DE19835070B4 - Anordnung zur einstellbaren wellenlängenabhängigen Detektion in einem Fluoreszenzmikroskop - Google Patents

Abstract

Anordnung zur einstellbaren wellenlängenabhängigen Detektion in einem Fluoreszenzmikroskop, vorzugsweise in einem Laser- Scanning- Mikroskop, bestehend aus mindestens einer im Detektionsstrahlengang angeordneten Kombination aus mindestens einem Kurzpaß – und mindestens einem Langpaßfilter zur Erzeugung eines einstellbaren Bandpasses.

Description

• In DE GM1827609 werden mehrere Kurzpassfilter im Beleuchtungsstrahlengang mit mehreren Langpassfiltern im Detektionsstrahlengang einstellbar kombiniert.
• In DE 19702753 A1 erfolgt eine Aufteilung von Detektionskanälen mittels dichroitischer Strahlteiler, auch auswechselbar auf einem Teilerrevolver.
• Die Erfindung betrifft die Hintereinanderschaltung von variablen oder diskreten Kurzpaß- und Langpaßfiltern zur Realisierung eines frei programmierbaren Bandpaßfilters für den Einsatz in der Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere in einem Laser-Scanning-Mikroskop. Diese Filter können vorteilhaft auch an neu auf den Markt kommende Farbstoffe in der Fluoreszenzfärbung angepaßt werden.
• In 1 ist schematisch eine Mikroskopeinheit M und ein angekoppelter Scankopf S dargestellt. Im Mikroskop ist eine Lichtquelle LQ1 mit einer Beleuchtungsoptik vorgesehen, die über einen Strahlteiler ST1 das Objekt auf dem Mikroskoptisch T konventionell beleuchtet. Ein schwenkbarer Spiegel S3 dient zur Umschaltung auf Durchlichtbeleuchtung mittels einer Lichtquelle LQ2 über den Kondensor KO.
• Über eine Tubuslinse TL und einen Spiegel S1 erfolgt die Beobachtung über ein Okular OK.
• Über diesen Spiegel oder Strahlteiler S1 wird weiterhin der Scanstrahlengang eingekoppelt, über die Scanlinse SL und den Scanner SC.
• Das Licht eines Lasers L wird über Verschluß V, Einkoppeloptik EO, Spiegel S2 und Strahlteiler ST2 in Richtung des Scanners SC eingekoppelt.
• Über den dichroitische Strahlteiler ST2 gelangt das vom Objekt kommende Reflexions- und/oder Fluoreszenzlicht über eine Kollimationsoptik KO und ein Pinhole PH auf einen Detektor, dem eine erfindungsgemäße Filtereinheit FE vorgeordnet ist, die in 1a schematisch vergrößert dargestellt ist.
• Die Filtereinheit besteht vorteilhaft aus auswechselbaren Kurzpaß- und Langpaßfiltern, wodurch sich die Breite und der Schwerpunkt eines gewünschten Bandpasses einstellen lassen.
• Zusätzlich kann noch ein sogenannter „Notch"-Filter vorgesehen sein, der nur die Anregungswellenlänge mit hoher optischer Dichte unterdrückt, was die Nachweisempfindlichkeit für das Fluoreszenzlicht noch erhöht.
• Es können natürlich auch in mehreren Detektionskanälen die beschriebenen Filtereinheiten verwendet werden, wobei die Aufteilung der Detektionskanäle in bekannter Weise, beispielsweise gemäß DE 19702753 A1 , mittels dichroitischer Strahlteiler, auch auswechselbar auf einem Teilerrevolver, zur groben Vorselektion des Spektralbereiches erfolgen kann und die Feineinstellung über die erfindungsgemäßen Filtereinheiten erfolgt.
• 2a–d zeigen Beispiele von erfindungsgemäßen Filteranordnungen, 2a hintereinandergeschaltete Filterschieber FS1, FS2 mit kreisförmigen Filtern F1 bzw. F2, wobei in optischen Achse A jeweils zwei unterschiedliche Filter miteinander kombiniert sind.
• In 2b sind die Filter F1, F2 auf drehbaren Filterrädern FR1, FR2 angeordnet und miteinander in der optischen Achse A kombinierbar.
• Besonders vorteilhaft ist die Kombination mindestens zweier kontinuierlicher Verlaufs-Kantenfilter VF1, VF2, in 2c kreisförmig und jeweils verdrehbar, in 2d verschiebbar dargestellt.
• Derartige Kantenfilter sind beispielsweise von COHERENT( Variable Edge- pass-Filters) erhältlich.
• In 2d sind die Verlaufskurven einzelner Filterabschnitte dargestellt, in VF 2 als Kurzpassfilter SP, in VF1 als Langpaßfilter LP.
• In 3 ist anhand von zwei unterschiedlichen Einstellungen dargestellt, wie durch Kombination der Kurz- und Langpaßfilter und gegenseitige Verdrehung beliebig breite Bandpaßfilter für die zu detektierende Wellenlänge erzeugt werden kann.
• Besonders vorteilhaft besteht hierdurch die Möglichkeit, komplette Fluoreszenzspektren von untersuchten exogenen oder endogenen Fluophoren in der Probe durch kontinuierliches schmalbandiges Durchscannen der Wellenlänge, im Sinne eines in der Wellenlänge variablen Monochromators, aufzunehmen. Dadurch kann durch Ansteuerung des Scanners, des Probentisches und der Detektion eine wellenlängenabhängige und zeitabhängige Detektion in x, y und z-Richtung erfolgen, wodurch die fünfdimensionale Generierung (x, y, z, t, λ) eines Probenbildes erfolgt, d.h. die Aufnahme eines Spektrums zu jedem Pixel und jeder zeit im Takt der jeweiligen Abtastung.
• Die erfindungsgemäßen Filtereinheiten können weiterhin vorteilhaft zur spektralen Selektion auf der Beleuchtungsseite eingesetzt werden, beispielsweise an der Stelle des Verschlusses V, beispielsweise zur spektralen Einengung einer breitbandigen Laserlichtquelle oder zur Wellenlängenselektion bei einer HBO oder HAL – Lampe.

Claims (8)

1. Anordnung zur einstellbaren wellenlängenabhängigen Detektion in einem Fluoreszenzmikroskop, vorzugsweise in einem Laser- Scanning- Mikroskop, bestehend aus mindestens einer im Detektionsstrahlengang angeordneten Kombination aus mindestens einem Kurzpaß – und mindestens einem Langpaßfilter zur Erzeugung eines einstellbaren Bandpasses.
2. Anordnung nach Anspruch 1, wobei mindestens ein Filter gegen einen anderen Filter anderer Wellenlängencharakteristik auswechselbar und/oder bezüglich seiner Wellenlängencharakteristik einstellbar ist.
3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, wobei für Kurzpaß und/oder Langpaßfilter Filterwechsler vorgesehen sind.
4. Anordnung nach Anspruch 3, wobei die Filterwechsler Filterschieber oder Filterräder sind.
5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1–4, mit mindestens einem dreh- und/oder verschiebbare kontinuierlich variierende Kurz und/oder Langgpaßfilter.
6. Anordnung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die Filter und/oder Filterwechsler austauschbar sind.
7. Anordnung nach einem der Ansprüche 1–6, wobei Filter und/oder Filterwechsler motorisch angetrieben werden.
8. Verfahren zur Bildaufnahme unter Verwendung einer Anordnung nach einem derAnsprüche 1–7, vorzugsweise in einem Laser- Scanning- Mikroskop, mit einer Zeit- und wellenlängenabhängigen Aufnahme durch eine Detektionseinheit und Abspeicherung in einer Speichereinheit.