in dem Ouchterlony-Präzipitationsassay getestet, um den Isotyp der mAb zu bestimmen. Hybridomzellen aus antikörper-positiven Vertiefungen werden nach einer Technik wie der Soft-Agar-Technik von MacPherson, 1973, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse und Paterson, Hrsg., Academic Press, kloniert.
Monoklonale Antikörper werden in vivo produziert, indem pristan-geprimten Balb/c-Mäusen, etwa 0,5 ml pro Maus, etwa 2 × 10⁶ bis etwa 6 × 10⁶ Hybridomzellen etwa 4 Tage nach dem Primen injiziert werden. Ascites-Flüssigkeit wird etwa 8–12 Tage nach dem Zelltransfer gewonnen und die monoklonalen Antikörper werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gereinigt.
Die in vitro-Produktion von Anti-Human-KDR-mAb erfolgt durch Züchtung der Hybridome in DMEM mit etwa 2 % fetalem Kalbsserum, um ausreichende Mengen der spezifischen mAb zu erhalten. Die mAb werden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt.
Die Antikörpertiter von Ascites- oder Hybridomkultur-Flüssigkeiten werden durch verschiedene serologische oder immunologische Assays bestimmt, welche umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf, Präzipitation, passive Agglutination, enzym-gekoppelte Immunosorbens-Antikörper (ELISA)-Technik und Radioimmunoassay (RIA)-Techniken. Ähnliche Assays werden eingesetzt, um die Anwesenheit von Human-KDR in Körperflüssigkeiten oder Gewebe und Zellextrakten nachzuweisen.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist ohne weiteres ersichtlich, dass die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung monospezifischer Antikörper eingesetzt werden können, um Antikörper herzustellen, die für Human-KDR-Peptidfragmente oder Volllängen-Human-KDR spezifisch sind.
Human-KDR-Antikörper-Affinitätssäulen werden beispielsweise hergestellt durch Zugabe der Antikörper zu Affigel-10 (Biorad), einem Gelträger, der mit N-Hydroxysuccinimidestern voraktiviert ist, so dass die Antikörper kovalente Verknüpfungen mit dem Agarosegelperlen-Träger bilden. Die Antikörper werden dann an das Gel über Amidbindungen mit dem Spacer-Arm gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gequencht. Die Säule wird mit Wasser, gefolgt von 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6), gewaschen, um jeglichen nicht-konjugierten Antikörper oder Fremdprotein zu entfernen. Die Säule wird dann in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,3) äquilibriert und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, die Vollängen-Human-KDR oder Human-KDR-Proteinfragmente enthalten, werden langsam durch die Säule geleitet. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, bis die optische Dichte (A₂₈₀) bis zum Hintergrund abnimmt, dann das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) eluiert. Das gereinigte KDR-Protein wird dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert.
Das Human-KDR-Protein der vorliegenden Erfindung ist geeignet zur Verwendung in einem Assay-Verfahren für die Identifizierung von Verbindungen, welche KDR-Aktivität modulieren. Ein KDR-enthaltendes Fusionskonstrukt, wie z.B. eine GST-KDR-Fusion wie in dieser Patentbeschreibung erörtert, ist zur Messung von KDR-Aktivität geeignet. Kinaseaktivität wird beispielsweise gemessen durch Inkorporation von radioaktiv markiertem Phosphat in Poly(glutaminsäure, tyrosin, 4:1)(pEY)-Substrat. Das phosphorylierte pEY-Produkt wird auf einer Filtermembran festgehalten und die Inkorporation von radioaktiv markiertem Phosphat durch Szintillationszählung quantitativ bestimmt. Lösliche rekombinante GST-Kinasedomäne-Fusionsproteine werden in Sf21-Insektenzellen (Invitrogen) unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors (pAcG2T, Pharmingen) exprimiert. Ein Lysepuffer ist 50 mM Tris, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,5 % Triton X-100, 10 % Glycerin, 10 μg/ml an jeweils Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (alle Sigma). Ein Waschpuffer ist 50 mM Tris, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,05 % Triton X-100, 10 % Glycerin, 10 μg/ml an jeweils Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. Ein Dialysepuffer ist 50 mM Tris, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,05 % Triton X-100, 50 % Glycerin, 10 μg/ml an jeweils Leupeptin, Pepstatin und Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. Ein 10 × Reaktionspuffer ist 200 mM Tris, pH 7,4, 1,0 M NaCl, 50 mM MnCl₂, 10 mM DTT und 5 mg/ml Rinderserumalbumin (Sigma). Ein Enzymverdünnungspuffer ist 50 mM Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 1 mM DTT, 10 % Glycerin, 100 mg/ml BSA. Eine 10 × Substratlösung wäre 750 μg/ml Poly(glutaminsäure,tyrosin, 4:1)(Sigma); Stopplösung ist 30%ige Trichloressigsäure, 0,2 M Natriumpyrophosphat (beide Fischer) und eine Waschlösung ist 15%ige Trichloressigsäure, 0,2 M Natriumpyrophosphat. Die Filterplatten sind Millipore #MAFC NOB, GF/C-Glasfaser-96-Mulden-Platten.
Zuerst werden Sf21-Zellen mit rekombinantem Virus bei einer Multiplizität der Infektion von 5 Viruspartikeln/Zelle infiziert und bei 27°C 48 h lang gezüchtet. Alle nachfolgenden Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Die infizierten Zellen werden durch Zentrifugation bei 1000 × g geerntet und bei 4°C für 30 Minuten mit 1/10 Volumen Lysepuffer, gefolgt von Zentrifugation bei 100.000 × g für 1 h, lysiert. Der Überstand wird dann über eine Glutathion-Sepharose-Säule (Pharmacia) geleitet, in Lysepuffer äquilibriert und mit 5 Volumina desselben Puffers, gefolgt von 5 Volumina Waschpuffer, gewaschen. Rekombinantes GST-KDR-Protein wird mit Waschpuffer/10 mM reduziertem Glutathion (Sigma) eluiert und gegen Dialysepuffer dialysiert.
Der KDR-Assay umfasst die folgenden Schritte:

1. Zugabe von 5 μl Inhibitor oder Kontrolle zu dem Assay in 50 % DMSO;
2. Zugabe von 35 μl Reaktionsmischung, enthaltend 5 μl 10 × Reaktionspuffer, 5 μl 25 mM ATP/10 μCi [³³P]ATP (Amersham), und 5 μl 10 × Substrat;
3. Start der Reaktion durch die Zugabe von 10 μl KDR (25 nM) in Enzymverdünnungspuffer;
4. Mischung und Inkubation bei Raumtemperatur (–22° C) für 15 Minuten;
5. Stopp durch die Zugabe von 50 μl Stopplösung;
6. Inkubation für 15 Minuten bei 4°C;
7. Überführung eines 90-μl-Aliquots auf eine Filterplatte;
8. Absaugen und 3 × Waschen mit 100 μl Waschlösung;
9. Zugabe von 30 μl Szintillationsmischung, Versiegelung der Platte und Zählung in einem Wallac Microbeta-Szintillationszähler.

Die Modulierung von KDR umfasst die Inhibierung oder Aktivierung der Kinase, welche die mitogene Funktion von VEGF beeinflusst. Verbindungen, welche die KDR modulieren, umfassen Agonisten und Antagonisten.
Deshalb kann das Human-KDR-Protein der vorliegenden Erfindung aus sowohl nativen als auch rekombinanten Quellen erhalten werden (als Volllängenprotein, biologisch aktives Proteinfragment oder Fusionskonstrukt) zur Verwendung in einem Assay-Verfahren, um Human-KDR-Modulatoren zu identifizieren. Im allgemeinen wird ein Assay-Verfahren zur Identifizierung von Human-KDR-Modulatoren die intrazelluläre Domäne von Human-KDR beinhalten und eine Testverbindung oder Probe, welche einen mutmaßlichen KDR-Kinase-Agonisten oder -Antagonisten enthält. Die Testverbindungen oder Proben können direkt mit beispielsweise gereinigter KDR, KDR-Kinase oder einer GST-KDR-Kinasefusion, subzellulären Fraktionen von Zellen, die native oder rekombinante KDR produzieren, ganzen Zellen, die native oder rekombinante Human-KDR exprimieren, intrazellulären KDR-Proteinfragmenten bzw. -Deletionsfragmenten, und/oder extrazellulären, intrazellulären KDR-Proteinfragmenten bzw. -Deletionsfragmenten. Die Testverbindung oder die Probe kann KDR in Anwesenheit oder Abwesenheit eines bekannten Human-KDR-Substrats zugegeben werden. Die modulierende Aktivität der Testverbindung oder Probe kann beispielsweise bestimmt werden durch Analyse des Vermögens der Testverbindung oder Probe, an die intrazelluläre KDR-Domäne zu binden, das Protein zu aktivieren, das Protein zu inhibieren, die Bindung von anderen Verbindungen an Human-KDR zu inhibieren oder zu erhöhen, VEGF-Rezeptorregulierung zu modifizieren oder die Kinaseaktivität zu modifizieren.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch subzelluläre Membranfraktionen der rekombinanten Wirtszellen (sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen sowie sowohl stabil als auch transient transformierte Zellen), welche die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen. Diese subzellulären Membranfraktionen werden Human-KDR auf Niveaus umfassen, die erheblich über den Wildtypniveaus liegen, und werden so in verschiedenen, in dieser Beschreibung beschriebenen Assays von Nutzen sein.
Die Identifizierung von Modulatoren von Human-KDR wird bei der Behandlung verschiedener Krankheitszustände von Nutzen sein. Beispielsweise führt Gefäßwachstum in oder in der Nähe der Retina zu einer visuellen Degeneration, die in Blindheit kulminiert. VEGF ist für den größten Teil der angiogenen Aktivität verantwortlich, die in oder in der Nähe der Retina bei diabetischer Retinopathie entfaltet wird. Okulare VEGF-mRNA und -Protein werden durch Zustände wie Retinavenenverschluss bei Primaten und verringerte pO₂-Niveaus bei Mäusen, die zur Gefäßneubildung führen, erhöht. Die Expression von VEGF ist auch signifikant erhöht in hypoxischen Regionen von tierischen und humanen Tumoren neben Gebieten von Nekrose. VEGF trägt zum Tumorwachstum in vivo bei durch die Förderung von Angiogenese durch seine parakrinen Gefäßendothelzell-Aktivitäten chemotaktischer und mitogener Natur. Die Inhibierung von KDR wird mit pathologischer Gefäßneubildung (Neoangiogenese) in Verbindung gebracht und Verbindungen, welche die mitogene Aktivität von VEGF über die Inhibierung von KDR inhibieren, werden bei der Behandlung von Erkrankungen von Nutzen sein, bei denen eine Gefäßneubildung Teil der Gesamtpathologie ist, wie z.B. diabetische Retina-Vaskularisation, verschiedene Formen von Krebs und Entzündungen, welche hohe Niveaus an Gen- und Proteinexpression demonstrieren. Beispiele solcher Krebsarten umfassen Krebsarten des Gehirns, der Brust, des Urogenitaltrakts, des lymphatischen Systems, des Magens, des Darms, einschließlich Dickdarms, Pankreas, der Prostata, des Kehlkopfs und der Lunge. Diese umfassen histiozytisches Lymphom, Lungen-Adenokarzinom, Glioblastom und kleinzellige Lungentumore. Beispiele von Entzündungen umfassen rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Kontaktdermatitis und Hypersensitivitätsreaktionen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Screenen hinsichtlich Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, kodierend für ein Human-KDR-Protein, modulieren. Verbindungen, welche diese Aktivitäten modulieren, können DNA, RNA, Peptide, Proteine oder organische Nicht-Protein-Moleküle sein. Verbindungen können modulieren durch Erhöhung oder Abschwächung der Expression von DNA oder RNA, die für Human-KDR kodiert, oder der Funktion von Human-KDR. Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, kodierend für Human-KDR, oder deren biologische Funktion modulieren, können mit einer Vielfalt von Assays nachgewiesen werden. Der Assay kann ein einfacher "Ja/Nein"-Assay sein, um festzustellen, ob es eine Veränderung der Expression oder Funktion gibt. Der Assay kann quantitativ gemacht werden durch Vergleich der Expression oder Funktion einer Testprobe mit den Niveaus von Expression oder Funktion in einer Standardprobe. Kits, enthaltend Human-KDR, Antikörper gegen Human-KDR oder modifizierte Human-KDR, können mit bekannten Verfahren für solche Verwendungen hergestellt werden.
Die DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, das rekombinante Protein und die Antikörper der vorliegenden Erfindung können zum Screenen und Messen von Niveaus an Human-KDR verwendet werden. Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antikörper eignen sich zur Formulierung von Kits, welche für den Nachweis und die Typbestimmung von Human-KDR geeignet sind. Ein solcher Kit würde einen in Abteile aufgeteilten Träger umfassen, der geeignet ist, um in einem festen Einschluss mindestens einen Behälter zu halten. Der Träger würde ferner Reagenzien wie rekombinante KDR oder Anti-KDR-Antikörper, geeignet zum Nachweis von Human-KDR, umfassen. Der Träger kann auch ein Nachweismittel, wie z.B. ein markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder dgl., enthalten.
Pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen, welche Modulatoren von Human-KDR enthalten, können nach bekannten Verfahren formuliert werden, wie z.B. durch die Beimischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers. Beispiele solcher Träger und Formulierungsverfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences zu finden. Zur Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die für die effektive Verabreichung geeignet ist, werden solche Zusammensetzungen eine effektive Menge des Proteins, der DNA, RNA, der modifizierten Human-KDR oder entweder KDR-Agonisten oder -Antagonisten, einschließlich Tyrosinkinase-Aktivatoren oder -Inhibitoren, enthalten.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden einem Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht, um Störungen zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die wirksame Menge kann entsprechend einer Vielfalt von Faktoren, wie z.B. dem Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter des Individuums, variieren. Andere Faktoren umfassen den Verabreichungsmodus.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer Vielfalt von Wegen, wie z.B. subkutan, topisch, oral und intramuskulär, verabreicht werden.
Der Begriff "chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, das zusätzliche chemische Gruppierungen enthält, die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Solche Gruppierungen können die Löslichkeit, Halbwertszeit, Absorption etc. des Grundmoleküls verbessern. Alternativ können die Gruppierungen unerwünschte Nebenwirkungen des Grundmoleküls abschwächen oder die Toxizität des Grundmoleküls verringern. Beispiele solcher Gruppierungen werden in einer Vielfalt von Texten, wie z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben.
Verbindungen, die gemäß den hier offenbarten Verfahren identifiziert wurden, können alleine in geeigneten Dosierungen eingesetzt werden. Alternativ kann eine gemeinsame Verabreichung oder sequentielle Verabreichung anderer Agenzien wünschenswert sein.
Die Zusammensetzungen, welche Verbindungen enthalten, die gemäß dieser Erfindung als aktiver Bestandteil identifiziert wurden, können in einer breiten Vielfalt therapeutischer Dosierungsformen in herkömmlichen Vehikeln für die Verabreichung verabreicht werden. Beispielsweise können die Verbindungen in solchen oralen Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen zur zeitbestimmten Freisetzung und verzögerten Freisetzung), Dragees, Pulver, Granula, Elixiere, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Emulsionen, oder durch Injektion, verabreicht werden. Gleichermaßen können sie auch intravenös (sowohl Bolus als auch Infusion), intraperitoneal, subkutan, topisch mit oder ohne Okklusion oder in intramuskulärer Form, jeweils unter Verwendung von Formen, die Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannt sind, verabreicht werden.
Vorteilhafter Weise können die Verbindungen in einer einzigen Tagesdosis verabreicht werden oder die Gesamttagesdosis kann in aufgeteilten Dosen von zwei-, drei- oder viermal täglich verabreicht werden. Ferner können Verbindungen für die vorliegende Erfindung in intranasaler Form über die topische Anwendung geeigneter intranasaler Vehikel oder über transdermale Routen unter Verabreichung derjenigen Formen transdermaler Hautpflaster, die Durchschnittsfachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, verabreicht werden. Zur Verabreichung in Form eines transdermalen Abgabesystems wird die Dosierungsverabreichung natürlich eher kontinuierlich als unterbrochen bei dem Dosierungsplan sein.
Für eine Kombinationsbehandlung mit mehr als einem aktiven Agens, wobei sich die aktiven Agenzien in separaten Dosierungsformulierungen befinden, können die aktiven Agenzien gleichzeitig verabreicht werden oder sie können zu separat versetzten Zeiten verabreicht werden.
Der Dosierungsplan unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird gemäß einer Vielfalt von Faktoren gewählt, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischer Zustand des Patienten; die Schwere des zu behandelnden Krankheitszustandes; die Verabreichungsroute; die Nieren-, Leber- und kardiovaskuläre Funktion des Patienten; und die speziell davon eingesetzte Verbindung. Ein Arzt oder Veterinärmediziner von durchschnittlichen Fähigkeiten kann unschwer die effektive Menge des Arzneiwirkstoffes bestimmen und verschreiben, welche erforderlich ist, um den/m Fortschritt des Krankheitszustands zu verhindern, entgegenzuwirken oder zum Stillstand zu bringen. Eine optimale Präzision bei der Erreichung von Konzentrationen an Arzneiwirkstoff innerhalb des Bereichs, der eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert einen Behandlungsplan auf der Basis der Kinetik der Verfügbarkeit des Arzneiwirkstoffes für Zielstellen. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung eines Arzneiwirkstoffes.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, ohne jedoch dieselbe darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Isolierung einer cDNA, die für Human-KDR kodiert
Materialien – Eine Human-Umbilikalvenen-Endothelzell-Lambdaphagen-cDNA-Bank wurde von Clonetech (Katalog-Nr. HL1070b) bezogen. DNA-Modifizierungs- und Restriktionsenzyme wurden von Promega bezogen. Das Plasmid pGEM7Z wurde von Promega bezogen (Katalog-Nr. P2251). Taq-Polymerase stammte von Perkin Elmer Cetus (Artikelnummer N801-0055). BamHI-Linker wurden von New England Biolabs bezogen (Katalog-Nr. 1071). [α-³²P]-dATP wurde von Amersham bezogen (Katalog-Nr. PB 10204). Rediprime wurde ebenfalls von Amersham bezogen (Katalog-Nr. RPN 1633). Der Baculovirus-Expressionsvektor pAcG2T wurde von Pharmingen bezogen (Katalog-Nr. 21414P).
Die verwendeten PCR-Primer sind wie folgt:

KDR-A 5'-GGAATTCCATCCAAGCGGCAAATGTGTC-3' (SEQ-ID-Nr. 3),
KDR-B 5'-GGAATTCCGAGTCTTCTACAAGGGTCTC-3' (SEQ-ID-Nr. 4),
KDR-C 5'-TTATGACAACACAGCAGG-3' (SEQ-ID-Nr. 5) und
KDR-D 5'-TTGGATCCTCGAGTTGGGGTGTGGATGC-3' (SEQ-ID-Nr. 6).

Methoden: Genklonierung – Die KDR-cDNA wurde durch Sondierung einer Human-Umbilikalvenen-Endothelzell-Lambdaphagen-cDNA-Bank von Clonetech mit einer KDR-spezifischen 576-Basenpaar-DNA-Sonde isoliert. Die Sonde wurde mittels PCR unter Verwendung der Primer KDR-A/KDR-B und Taq-Polymerase hergestellt, dann durch statistisches Primen auf eine spezifische Aktivität von 1 × 10⁷ CpM/ng markiert. Phagen wurden mit etwa 50.000 Plaques/Platte ausplattiert und die Hybridisierung erfolgte nach Standardprotokollen. Insgesamt 1 × 10⁶ Phagen wurden gescreent. Lambdaphagen-Klone, die nur einmal vorkommende Inserts enthielten, wurden durch drei Runden von Replattierung isoliert und dann charakterisiert. Die 110 3'-Basenpaare, die nicht in irgendeinem der isolierten Klone repräsentiert waren, wurden mittels PCR aus derselben Bank wie oben unter Verwendung der Primer KDR-C und KDR-D kloniert. Überlappende Klone wurden dazu verwendet, ein Volllängen-KDR-Gen durch Restriktionsenzymverdauung, Isolierung der individuellen Genfragmente und Ligierung in pGEM7Z zu generieren (Restriktionsenzyme und Ligase stammten von Promega). Das Gen enthielt eine Xhol-Stelle am 5'-Ende, welche zu einer BamHI-Stelle verändert wurde, indem zuerst mit Xhol gespalten, dann ein glattes Ende mit DNA-Polymerase gebildet und ein Oligonukleotid-BamHI-Linker ligiert und es schließlich als BamHI/BamHI-Fragment zurück in pGEM7Z kloniert wurde. Das Gen wurde mit einem automatischen Sequenzierer ABI Prism Modell Nr. 377 sequenziert. Die cDNA-Sequenz von Human-KDR ist in 1A und 1B gezeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Human-KDR ist in 2 gezeigt.
BEISPIEL 2
Konstruktion von GST/KDR-1
Die zytoplasmatische Domäne von KDR, welche Tyrosinkinase-Aktivität enthält, wurde separat als eine Glutathion S-Transferase (GST)-Genfusion in einen Baculovirus-Expressions vektor kloniert, um Tyrosinkinase-Aktivität zu charakterisieren. Zur Konstruktion dieser GST-Fusion wurde eine Kpn I-Klonierungsstelle in das KDR-Gen eingeführt durch Änderung der Codons, welche für die Reste Gly 800 (GGG zu GGC) und Leu 802 (TTG zu CTG) codierten, und die existierende BamHI-Stelle wurde durch Änderung des Codons, welcher für Asp 807 codierte, (GAT zu GAC) entfernt; diese Änderungen sind still und verändern die Aminosäuresequenz des Rezeptors nicht. Eine neue BamHI-Stelle wurde eingeführt, um eine Fusion im Leserahmen mit dem Carboxyterminus von GST und KDR bei Ala 792 zu bilden. Die BamHI-verdauten GST- und KDR-Fragmente wurden ligiert, um die Leserahmen-GST/KDR-Fusion zu erzeugen. Aktives GST-KDR-Tyrosinkinase-Protein wird in Insektenzellen produziert.
BEISPIEL 3
Konstruktion der KDR-Kern-Kinasedomäne
Die Kinasedomäne von KDR wurde kloniert unter Verwendung der bereits existierenden BamHI-Stelle am 5'-Ende der Kinasedomäne und Einführung eines Stoppcodons, gefolgt von einer SalI-Stelle am 3'-Ende der Kinasedomäne (Tyrosin 1175, TAC verändert zu TAA). KDR-DNA wurde als Matrize in einer PCR-Reaktion mit den Primern KDR-E (5'-GGATCCAGATGAACTCCCATTG-3' [SEQ-ID-Nr.]) und KDR-F (5'-GTCGACTTAGTCTTTGCCATCCTGCTGAGC-3' [SEQ-ID-Nr. 8]) verwendet. Das resultierende KDR-Kernkinase-BamHI/SalI-Fragment wurde in pBlueBacHis2B kloniert, dies erzeugt eine Fusion des Methionin-Initiationscodons und der Polyhistidinsequenz des Vektors mit der KDR-Kinasedomäne im Leserahmen. Dieser Vektor, pBBH-KDR-1, liefert auch eine Enterokinase-Erkennungsstelle, um das His-Tag-Polypeptid durch Proteolyse zu entfernen. Das KDR-Kern-Kinaseprotein wurde in Insektenzellen exprimiert und auf einer nickel-chelierenden Säule gereinigt. Die gereinigte KDR-Kernkinase war in dem hier beschriebenen Kinase-Assay aktiv.
BEISPIEL 4
Molekulare Modellierung von Human-KDR
Die zytoplasmatische Domäne des VEGF-Rezeptors wurde manuell der Sequenz von FGFR1, wie entnommen der veröffentlichten Kristallstruktur (Mohammadi, M., Schlessinger, J. und Hubbard, S. R., 1996, Cell 86: 577) zugeordnet. Die Sequenzen sind bei dieser Zuordnung zu 60 % identisch. Eine Homologiemodell von KDR-Kinase wurde dann in Quants (Version 4.1p) durch Kopieren der Koordinaten von der FGFR1/AMP-PCP-Kristallstruktur aufgebaut. Die Kinase-Insert-Region (Reste 933–1006 in KDR) war in dem Modell nicht eingeschlossen, da es keine einmalige Konformation für diese Region in der Kristallstruktur gab. Das Homologiemodell wurde dann minimiert unter Verwendung von CHARMM im Rahmen von Quants, was das Proteingerüst beschränkte und den Seitenketten freie Bewegung gestattete.
Die Änderung des Aminosäurerests 848 von dem veröffentlichten Glu zu Val in SEQ-ID-Nr. 2 wird in dem glycin-reichen Lappen gefunden, der einen Teil der ATP-Bindungstasche bildet. Das hoch konservierte Val wird befunden, hydrophobe Kontakte mit ATP in anderen Kinasen zu bilden, und scheint so positioniert zu sein, um die selben Kontakte in KDR auszubilden. Ein geladenes Glu an dieser Position macht wahrscheinlich keinen korrekten Kontakt mit ATP. Dies wird durch Computermodelle in 3A und 3B gezeigt. 3A zeigt die ATP-Bindungsdomäne von dem KDR-V848E-Mutanten-Homologiemodell mit gebundenem AMP-PCP. Die Seitenkette von E848 befindet sich in Kontakt mit dem Adenin von AMP-PCP. Das Gammaphosphat von AMP-PCP ist nicht sichtbar. Die Protein-Alphakohlenstoff-Spur ist in Schläuchen gezeigt, das AMP-PCP als Zweige und die E848-Seitenkette raumfüllend. Der N-terminale Lappen ist blau gefärbt (oder alternativ mit hellen Kreisen markiert), mit Ausnahme des glycinreichen Lappens, der grün gefärbt ist (oder alternativ als gestrichelte Region markiert). Der C-terminale Lappen ist rot gefärbt (oder alternativ mit dunklen Kreisen markiert). 3B zeigt die ATP-Bindungsdomäne von dem KDR-Homologiemodell mit gebundenem AMP-PCP. Die Seitenkette von V848 bildet hydrophobe Kontakte mit dem Adenin von AMP-PCP. Das Gammaphosphat von AMP-PCP ist nicht sichtbar. Die Protein-Alphakohlenstoff-Spur ist in Schläuchen gezeigt, das AMP-PCP als Zweige und die V848-Seitenkette raumfüllend. Der N-terminale Lappen ist blau gefärbt (oder alternativ mit hellen Kreisen markiert), mit Ausnahme des glycin-reichen Lappens, der grün gefärbt ist (oder alternativ als gestrichelte Region markiert). Der C-terminale Lappen ist rot gefärbt (oder alternativ mit dunklen Kreisen markiert).
BEISPIEL 5
Tyrosin-Phosporylierung von KDRcyt-Mutanten
Gereinigte KDR_cytE848 und KDR_cytV848 wurden bei Konzentrationen von 12 ng bzw. 120 ng mit oder ohne 1 mM ATP bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch die Zugabe eines gleichen Volumens an 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer und 5 Minuten lang zum Sieden gebracht. Reaktionsprodukte wurden mittels 7,5 %/SDS-PAGE aufgetrennt und mit Westernblots, sondiert mit dem Antiphosphotyrosin-Antikörper PY20 (Transduction Laborstories; 4A) oder einem Anti-KDR-Antikörper (Santa Cruz Biotechnology; 4B), analysiert, unter Verwendung des ECL-Nachweiskits sichtbar gemacht und durch Scanning mit einem Densitometer (Molecular Dynamics) quantitativ bestimmt. 4A zeigt, dass das gereinigte GST-KDR_cytE848 zur Autophosphorylierung in Gegenwart von 1 mM ATP nicht in der Lage war, wohingegen 12 ng GST-KDR_cytV848 in Gegenwart von 1 mM ATP zur Autophosphorylierung führten. 4B zeigt ein Signal gegen Anti-KDR-Antikörper für 120 ng GST-KDR_cytE848 und 12 ng von GST-KDR_cytV848. SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches für eine biologisch aktive Form des Human-KDR-Proteins codiert, wobei Position 848 Val, Position 498 Glu, Position 772 Ala, Position 787 Arg, Position 835 Lys und Position 1347 Ser ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches die in SEQ-ID-Nr. 1 angegebene Nukleotidsequenz aufweist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches für einen intrazellulären Abschnitt eines Human-KDR-Proteins codiert, der Aminosäure 790 bis Aminosäure 1356 der in SEQ-ID-Nr. 2 angegebenen Sequenz umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 3, wobei ein Terminationscodon so inseriert ist, dass der offene Leserahmen für KDR bei Tyr 1175 endet.
Nukleinsäure nach Anspruch 3, welche für ein lösliches KDR-Fusionsprotein codiert, das Aminosäure 790 bis Aminosäure 1356 der in SEQ-ID-Nr. 2 angegebenen Sequenz umfasst.
Nukleinsäure nach Anspruch 5, welche für GST-KDR codiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, welche in einem DNA-Vektor, pBlueBacHis2B, enthalten ist.
Expressionsvektor zur Expression eines Human-KDR-Proteins in einer rekombinanten Wirtszelle, wobei der Expressionsvektor eine Nukleinsäure wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 definiert umfasst.
Wirtszelle, welche ein rekombinantes Human-KDR-Protein exprimiert, wobei die Wirtszelle einen Expressionsvektor nach Anspruch 8 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 9, welche eine eukaryotische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 9, welche eine prokaryotische Zelle ist.
Subzelluläre Membranfraktion, erhalten aus einer Wirtszelle nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, welche rekombinantes Human-KDR-Protein enthält.
Verfahren zur Expression eines Human-KDR-Proteins in einer rekombinanten Wirtszelle, umfassend: a) Transfizieren eines Expressionsvektors nach Anspruch 8 in eine geeignete Wirtszelle; und b) Kultivieren der Wirtszelle von Schritt a) unter Bedingungen, welche die Expression des Human-KDR-Proteins von dem Expressionsvektor erlauben.
Isoliertes Human-KDR-Protein, welches aus der in SEQ-ID-Nr. 2 angegebenen Aminosäuresequenz besteht.
Isoliertes Proteinfragment, welches ein intrazellulärer Abschnitt eines Human-KDR-Proteins ist und welches Aminosäure 790 bis Aminosäure 1356 der in SEQ-ID-Nr. 2 angegebenen Sequenz umfasst.
Protein nach Anspruch 15, welches ein lösliches KDR-Fusionsprotein ist.
Protein nach Anspruch 16, welches GST-KDR ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche ein Modulator von Human-KDR ist, welches Verfahren umfasst: a) Kombinieren eines Proteins wie in irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17 definiert, eines Substrats und einer Testverbindung; und b) Messen der Tyrosinkinase-Aktivität des Proteins.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Substrat pEY ist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei das Protein GST-KDR ist.