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In
einem Laser-Scanning-System werden Laser unterschiedlicher Leistungsklassen
verwendet. Weiterhin ist ein Laser-Scanning-System durch eine grosse
Anzahl von variablen Modulen gekennzeichnet, die als Detektor oder
zur Beleuchtung dienen.
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Ein
konfokales Scanmikroskop enthält
ein Lichtquellenmodul, das bevorzugt aus mehreren Laserstrahlquellen
besteht, die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugen.
Eine Scaneinrichtung, in die das Beleuchtungslicht als Beleuchtungsstrahl
eingekoppelt wird, weist einen Hauptfarbteiler, einen x-y-Scanner
und ein Scanobjektiv auf, um den Beleuchtungsstrahl durch Strahlablenkung über eine
Probe zu führen,
die sich auf einem Mikroskoptisch einer Mikroskopeinheit befindet.
Ein dadurch erzeugter von der Probe kommender Messlichtstrahl wird über einen
Hauptfarbteiler und eine Abbildungsoptik auf mindestens eine konfokale
Detektionsblende (Detektionspinhole) eines Detektionskanals gerichtet.
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In 1 ist
schematisch ein Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskopes dargestellt.
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Ein
LSM gliedert sich im wesentlichen wie in
1 dargestellt
in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop.
Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf
DE 197 02 753 A1 verwiesen.
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Zur
spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden
in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der
Anregungswellenlänge
richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden
Farbstoffe. Der Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt.
Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton,
TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion
der Wellenlängen
und die Einstellung der Intensität
der benötigten
Anregungswellenlänge,
z.B. durch den Einsatz eines akusto-optischen Kristalls. Anschließend gelangt
die Laserstrahlung über
eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.
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Die
in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs
beugungsbegrenzt über
die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert.
Der Fokus rastert punktförmig
die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die
Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde
bis zu einigen 100 Mikrosekunden.
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Bei
einer konfokales Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes,
gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und
darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler
(MD). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird
das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende/Pinhole) fokussiert,
die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet.
Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch
Variieren der Blendengröße kann
die optische Tiefenauflösung
des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich
ein weiterer dichroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung
unterdrückt.
Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels
eines Punktdetektors (PMT) gemessen.
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Bei
Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der
Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders
hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich
bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen
Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem
Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
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In
einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption
angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion,
jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit
abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
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Von
einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen
in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption
nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der
Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer
optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der
Probe kann anschließend
rechnergestützt
ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden.
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Das
LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden
durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften
bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte
dichroitische Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen
Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen
wird.
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In
biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene
Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert
(Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der Technik
entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften
(Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche
Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den
Nebenstrahlteilern (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen
Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x).
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Das
LSM LIVE der Carl Zeiss Micolmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen
Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde
(http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents-Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b).
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Die
Verbindung der Lichtquellenmodule mit dem Scanmodul erfolgt in der
Regel über
Lichtleitfasern.
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Das
Einkoppeln mehrerer unabhängiger
Laser in eine Faser zur Übertragung
zum Scankopf wurde beispielsweise in Pawley:
„Handbook
of Confocal Microskopy„,
Plenum Press, 1994, Seite 151 sowie in
DE 196 33 185 A1 beschrieben.
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In 2 ist
der Bereich nach dem Hauptfarbteiler in Richtung der Detektion dargestellt.
Die in 1 als DBS bezeichneten Nebenfarbteiler sind hier
NFT1 und NFT2, die die Detektionsstrahlung wellenlängenabhängig (Vorselektion)
in Richtung von DetektorenD1-D3,
denen noch vorzugsweise motorisch wechselbare Emissionsfilter EF1-EF3
(Hauptselektion der Wellenlänge)
vorgeordnet sind.
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In 3 ist
dargestellt, dass NFT1 und 2 sowie EF 1-3 als motorisch betriebene
Filterräder
ausgebildet sein können,
um die Flexibilität
bei der Einstellung von detektierten Wellenlängenbereichen zu optimieren.
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Die
in 1 dargestellten Pinholes PH1-4 sind aus Gründen der
Anschaulichkeit in 2-5 n nicht
vorhanden, da auch ein Pinhole für
alle Teilstrahlengänge,
diesen vorangesetzt ausführbar
wäre.
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Emissionsfilter
und dichroitische Strahlteiler wurden nach dem Stand der Technik
bisher unterschiedlich eingesetzt:
- • Emissionsfilter
im Strahlengang vor dem Detektor zur Auswahl der detektierten Wellenlängen, senkrecht
zur optischen Achse angeordnet. Gleichzeitig unterdrücken die
Emissionsfilter das Licht außerhalb
des gewählten
Spektralbereiches
- • Dichroitische
Strahlteiler (mit deutlich schwächeren
Unterdrückungseigenschaften
ausserhalb ihres transmissiven Wirkungsbereiches) zur Vorselektion
von Wellenlängenbereichen,
ebenfalls, auch wechselbar, nicht senkrecht, typisch unter 45° zur optischen
Achse angeordnet
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Zum
Erreichen der in 2 nach dem Stand der Technik
dargestellten Flexibilität
sind zur Detektion von drei Spektralbereichen 5 Filterräder und
bei maximal variabler Detektion auch 5 Antriebe zum Wechseln der
Filter erforderlich.
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Daneben
gibt es einen hohen Platzbedarf für die benötigten Elemente.
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Dieser
hohe Aufwand soll durch die Erfindung reduziert werden.
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Erfindungsgemäss wurde
erkannt, dass vorteilhaft beschichtete Emissionsfilter praktisch
keine Absorption aufweisen. Diese Filter reflektieren alles Licht
mit Wellenlängen
außerhalb
des selektierten Spektralbereiches. Es scheint daher möglich, dieses reflektierte
Licht für
weitere spektrale Kanäle
zu nutzen Damit das reflektierte Licht vom einfallenden Licht ohne
weitere Filter getrennt werden kann, werden die Emissionsfilter
leicht aus dem senkrechten Einfall heraus gekippt. Ein kleiner Winkel
(<< 20°) wurde dabei
als besonders vorteilhaft erkannt, weil die spektralen Eigenschaften
typischer Emissionsfilter (hohe Unterdrückung, steile Bandkanten) sich
für senkrechten
Einfall und kleine vom senkrechten Einfall abweichende Winkel sich
besonders gut realisieren lassen.
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Weiterhin
erfolgt mit den Filtern eine Transmission des nicht reflektierten
Strahlanteils mit hoher Unterdrückung
der nicht erwünschten
Strahlung (vorteilhaft grösser
10-3) in diesem Bereich.
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Durch
diese Anordnung ergibt sich vorteilhaft die Möglichkeit einer einfacheren,
kompakteren und kostenreduzierten „Kaskadierung" der Detektionskanäle in einer
oder mehreren Ebenen.
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Die
Erfindung wird nachstehend anhand der 4, 5 und 6 näher beschrieben.
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Es
zeigen:
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4:
Erfindungsgemäss
angeordnete Emissionsfilter NEF 1-3, Detektoren D1-D3, Strahlfalle
S
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5:
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Die
NEF 1-3 jeweils auf Filterrädern
zur Auswechslung
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6:
Zusätzliche
schaltbare Filter F1-3 im Strahlengang von 4.
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Erfindungsgemäss sind
die Emissionsfilter so ausgebildet, dass sie einen definierten Teil
der Lichtstrahlung transmittieren und den Rest nahezu vollständig reflektieren.
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Zu
diesem Zweck sind sie in einem Winkel ungleich 90 Grad im Strahlengang
angeordnet, der einen Einfallswinkel auf dem Filter von ungleich
null Grad realisiert
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Es
erfolgt also eine Gestaltung der Emissionsfilter so, dass reflektiertes
Spektrum noch genutzt werden kann:
- – Reflektion
des noch gewünschten
Restspektrums
- – Nicht
gewünschtes
Restspektrum kann absorbiert werden
- – Einfallswinkel
abweichend von 0°,
aber noch klein (typischerweise 10°, auf jeden Fall deutlich kleiner
45°)
- – kleiner
Einfallswinkel garantiert nahezu gleiche Eigenschaften für s- und
p-polarisiertes
Licht sowie hocheffiziente Unterdrückung der nicht gewünschten
Spektralbereiche in Transmission.
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In
einem weiteren Schritt erfolgt ein Nachschalten eines zweiten vorzugsweise
schaltbaren Emissionsfilters vor dem Detektor mit folgenden Vorteilen:
- – Erhöhung der
Flexibilität,
mit dem Filter kann Spektralbereich weiter eingeschränkt werden
- – Zur
einseitigen Einengung des Spektrums reicht ein zusätzlicher
Kurz- bzw. Langpaß,
das ergibt zusammen mit dem vorgeschalteten Filter ein Bandpaß und ist
kostengünstiger
als zwei schaltbare Bandpässe
- – Das
reflektiertes Licht vom nachgeschalteten Filter kann ebenfalls genutzt
werden.
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Der
ungenutzte Teil des Spektrums kann auch in eine Strahlfalle S geleitet
werden. Eine Detektion des Lichts mit einem weiteren Detektor z.B. für Kontrollzwecke
ist ebenfalls denkbar.
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4 zeigt
einen einfachen Aufbau ohne nachgeschaltete Filter: Die Filter können auch
wechselbar geschaltet werden:
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5 zeigt
feste Filter zur Hauptselektion, zusätzlich schaltbare Filter, vorzugsweise
Lang- und Kurzpässe, zur
Einengung der Spektren der festen Filter:
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6 zeigt
eine Anordnung mit im Strahlengang angeordneten „üblichen„ Emissionsfilterrädern NEF
1-3.
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Beispielhaft
wurden hier immer Anordnungen mit 3 Kanälen gezeigt, es können aber
auch nur zwei oder beliebig viele Kanäle sein.