DE19758745C5 - Laser-Scanning-Mikroskop - Google Patents
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Abstract
Konfokales
Laserscanmikroskop,
mit einer Laseranordnung zur punktförmigen Beleuchtung einer zu untersuchenden Probe (5)
und einem Detektionsstrahlengang (26.1–26.4) mit mehreren, das Probenlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen registrierenden Detektoren (31), wobei den Detektoren konfokale Detektionsblenden (29) vorgeschaltet sind,
wobei Strahlteiler (28) vorgesehen sind, die das Probenlicht in mehrere Detektionskanäle aufteilen,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine gemeinsame Abbildungsoptik (25) für alle Detektionskanäle vorgesehen ist, und
daß die konfokalen Detektionsblenden (29) in Richtung der optischen Achse verschiebbar sind, um die chromatischen Aberrationen abbildender Elemente im Detektionsstrahlengang (26.1–26.4) für jede detektierte Wellenlänge auszugleichen.
mit einer Laseranordnung zur punktförmigen Beleuchtung einer zu untersuchenden Probe (5)
und einem Detektionsstrahlengang (26.1–26.4) mit mehreren, das Probenlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen registrierenden Detektoren (31), wobei den Detektoren konfokale Detektionsblenden (29) vorgeschaltet sind,
wobei Strahlteiler (28) vorgesehen sind, die das Probenlicht in mehrere Detektionskanäle aufteilen,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine gemeinsame Abbildungsoptik (25) für alle Detektionskanäle vorgesehen ist, und
daß die konfokalen Detektionsblenden (29) in Richtung der optischen Achse verschiebbar sind, um die chromatischen Aberrationen abbildender Elemente im Detektionsstrahlengang (26.1–26.4) für jede detektierte Wellenlänge auszugleichen.
Description
- Stand der Technik
- Im Handbook of Biological Confocal Microscopy, Second Edition (James B. Pawley), Plenum Press New York and London 1995 ist auf Seite 519,
6 eine Fasereinkopplungsoptik beschrieben. - Auf Seite 595,
14 wird ein telezentrisches System für mehrere Detektionsstrahlengänge beschrieben. -
US 5283433 zeigt eine Einkoppeloptik für Detektionsstrahlengänge. -
DE 43 23 129 A1 beschreibt in Spalte 6 zentrierbare und bezüglich ihres Durchmessers variierbare Konfokalblenden. -
-
US 5081350 ,EP 283256 A2 WO 90/00754 A1 - In
EP 283256 A2 - Auf Seite 598 des Handbook of Biological Confocal Microscopy, Second Edition, sowie in
DE 43 23 129 A1 sind konfokale Laser-Scanning-Mikroskope mit einer Mehrzahl von Detektionskanälen für unterschiedliche Wellenlängen beschrieben. Die Detektionskänäle weisen jeweils separate Abbildungsoptiken auf. - In Histochem. Cell Biol. (1995) 104: 97–137 sind grundlegende Zusammenhänge zu chromatischen Aberrationen bei der konfokalen Mikroskopie beschrieben. Weiterhin ist dort offenbart, dass zum Anpassen eines Strahlengangs an jeweils unterschiedliche Wellenlängen eine Axialposition der konfokalen Abbildungsapertur angepasst werden kann.
- In einem Laser-Scanning-Mikroskop werden beleuchtungsseitig mehrere Wellenlängen eingestrahlt und auch mehrere Wellenlängenbänder detektiert.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, bei einer Beleuchtung mit mehreren Wellenlängen die Zuverlässigkeit des Meßergebnisses auf einfache Weise zu erhöhen.
- Die Aufgabe wird bei einem Laserscanmikroskop nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 durch die kennzeichnenden Merkmale gelöst.
- Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
- Darstellung der Wirkungsweise und Vorteile der erfindungsgemäßen Lösung anhand der Ausführungsbeispiele gemäß der schematischen Darstellungen
1 –6 - Es zeigen:
-
1 eine modulare Anordnung aus Mikroskop M, Scankopf S und Lasereinheit; -
2 eine Darstellung des Strahlverlaufs im Scankopf S; -
3 die optische Wirkung der verschieblichen Kollimationsoptik16 ; -
4 die optische Wirkung der in Richtung der optischen Achse verschieblichen Pinholes; -
5 die optische Wirkung der senkrecht zur optischen Achse verschieblichen Pinholes bei verschiedenen reflektierenden Strahlteilern; -
6 Scankopf S. Mikroskop M sowie eine Faser hinter dem Pinhole im Detektionsstrahlengang. - 1. In
1 sind schematisch eine Mikroskopeinheit M und ein Scankopf S dargestellt, die eine gemeinsame optische Schnittstelle über eine Zwischenabbildung Z gemäß2 ausweisen. - Der Scankopf S kann sowohl an den Phototubus eines aufrechten Mikroskopes sowie auch vorteilhaft an einen seitlichen Ausgang eines inversen Mikroskopes angeschlossen sein. In
1 ist ein zwischen Auflichtscan und Durchlichtscan mittels eines schwenkbaren Spiegels14 umschaltbarer mikroskopischer Strahlengang dargestellt, mit Lichtquelle1 , Beleuchtungsoptik2 , Strahlteiler3 , Objektiv4 , Probe5 , Kondensor5 , Lichtquelle7 , Empfängeranordnung8 , einer ersten Tubuslinse9 , einem Beobachtungsstrahlen gang mit einer zweiten Tubuslinse10 und einem Okular11 sowie einem Strahlteiler zur Einkopplung des Scanstrahls. - Ein Lasermodul
13.1 ,13.2 nimmt die Laser auf und ist über Lichtleitfasern14.1 ,14.2 mit der Lasereinkoppeleinheit des Scankopfes S verbunden. - Die Einkopplung der Lichtleitfasern
14.1 ,14.2 erfolgt mittels einer verschieblichen Kollimationsoptik16 , auf die noch näher eingegangen wird, sowie Strahlumlenkelementen17.1 ,17.2 . - Mittels eines teildurchlässigen Spiegels
18 wird ein Überwachungsstrahlengang in Richtung einer Monitordiode19 , der, vorteilhaft auf einem nicht dargestellten drehbaren Filterrad Linienfilter21 sowie Neutralfilter20 vorgeordnet sind, ausgeblendet. - Die eigentliche Scaneinheit besteht aus Scanningobjektiv
22 , Scanner23 , Hauptstrahlteiler24 und einer gemeinsamen Abbildungsoptik25 für Detektionskanäle26.1 –26.4 . - Ein Umlenkprisma
27 hinter der Abbildungsoptik25 spiegelt die vom Objekt5 kommende Strahlung in Richtung dichroitischer Strahleiler28 im konvergenten Strahlengang der Abbildungsoptik25 , denen in Richtung und senkrecht zur optischen Achse verstellbare und in ihrem Durchmesser veränderbare Pinholes29 , individuell für jeden Detektionskanal sowie Emissionsfilter30 und geeignete Empfängerelemente31 (PMT, Photomultiplier) nachgeordnet sind. - Die Strahlteiler
27 ,28 können vorteilhaft, wie in5 schematisch dargestellt, als Teilerrad mit mehreren Positionen, motorisch durch Schrittmotoren umschaltbar, ausgebildet sein. - 2.
Vorteilhaft erfolgt eine Einkopplung von UV-Strahlung in Glasfaser
14.1 , vorzugsweise einer Single-Mode-Glasfaser mittels eines AOTF (Acousto Optical Tunable Filter) als Strahlablenker, d. h. wenn die Strahlung nicht auf den Fasereingang fallen soll, wird sie mittels des AOTF vom Fasereingang, beispielsweise in Richtung einer nicht dargestellten Lichtfalle, abgelenkt. - Die Einkoppeloptik
33 zur Einkopplung der Laserstrahlung weist zur Einkopplung nicht dargestellte Linsensysteme auf, deren Brennweite durch den Strahlquerschnitt der Laser und die für die optimale Einkopplung erforderliche numerische Apertur festgelegt ist. - Im Lasermodul
13.2 sind Einzel- und Multiwellenlängenlaser vorgesehen, die einzeln oder gemeinsam über einen AOTF in eine oder mehrere Fasern eingekoppelt werden. - Weiterhin kann die Einkopplung auch über mehrere Fasern gleichzeitig erfolgen, deren Strahlung mikroskopseitig nach Durchlaufen einer Anpaßoptik durch Farbvereiniger gemischt wird.
- Auch die Mischung der Strahlung verschiedener Laser am Fasereingang ist möglich und kann anhand der schematisch dargestellten, auswechselbar und schaltbar ausgebildeten Teilerspiegel
39 erfolgen. - 3. Die in
2 und3 divergent aus dem Faserende der Fasern14.1 ,2 an der Scaneinheit5 austretende Laserstrahlung wird mittels der Kollimationsoptik16 auf einen Unendlichstrahl kollimiert. - Das erfolgt vorteilhaft mit einer einzelnen Linse, die durch Verschiebung entlang der optischen Achse mittels einer über eine zentrale Ansteuereinheit
34 ansteuerbare Steuereinheit37 eine Fokussierungsfunktion hat, indem ihr Abstand zum Ende der Lichtleitfaser14.1 ,2 an der Scaneinheit erfindungsgemäß veränderbar ist. - Die Wirkung der Verschiebung der Kollimationsoptik
16 ist schematisch in3a und3b dargestellt. - In
3a ist der Strahlverlauf für zwei unter schiedliche Wellenlängen λ1, λ2 dargestellt. Da für eine polychromatische Lichtquelle mittels einer feststehenden Abbildungsoptik in eine Bildebene nur für eine mittlere Wellenlänge des Spektralbereiches abgebildet wird, wird mittels der Ansteuereinheit37 der Abstand von Faserende und Kollimationsoptik verändert. Für die beiden dargestellten Wellenlängen ergeben sich die Linsenstellungen S1, S2, um für beide Wellenlängen die gleiche Fokuslage zu gewährleisten. - Dadurch wird vorteilhaft bewirkt, daß im Falle der Fluoreszenzmikroskopie die Fluoreszenzstrahlung im Fokus des auf unendlich eingestellten Objektives
4 entsteht und die Anregungsstrahlung in dieselbe Ebene fokussiert wird. Es können auch mehrere Fasern und Faserkollimatoren zur Einstellung unterschiedlicher chromatischer Kompensationen für unterschiedliche Anregungswellenlängen Verwendung finden. - Weiterhin kann hierdurch eine chromatische Korrektion der eingesetzten Optik, insbesondere der Mikroskopobjektive erfolgen.
- Durch mehrere Einkoppelfasern und Kollimationsoptiken für unterschiedliche Wellenlängen können unabhängig verschiedene chromatische Kompensationen eingestellt werden.
- Die variable Kollimation durch Verschiebung der Linse
16 kann auch zur Realisierung eines z-scans verwendet werden, indem mittels der verschieblichen Kollimatorlinse16 der Fokus im Präparat in z-Richtung verschoben wird und ein optischer Schnitt nach dem anderen detektiert wird. Dies ist in3b für eine Wellenlänge λ dargestellt, wobei den Stellungen S1, S2 die Fokuslagen F1, F2 entsprechen. - 4. In
2 dient eine Monitordiode19 (die auch, hier nicht dargestellt, eine vorgesetzte Fokussierlinse aufweisen kann) in Verbindung mit einem linien- oder bereichsselektiven Filterrad oder Filterschieber21 , angesteuert von einer Steuereinheit36 , zur permanenten Überwachung der in das Scanmodul eingekoppelten Laserstrahlung, insbesondere um die Leistung in einer bestimmten Laserlinie isoliert zu kontrollieren und gegebenenfalls mittels eines Regelsignales der Ansteuereinheit34 zu stabilisieren. - Die Detektion mittels der Monitordiode
19 erfaßt das Laserrauschen und Variationen aufgrund des mechanisch-optischen Übertragungssystems. - Aus der detektierten momentanen Laserleistung kann dabei ein Fehlersignal abgeleitet werden, das on-line direkt auf den Laser oder einen dem Laser nachgeschalteten Intensitätsmodulator (ASOM, AOTF, EOM, Shutter) zwecks der Stabilisierung der in das Scanmodul eingestrahlten Laserleistung zurückwirkt.
- Durch die Ansteuerung der Filtereinheit
21 kann somit eine wellenlängenweise Stabilisierung der Intensität und Laserleistungskontrolle erfolgen. - Durch eine Verbindung zur Detektion
31 (PMT) und jeweils zur zentralen Ansteuereinheit kann durch Bildung von Signalquotienen/oder Signalsubtraktion des Detektionssignales und des Monitorsignales der Diode19 eine Rauschverminderung bewirkt werden, in dem, das entsprechende Sensorsignal eines Detektionskanals pixelweise als Pixel-Bildinformation auf das Signal der Monitordiode normiert wird (z. B. Division), um auf diese Weise Intensitätsfluktuationen im Bild zu verringern. - 5. In
1 sind schematisch in verschiedener Weise verstellbare Pinholes29 in den Detektionskanälen26.1 –26.4 dargestellt. Sie können insbesondere senkrecht zur optischen Achse oder in Richtung der optischen Achse verschiebbar angeordnet sowie in bekannter Weise in ihrem Durchmesser, beispielsweise mittels Scherenmechanismus oder Katzenauge veränderbar sein. Die Verstellung der Pinholedurchmesser gestattet ihre Anpassung an die Durchmesser der Airyscheibchen bei unterschiedlichen Beobachtungswellenlängen. - In
4 und5 sind schematisch Ansteuermittel38 für die Verstellung oder Verschiebung der einzelnen Pinholes dargestellt, die Datenleitungen zur zentralen Ansteuereinheit34 aufweisen. - Die ansteuerbare Verschiebbarkeit der Pinholes in Richtung der optischen Achse ist in
4 schematisch dargestellt. Sie ist für den Ausgleich von optischen Fehlern, insbesondere chromatischen Längsaberrationen vorteilhaft. Diese Fehler können beim Scanobjektiv22 , aber auch beispielsweise bei der für die Detektionskanäle gemeinsamen Abbildungsoptik25 auftreten. - Für unterschiedliche Wellenlängen λ1, λ2 ergeben sich durch chromatische Längsabweichungen unterschiedliche Fokuslagen, die unterschiedlichen Pinholelagen P1, P2 entsprechen.
- Bei Auswechslung abbildender Optik, beispielsweise des Mikroskopobjektives, kann bei bekanntem chromatischen Längsfehler der eingesetzten Optik über die Ansteuereinheit
34 und Steuer- und Verschiebemittel38 eine automatische Verschiebung der Pinholes entlang der optischen Achse erfolgen. - Es kann eine genaue Einstellung auf die verwendete Anregungswellenlänge erfolgen.
- Durch eine gemeinsame Abbildungsoptik
25 für alle Detektionskanäle, die vorteilhaft nur aus einem optischen Glied besteht, wird das vom scanobjektiv22 erzeugte, im Unendlichen liegende Bild in die Pinholeebene abgebildet. Die gemeinsame Abbildungsoptik25 bewirkt eine verbesserte Transmissionseffizienz gegenüber bekannten Lösungen. Im Zusammenwirken der Abbildungsoptik mit individuell verstellbaren Pinhòles in den einzelnen Detektionskanälen kann dennoch eine genaue Justierung erfolgen. - 6.
Im Strahlengang können
unterschiedliche dichroitische Strahlteiler
28 eingesetzt werden, je nach verwendeter Wellenlänge, um nur diese zu sperren und einem Detektionsstrahlengang zuzuführen. - Es sind daher (nicht dargestellte) Teilerrevolver oder Teilerräder in verschiedenen Strahlengängen zur Einschwenkung unterschiedlicher, möglichst kleiner Teiler vorgesehen, insbesondere Teilerräder, deren Radachse in 45 Grad gegen die optische Achse geneigt ist, so daß die Teiler immer nur in der Reflexionsebene verschoben wenden.
- Da die auf den Tellerrädern angebrachten Teiler
28 nicht genau gleich justiert sein können oder Schwankungen innerhalb ihrer Justierung oder Standard-Keiltoleranzen unterschiedliche Strahlablenkwinkel verursachen können, erfolgt gemäß der Darstellung in5 eine Verschiebung des jeweiligen Pinholes über Steuereinheit38 senkrecht zur optischen Achse entsprechend der Strahlablenkung. - Hier sind schematisch zwei durch unterschiedliche Stellungen von Teilern
28.1 ,28.2 auf einem nicht dargestellten durch eine Steuereinheit36 angetriebenen Tellerrad dargestellt, die senkrecht zur optischen Achse verschobene Fokuslagen in der Ebene der Pinholes29 bewirken. - Hierbei kann mittels der Ansteuereinheit
34 über die Steuereinheiten36 ,38 eine Kopplung der Stellung des Pinholes29 mit der Teilerradstellung für die Teiler28 erfolgen, d. h. für alle Tellerkonfigurationen verschiedener Tellerrevolver ist eine optimale Pinholeposiition abgespeichert und abrufbar. - Dies betrifft nicht nur die Stellung eines bestimmten Tellerrades, sonden auch die Stellung mehrerer Tellerräder, so daß immer die jeweils optimale Pinholepositon automatisch eingestellt wird.
- 7. In
6 ist schematisch dargestellt, wie am Pinhole29 , am Ausgang zum PMT hinter dem Pinhole, eine Lichtleitfaser40 angesetzt werden kann, um durch das Pinhole des Detektionskanals die Strahlung zu einem externen Sensor31 zu leiten. - Dies erfolgt vorteilhaft ohne zusätzliche Koppeloptik dicht hinter dem Pinhole mit Hilfe der Lichtleitfaser
38 . - Da die Pinholeöffnung verstellbar ist, wird das Austauschen von Fasern mit unterschiedlichen Kerndurchmessern stark vereinfacht, indem die Pinholegröße an den Kerndurchmesser angepaßt wird.
-
- M
- Mikroskop
- S
- Scankopf
- 1
- Lichtquelle
- 2
- Beleuchtungsoptik
- 3
- Strahlteiler
- 4
- Objektiv
- 5
- Probe
- 6
- Kondensor
- 7
- Lichtquelle
- 8
- Empfänger
- 9
- Tubuslinse
- 10
- Tubuslinse
- 11
- Okular
- 12
- Strahlteiler
- 13.1, 13.2
- Laser
- 14
- Lichtleitfasern
- 15
- schwenkbarer Spiegel
- 16
- Kollimationsoptik
- 17
- Strahlumlenkelement
- 18
- teildurchlässiger Spiegel
- 19
- Monitordiode
- 20
- Neutralfilter
- 21
- Linienfilter
- 22
- Scanobjektiv
- 23
- Scanner
- 24
- Hauptstrahlteiler
- 25
- Abbildungsoptik
- 26.1–26.4
- Detektionskanäle
- 27
- Umlenkprisma
- 28, 28.1, 28.2
- dichroitische Strahlteiler
- 29
- verstellbare Pinholes (Lochblenden)
- 30
- Emissionsfilter
- 31
- PMT (Photomultiplier)
- 32
- AOTF (Acousto Optical Tunable Filter)
- 33
- Einkoppeloptik
- 34
- zentrale Ansteuereinheit
- 35, 36, 37, 38
- lokale
Ansteuereinheiten für
Diode
19 , Filterwechsler21 , Kollimatoroptik16 , verstellbare Pinholes29 - 39
- Srahlteiler
- 40
- Lichtleitfaser
- S1, S2, F1, F2
- Fokusstellungen
- P1, P2
- Pinholestellungen
Claims (3)
- Konfokales Laserscanmikroskop, mit einer Laseranordnung zur punktförmigen Beleuchtung einer zu untersuchenden Probe (
5 ) und einem Detektionsstrahlengang (26.1 –26.4 ) mit mehreren, das Probenlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen registrierenden Detektoren (31 ), wobei den Detektoren konfokale Detektionsblenden (29 ) vorgeschaltet sind, wobei Strahlteiler (28 ) vorgesehen sind, die das Probenlicht in mehrere Detektionskanäle aufteilen, dadurch gekennzeichnet, dass eine gemeinsame Abbildungsoptik (25 ) für alle Detektionskanäle vorgesehen ist, und daß die konfokalen Detektionsblenden (29 ) in Richtung der optischen Achse verschiebbar sind, um die chromatischen Aberrationen abbildender Elemente im Detektionsstrahlengang (26.1 –26.4 ) für jede detektierte Wellenlänge auszugleichen. - Konfokales Laserscanmikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ansteuermittel (
38 ) für die Verstellung der konfokalen Detektionsblenden (29 ) vorgesehen sind, welche Datenleitungen zu einer zentralen Ansteuereinheit (34 ) aufweisen, und daß die Ansteuereinheit (34 ) und die Ansteuermittel (38 ) so eingerichtet sind, dass über sie bei Wechsel eines abbildenden optischen Elementes im Mikroskopstrahlengang eine Verschiebung der Detektionsblenden (29 ) in eine für dieses Element vorgesehene, abgespeicherte Stellung erfolgt. - Konfokales Laserscanmikroskop nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die gemeinsame Abbildungsoptik (
25 ) aus einem einzigen optischen Glied besteht.
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