WO2010102767A1 - Mikroskop, insbesondere laser scanning mikroskop - Google Patents

Mikroskop, insbesondere laser scanning mikroskop Download PDF

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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters

Definitions

  • a laser scanning microscope In a laser scanning microscope according to the prior art (FIG. 1), light from the light sources (laser AD) passes through a beam splitter (MDB), the scanner, the scan optics (scan lens), the tube lens (tubelens) and the objective lens. punctiform on the sample (Specimen).
  • MDB beam splitter
  • the scanner In the sample, for example, fluorescent light is excited, which is collected by the lens and in turn reaches the beam splitter.
  • the beam splitter is designed so that it transmits the fluorescent light due to the spectral properties that are changed with respect to the excitation wavelength, so that the detection light is focused with pinhole optics by confocal diaphragms (PH 1-4) and subsequently onto the detector (PMT 1). 4).
  • an emission filter (EF 1-4) for suppressing the excitation light is provided in a fluorescence microscope.
  • the splitting into the individual detection channels takes place by means of secondary color splitter (DBS1-4).
  • DBS1-4 secondary color splitter
  • various emission filters or secondary color splitters which are located, for example, on a wheel, are pivoted in according to the prior art.
  • the illumination spot is scanned over the sample.
  • the sample signals are combined in a computer to form an image.
  • DE19835070A1 describes a pure combination of progressive filters which each set only one wavelength or one band. In DE 102004029733A1 two bandpass filters are needed.
  • the object of the invention is to enable a method and an arrangement which allows a flexible spectral beam separation of the detection light with high efficiency into different detection channels, so that the spectral properties of the
  • Detection channels can be adapted to the spectral properties of the fluorescence of the dye. In this case, no spectral components between adjacent bands should be lost.
  • the arrangement should be able to realize the imaging properties in comparison to the prior art at a lower price.
  • the invention includes an arrangement for flexible adjustment of detection channels for efficient detection in confocal imaging, in particular in a laser scanning microscope.
  • the arrangement will be explained by way of example with reference to a multi-channel detection.
  • the object according to the invention is realized by the use of a variable longpass filter.
  • a variable longpass filter This is shown schematically in Fig. 2a. It excels in its spectral properties in that the so-called cut-off wavelength changes along the z direction.
  • the cut-off wavelength refers to the wavelength at which the transmission is exactly 50% of the maximum transmission
  • Fig. 2b shows this wavelength as lambda_c
  • Fig. 2c shows an example of the cut-off wavelength from place z
  • the cut-off wavelength increases linearly.
  • Fig. 3 a) is an example of a detection arrangement for flexible separation of
  • it has a continuous increase in the cut-off wavelength from bottom to top.
  • It is designed as a high-pass filter, i. Light above the cut-off wavelength is transmitted and light is reflected below the cut-off wavelength.
  • Spectral components above the cut-off wavelength (1) thus pass through F in the direction of a roof edge prism (DK1).
  • Light below the cut-off wavelength (1) passes reflected in the direction of a second roof edge prism (DK2).
  • Both roof edge prisms are arranged along the x or the y axis, each perpendicular to the optical axis, movable.
  • the wavelength range influenced by DK1, DK2 can be set.
  • the detectors can be advantageously coupled coupled with.
  • the light from DK1 hits the long-pass filter at the location of the cut-off wavelength (3).
  • Light above the cut-off wavelength (3) and above the wavelength (1) is transmitted in the direction of the detector (b).
  • the light below the cut-off wavelength (3), also above the wavelength (1), is reflected by F towards the detector (c).
  • the light which has been reflected in the direction DK2 and lies below the cut-off wavelength 1 strikes, after passing through DK2, the long-pass filter at the location of the cut-off wavelength (2).
  • Light above the cut-off wavelength (2) and below the wavelength (1) is transmitted in the direction of the detector (a).
  • Light below the cut-off wavelength (2) passes (reflects) in the direction of a detector d.
  • FIG. 3b shows a low-pass filter F1 which has a continuous increase in the cut-off wavelength from the bottom to the top, in each case reflecting the wavelength above the cut-off wavelength and transmitting wavelengths below the cut-off wavelength.
  • the arrangement for illustration in Fig.3a is constructed in mirror image.
  • light of a wavelength below 1 is transmitted in the direction DK 3 and arrives at position 2 back to F1.
  • wavelength components less than (2) are transmitted in the direction of a detector f and portions greater than (2) and below (1) are reflected in the direction of a detector g.
  • Fig. 4 shows the example Fig. 3a), the spectral regions (shown as a box), which are detected by the individual detectors (A-D). Each one shows the cut-off wavelengths (1-3).
  • the position of the cut-off wavelength (1) can be changed.
  • the position of the cut-off wavelengths (3) or (2) is influenced.
  • any widths and positions of the bands (a-c) can be realized. It is particularly advantageous that in this case the bands (d), (a), (c) and (b) directly adjoin one another without a spectral gap. Thus, no spectral fluorescence components are lost in the spectral decomposition into the detection channels.
  • Fig. 5 shows the detection arrangement in a laser scanning microscope.
  • the detection light e.g., fluorescence
  • Sample light collected through the objective (O) passes through the tube lens (TL), the scanning optics (SO), the scanners (SC) in the direction of the main color splitter (MDB). This preferably transmits the sample light in the direction of Pinholeoptik (PO).
  • PO focuses the light into a confocal pinhole (PH).
  • Another optic (L) collimates the light to the pinhole. Thereafter, it enters the detection arrangement described with reference to FIG.

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Abstract

Mikroskop, insbesondere Laser Scannung Mikroskop, zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter Lichtstrahlung, mit einem Detektionsstrahlengang zur Detektion von Spektralanteilen der Lichtstrahlung in mehreren Detektionskanälen, wobei die Lichtstrahlung auf einen variablen Lang- oder Kurzpassfilter gelangt von dem reflektierte und / oder transmittierte Anteile mit einem Parallelversatz rückgespiegelt werden und diese nach mindestens einer solchen Rückreflektion auf einen Detektor gelangen.

Description

Titel: Mikroskop, insbesondere Laser Scanning Mikroskop
Stand der Technik
In einem Laser Scanning Mikroskop nach dem Stand der Technik (Fig. 1 ) gelangt Licht der Lichtquellen (Laser A-D) über einen Strahlteiler (MDB), die Scanner, die Scanoptik (Scanlens), die Tubuslinse (Tubelens) und das Objektiv (Objective) punktförmig auf die Probe (Specimen). In der Probe wird beispielsweise Fluoreszenzlicht angeregt, welches durch das Objektiv aufgesammelt wird und wiederum auf den Strahlteiler gelangt. Der Strahlteiler ist so ausgelegt, dass dieser das Fluoreszenzlicht aufgrund der gegenüber der Anregungswellenlänge veränderten Spektraleigenschaften transmittiert, so dass das Detektionslicht mit einer Pinholeoptik (Pinhole optics) durch konfokale Blenden (PH 1-4) fokussiert wird und im Anschluss auf Detektor (PMT 1-4) gelangt. Vor jedem Detektor ist in einem Fluoreszenzmikroskop ein Emissionsfilter (EF 1-4) zur Unterdrückung des Anregungslichtes vorgesehen. Die Aufspaltung in die einzelnen Detektionskanäle erfolgt mittels Nebenfarbteiler (DBS1-4). Zur Anpassung der spektralen Eigenschaften der Detektionskanäle werden nach dem Stand der Technik verschiedene Emissionsfilter oder Nebenfarbteiler, die sich beispielsweise auf einem Rad befinden, eingeschwenkt.
Mit Hilfe der Scanner wird der Beleuchtungsspot über die Probe gerastert. Die Probensignale werden in einem Rechner zu einem Bild zusammengesetzt.
Nähere Details zum Stand der Technik sind in „Handbook of biological confocal microscopy", Kapitel 9, Editor J. P. Pawley, Plenum Press, 1995 zu finden. Es sind verschiedene Anordnungen zur spektrallabhängigen Beeinflussung des Detektionslichtes bekannt, die alle Nachteile aufweisen:
In DE 19835068A1 kann jeweils über winkelabhängige Interferenzfilter nur eine Wellenlänge oder ein Band eingestellt werden.
DE19835070A1 beschreibt eine reine Kombination von Verlaufsfiltern die jeweils nur eine Wellenlänge oder ein Band einstellen. In DE 102004029733A1 werden zwei Bandpaßfilter benötigt.
Schon beim Einsatz von 3 Detektionskanälen wären 4 Filter und vier anzusteuernde und zu justierende Bewegungen erforderlich.
In DE102006034908 wird nur in zwei Strahlengänge aufgespalten, mit einer begrenzten Flexibilität, wenn der Aufwand gering gehalten werden soll.
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Anordnung zu ermöglichen, die eine flexible spektrale Strahltrennung des Detektionslichts mit hoher Effizienz in verschiedene Detektionskanäle erlaubt, so dass die Spektraleigenschaften der
Detektionskanäle an die Spektraleigenschaften der Fluoreszenz des Farbstoffes angepasst werden kann. Hierbei sollen keine Spektralanteile zwischen angrenzenden Bändern verloren gehen.
Durch Reduktion der mechanischen und optischen Komponenten soll die Anordnung die Abbildungseigenschaften im Vergleich zum Stand der Technik zu einem niedrigeren Preis realisierbar sein. Diese Aufgaben werden durch die im Folgenden erläuterten Anordnungen realisiert.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beinhaltet eine Anordnung zur flexiblen Einstellung von Detektionskanälen zur effizienten Detektion in konfokaler Bildgebung insbesondere in einem Laser Scanning Mikroskop. Die Anordnung wird beispielhaft anhand einer mehrkanaligen Detektion erläutert.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch den Einsatz eines variablen Langpassfilters realisiert. Dieser ist in Abb. 2a schematisch dargestellt. Er zeichnet sich in seinen Spektraleigenschaften dadurch aus, dass sich die so genannte cut-off Wellenlänge entlang der z Richtung verändert. Die cut-off Wellenlänge („Abschneidewellenlänge") bezeichnet hier die Wellenlänge, bei der die Transmission genau 50% der maximalen Transmission ist. In Abb. 2b ist diese Wellenlänge mit lambda_c bezeichnet. Abb. 2c zeigt beispielhaft eine Abhängigkeit der cut-off Wellenlänge vom Ort z. Hier steigt die cut-off Wellenlänge linear an. In Abb. 3 a) ist beispielhaft eine Detektionsanordnung zur flexiblen Trennung der
Fluoreszenzstrahlung in 3 Detektionskanäle gezeigt. Das Licht aus Richtung der
Probe gelangt auf den variablen Langpassfilter (F).
Er ist in einem Winkel zur optischen Achse angeordnet. Dadurch können reflektierte oder transmittierte Lichtanteile platzsparend zu Detektoren außerhalb der optischen
Achse gelangen.
Er weist hier beispielhaft einen kontinuierlichen Anstieg der cut-off Wellenlänge von unten nach oben auf.
Er ist als Hochpassfilter ausgebildet, d.h. Licht oberhalb der cut-off Wellenlänge wird transmittiert und Licht unterhalb der cut-off Wellenlänge reflektiert.
Spektralanteile oberhalb der cut-off Wellenlänge (1 ) treten also durch F hindurch in Richtung eines Dachkantenprismas (DK1 ). Licht unterhalb der cut-off Wellenlänge (1 ) gelangt reflektiert in Richtung eines zweiten Dachkantenprismas (DK2). Beide Dachkantenprismen sind entlang der x bzw. der y Achse, jeweils senkrecht zur optischen Achse, beweglich angeordnet. Hierdurch kann der von DK1 , DK2 beeinflusste Wellenlängenbereich eingestellt werden. Die Detektoren können vorteilhaft gekoppelt mit verschoben werden.
Durch die Dachkantenprismen wird das Licht räumlich parallel versetzt jeweils in sich zurückgespiegelt und gelangt wiederum auf den Langpassfilter (F). Das Licht aus Richtung DK1 trifft auf den Langpassfilter am Ort der cut-off Wellenlänge (3). Licht oberhalb der cut-off Wellenlänge (3)und oberhalb der Wellenlänge (1 ) wird in Richtung Detektor (b) transmittiert. Das Licht unterhalb der cut-off Wellenlänge (3), ebenfalls oberhalb der Wellenlänge (1 ) wird von F in Richtung Detektor (c) reflektiert. Das Licht, das in Richtung DK2 reflektiert wurde und unterhalb der cut-off Wellenlänge 1 liegt, trifft nach Durchlaufen von DK2 auf den Langpassfilter am Ort der cut-off Wellenlänge (2). Licht oberhalb der cut-off Wellenlänge (2) und unterhalb der Wellenlänge (1 ) wird in Richtung Detektor (a) transmittiert. Licht unterhalb der cut-off Wellenlänge (2) gelangt (reflektiert) in Richtung eines Detektors d.
Abbildung 3b zeigt einen Tiefpassfilter F1 der einen kontinuierlichen Anstieg der cut- off Wellenlänge von unten nach oben aufweist, wobei jeweils die Wellenlänge oberhalb der cut-off Wellenlänge reflektiert und Wellenlängen unterhalb der cut-off Wellenlänge transmittiert werden. Im Prinzip ist die Anordnung zur Darstellung in Fig.3a spiegelbildlich aufgebaut. Am Ort der cut-off Wellenlänge 1 wird Licht einer Wellenlänge unterhalb 1 in Richtung DK 3 transmittiert und gelangt an der Stelle 2 zurück auf F1. Dort werden Wellenlängenanteile kleiner (2) in Richtung eines Detektors f transmittiert und Anteile größer (2) und unterhalb (1 ) in Richtung eines Detektors g reflektiert.
Anteile oberhalb der Wellenlänge (1 ) werden an F1 reflektiert und gelangen über DK4 an die Stelle (3) von F1 , wo Anteile kleiner (3) aber größer (1 ) in Richtung Detektor e transmittiert werden und Anteile größer (3) in Richtung eines Detektors h reflektiert werden.
Abb. 4 zeigt am Beispiel Fig. 3a) die Spektralbereiche (dargestellt als Kasten), die von den einzelnen Detektoren (a-d) detektiert werden. Jeweils eingezeichnet sind die cut-off Wellenlängen (1-3). Durch Verschieben des Langpassfilters (F) entlang z in einem Winkel zur optischen Achse kann die Lage der cut-off Wellenlänge (1 ) verändert werden. Durch Verschieben der DK 1 bzw. 2 wird die Lage der cut-off Wellenlängen (3) bzw. (2) beeinflusst. Somit können beliebige Breiten und Lagen der Bänder (a-c) realisiert werden. Besonders vorteilhaft ist es, dass hierbei die Bänder (d), (a), (c) und (b) ohne spektrale Lücke direkt aneinandergrenzen. Somit gehen keine spektralen Fluoreszenzanteile bei der spektralen Zerlegung in die Detektionskanäle verloren.
Abb. 5 zeigt die Detektionsanordnung in einem Laser Scanning Mikroskop. Das Detektionslicht (z.B. Fluoreszenz) wird analog der in Abb. 1 beschriebenen Anordnung nach dem Stand der Technik in der Probe angeregt. Durch das Objektiv (O) gesammeltes Probenlicht gelangt über die Tubuslinse (TL), die Scanoptik (SO), die Scanner (SC) in Richtung des Hauptfarbteilers (MDB). Dieser transmittiert vorzugsweise das Probenlicht in Richtung der Pinholeoptik (PO). Durch PO wird das Licht in ein konfokales Pinhole (PH) fokussiert. Eine weitere Optik (L) kollimiert das Licht nach dem Pinhole. Danach gelangt es in die anhand Abb. 3 beschriebene Detektionsanordnung.
Die erfindungsgemäße Anordnung wurde beispielhaft anhand von 4 Detektionskanälen und unter Verwendung eines variablen Langpassfilters erläutert. Durch entsprechende Rückspiegelung mit weiteren Dachkantenprismen eines Detektionskanals können die Anzahl der Detektionskanäle erweitert werden. Zusätzlich kann nach Anpassung der DK (Verdrehung um 180°)statt dem Langpassfilter auch ein Kurzpassfilter verwendet werden (Fig. 3b).

Claims

Patentansprüche
1.
Mikroskop, insbesondere Laser Scannung Mikroskop, zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter Lichtstrahlung, mit einem Detektionsstrahlengang zur Detektion von Spektralanteilen der Lichtstrahlung in mehreren Detektionskanälen, dadurch gekennzeichnet, dass im Detektionsstrahlengang ein in seinem Verlauf bezüglich durch ihn reflektierter und transmittierter Wellenlängenanteile veränderlicher Langpaß- oder Kurzpaßfilter angeordnet ist, wobei mindestens ein Reflektor zur Erzeugung eines Parallelversatzes der reflektierten Strahlung und Rückreflektion in Richtung des Wellenlängenfilters im reflektierten oder transmittierten Wellenlängenanteil vorgesehen ist und den vom Wellenlängenfilter reflektierten oder transmittierten Wellenlängenanteilen nach mindestens einer Rückreflektion und einer weiteren Reflektion oder Transmission durch den Reflektor Detektoren zugeordnet sind.
2.
Mikroskop insbesondere Laser Scannung Mikroskop, zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter Lichtstrahlung, mit einem Detektionsstrahlengang zur Detektion von Spektralanteilen der Lichtstrahlung in mehreren Detektionskanälen, wobei die Lichtstrahlung auf einen variablen Lang- oder Kurzpassfilter gelangt von dem reflektierte und / oder transmittierte Anteile mit einem Parallelversatz rückgespiegelt werden und diese nach mindestens einer solchen Rückreflektion auf einen Detektor gelangen.
3.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dass der Langpaßoder Kurzpaßfilter ein variabler Kantenfilter ist, der entlang seiner Längenausdehnung eine unterschiedliche Aufteilung in transmittierte und reflektierte Wellenlängenanteile aufweist.
4.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Filter eine interferometrische Beschichtung aufweist.
5.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Filter entlang seines Verlaufs eine veränderliche (cut-off) Wellenlänge aufweist, die das Verhältnis von Wellenlängenanteilen, die reflektiert und Wellenlängenanteilen die transmittiert werden, bestimmt.
6.
Mikroskop nach Anspruch 5, wobei der Filter entlang der Richtung der veränderlichen (cut-off) Wellenlänge verschiebbar ist.
7.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Reflektor senkrecht zur Einfallsrichtung des Lichts verschiebbar ist.
8.
Mikroskop nach Anspruch 7, wobei dem Reflektor ein verschiebbarer Detektor zugeordnet ist.
9.
Mikroskop nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Reflektor ein Dachkantenprisma oder -Spiegel ist.
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