DE19521388A1 - Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen Substanz - Google Patents
Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen SubstanzInfo
- Publication number
- DE19521388A1 DE19521388A1 DE1995121388 DE19521388A DE19521388A1 DE 19521388 A1 DE19521388 A1 DE 19521388A1 DE 1995121388 DE1995121388 DE 1995121388 DE 19521388 A DE19521388 A DE 19521388A DE 19521388 A1 DE19521388 A1 DE 19521388A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- analyte
- antibody
- sample
- antigen
- determined
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz und ist
dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmenden Probe Analyt
oder ein Derivat des Analyten in einer bestimmten
Konzentration zugesetzt wird. Das verwendete Verfahren ist
bevorzugterweise ein immunologisches Testsystem.
Immunologische Testsysteme unterschiedlicher Art finden
weitgehende Verwendung in der klinischen Diagnostik für die
Detektion von Substanzen wie Drogen, Vitamine, Hormone,
Proteine, Metaboliten, Mikroorganismen oder andere
interessierende Substanzen in biologischen Proben.
Die Testsysteme beruhen auf Antigen-Antikörper-Reaktionen,
die nach entsprechender Inkubation mit dem Analyten
nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck muß wenigstens ein
Stoff, entweder das Antigen oder der Antikörper, mit einer
Signal erzeugenden Verbindung markiert sein.
Für die Einteilung der Testprinzipien existieren verschiedene
Kriterien. Nach der Anzahl der verschiedenen Reaktionspartner
je Antigenmolekül kann beispielsweise eine Einteilung in 1-
Seiten- oder in 2-Seiten-Bindungsassays (z. B. Sandwichassay)
erfolgen.
Generell ist jeder Assay als homogener oder als heterogener
Test möglich.
In einem homogenen Assay unterscheiden sich das emittierte
Signal des spezifisch gebundenen markierten Reaktanten von
jenem des freien markierten Reaktanten. Somit ist "frei" von
"gebunden" unterscheidbar.
In einem heterogenen Assay ist das Signal von gebundenem
Reaktanten von jenem in freier Form nicht unterscheidbar.
Auf Grundlage des immunologischen Reaktionsprinzips ist
weiters eine Unterteilung der heterogenen Assays in
kompetitive und nicht-kompetitive Techniken möglich.
Grundlage der kompetitiven Techniken ist die Konkurrenz von
unmarkierten und markierten Reaktanten um die Bindung an
einen immobilisierten Reaktanten.
Aufgrund des Kompetitionsprinzips wird um so weniger
markiertes Antigen bzw. markierter Antikörper gebunden, je
mehr Analyt in der Probe enthalten ist. Die gemessene
Aktivität des Immunkomplexes ist damit indirekt proportional
der Konzentration an zu bestimmender Substanz.
Bei einem nicht-kompetitiven Assay liegen immobilisierte und
markierte Reaktanten im Vergleich zur Konzentration des zu
bestimmenden Analyten im Überschuß vor. Unter diesen
Bedingungen ist es innerhalb bestimmter Grenzen möglich, alle
in der Probe vorhandenen Antigene bzw. Antikörper zu binden.
Die Assays sind in der Regel nach dem Sandwich Prinzip
aufgebaut.
In Abhängigkeit von der Reaktionsfolge wird zwischen
simultanen und sukzessiven Ein-Schritt- und Zwei-Schritt-
Testsystemen unterschieden.
Bei der Ein-Schritt-Technik werden die zu bestimmende
Substanz, immobilisierte und markierte Antikörper bzw.
Antigene gemeinsam inkubiert. Die Zugabe des markierten
Antikörpers kann auch zeitlich versetzt erfolgen. Ungebundene
Reaktanten werden von den gebundenen vor der Marker-Substrat-
Reaktion separiert (sogenannte "bound-free-Trennung" = BF-
Trennung).
Bei der Zwei-Schritt-Technik erfolgt dagegen eine solche
Trennung nach jedem Reaktionsschritt. Vor der Substrat
reaktion sind zwei Dosierschritte, zwei Inkubationsschritte
und zwei BF-Trennungen notwendig. Im Fall eines
Antigennachweises wird im ersten Inkubationsschritt der
Analyt aus der Probe an den immobilisierten Antikörper
gebunden. In der BF-Trennung werden dann unspezifische
Probenbestandteile entfernt. In einem zweiten
Inkubationsschritt erfolgt die Reaktion des markierten
Antikörpers mit dem gebundenen Analyten. In einer zweiten BF-
Trennung werden die ungebundenen, markierten Antikörper
entfernt.
Ein entscheidender Vorteil der Ein-Schritt-Technik ist vor
allem die Verkürzung der Testinkubationszeit und die
einfachere Handhabung der Testdurchführung. Auch ist in der
Regel eine geringere Probenverdünnung erforderlich.
Diese praktischen Vorteile von Ein-Schritt-Systemen werden
durch den sogenannten "High Dose Hook"-Effekt limitiert, das
Phänomen des biphasischen Kurvenverlaufs der Konzentrations-
Signal Kurve.
Bei steigender Antigenkonzentration erreicht der gebildete
Immunkomplex ein Bindungsmaximum. Eine weitere Erhöhung der
Analytkonzentration führt dann zu einer Invertierung der
Konzentrations-Signal-Kurve; die Steigung ist negativ. Die
Konsequenz dieser glockenförmigen, biphasischen Kurve ist,
daß die eindeutige Zuordnung eines Meßwertes zu einer
Analytkonzentration nicht mehr gegeben ist. Jedem Meßwert
können in Folge des Verlaufs der Konzentrations-Signal-Kurve
zwei Konzentrationswerte zugeordnet werden.
In der Literatur wird dieser Effekt häufig als entscheidender
Nachteil speziell der Ein-Schritt-Technik beschrieben (siehe
Fernando et al., 1992, J. Immunol. Methods, 151, 47). Die Test
auswertung wird durch die biphasische Natur der
Konzentrations-Signal-Kurve vor allem dann kritisch, wenn in
pathologischen Situationen der Analyt in extrem hohen
Konzentrationen vorkommt und der Meßbereich im ab- oder
ansteigenden Kurvenabschnitt für diese Proben nicht eindeutig
definiert ist. Die Folge können Störungen in der
Wiederfindung der Probe sein. Eine sorgfältige
Charakterisierung dieses "Störeffekts" und eine Angabe,
welche Analytkonzentration zum Phänomen des "High Dose Hook"-
Effekts führt, sind somit unbedingt notwendig.
Eine der Ursachen für den "High Dose Hook" Effekt liegt in
der limitierten Bindungskapazität des immobilisierten
Antikörpers bzw. Antigens. Eine zweite Ursache liegt in der
Konkurrenz des Festphasen- und des Konjugatantikörpers bzw.
-antigens während der simultanen Inkubation um die Bindung des
Analyten.
Während der simultanen Inkubation kann der Analyt drei
verschiedene Immunreaktionen eingehen:
- 1.) Bindung des Analyten an den Festphasenantikörper bzw. an
das Festphasenantigen unter Bildung eines binären
Immunkomplexes aus Antigen und Antikörper. Da einer der
Reaktionspartner immobilisiert ist, läuft diese Reaktion an
der Grenzfläche der flüssigen und festen Phase ab und ist
limitiert durch die immunologische Bindungskapazität der
Festphase. Dieser binäre Immunkomplex liefert in dieser Form
keinen Signalbeitrag.
|←Antikörper (immobilisiert) + Antigen
|←Antikörper-Antigen (immobilisiert)
bzw.
|←Antigen (immobilisiert) + Antikörper |←Antigen-Antikörper (immobilisiert) - 2.) Bindung des Analyten an den Konjugatantikörper bzw. an
das Konjugatantigen unter Bildung eines weiteren binären
Immunkomplexes. Diese Reaktion läuft in der flüssigen Phase
ab. Obwohl einer der beiden Reaktionspartner eine
signalgebende Funktion enthält, liefert auch dieser in der
flüssigen Phase vorliegende binäre Immunkomplex keinen
Signalbeitrag.
Antikörper (markiert) + Antigen Antikörper-Antigen (markiert)
bzw.
Antigen (markiert) + Antikörper Antigen-Antikörper (markiert) - 3.) Bildung eines für die Bestimmung der Analytkonzentration
relevanten immobilisierten und signalgebenden Immunkomplexes.
Dieser entsteht entweder aus den binären Immunkomplexen an
der Festphase durch Anlagerung des signalgebenden Antikörpers
bzw. Antigens oder durch Reaktion des binären Immunkomplexes
aus Analyt und signalgebenden Immunpartnern und dem
immobilisierten Antikörper bzw. Antigen. Nur der ternäre
Immunkomplex dieser Form liefert einen detektierbaren
Signalbeitrag.
|←Antikörper-Antigen (immobilisiert) + Antikörper (markiert)
|←Antikörper-Antigen-Antikörper (markiert und immobilisiert)
|←Antikörper (immobilisiert) + Antigen-Antikörper (markiert) |←Antikörper-Antigen-Antikörper (markiert und immobilisiert)
|←Antigen-Antikörper (immobilisiert) + Antigen (markiert) |←Antigen-Antikörper-Antigen (markiert und immobilisiert)
|←Antigen (immobilisiert) + Antikörper-Antigen (markiert) |←Antigen-Antikörper-Antigen (markiert und immobilisiert)
Die Lage der verschiedenen Gleichgewichte und die
Konzentration an ternärem Immunkomplex ist bei konstanter
Konzentration an immobilisierten und markierten Antikörpern
bzw. Antigenen von der Analytkonzentration abhängig.
Für den Fall, daß der zu bestimmende Analyt ein Antigen ist,
gilt somit folgendes:
Im Bereich des Antikörperüberschusses sowohl an
immobilisiertem als auch an markiertem Antikörper
(Antikörperüberschußbereich) werden binäre und ternäre
Immunkomplexe gebildet. Die Bildung der ternären Komplexe aus
Festphasenantikörper, Antigen und Antikörperkonjugat ist der
Analytkonzentration direkt proportional, bis das durch die
Bindekapazität der Festphase gegebene Maximum an ternären
Immunkomplexen erreicht ist. Mit der Bildung der ternären
Immunkomplexe steigt das Signal bis zu einem Maximum an. Eine
weitere Erhöhung der Antigenkonzentration verschiebt das
Gleichgewicht zu Ungunsten des ternären Immunkomplexes in
Richtung binärer Immunkomplexe in Form immobilisierter
Antikörper-Antigen- und markierter Antikörper-Antigen-
Komplexe ohne Signalbeitrag (Antigenüberschußbereich) . Dies
führt zu einer stetigen Abnahme des ternären signalgebenden
Immunkomplexes. Die Gleichgewichte nähern sich einem Minimumm
an ternären detektierbaren Immunkomplexen und einem Maximum
an nicht detektierbaren, binären Immunkomplexen und
schließlich auch an freiem Analyten. Die Folge davon ist,
daß sich das Meßsignal asymptotisch einem Minimum nähert.
Die Bereiche des Antikörper- und Antigenüberschusses werden
durch den Äquivalenzbereich getrennt. In diesem Zustand sind
die Bindungsstellen der Festphase mit ternären Immunkomplexen
maximal gesättigt. Folge davon ist, daß im Äquivalenzpunkt
das maximale Meßsignal erreicht wird.
Zur Umgehung bzw. Vermeidung des "High Dose Hook"-Effekts
wird in der Regel die Umstellung auf andere Testsysteme,
beispielsweise auf die Zwei-Schritt-Technik empfohlen, bei
der dieser Effekt i.a. nicht bzw. seltener beobachtet wurde.
Unter Beibehaltung der Ein-Schritt-Technik ist in begrenztem
Masse ein Einfluß auf die Lage des Äquivalenzpunktes der
Konzentrations-Signal-Kurve möglich. Durch eine sorgfältige
Auswahl der Antikörper bzw. Antigene in Bezug auf Affinität
und einer Optimierung der Festphasenbindung kann der "High
Dose Hook"-Effekt zu höheren Konzentrationen verschoben, aber
nicht vollständig unterdrückt werden. Der Aussagewert solcher
diagnostischer Tests bleibt damit jedoch fraglich.
Neuere Ansätze zur Reduktion bzw. Verschiebung des "Hook"-
Effekts sind im Stand der Technik beispielsweise von Hoffman
K. L. et al., "Elimination of "Hook Effect" in two site
immunoradiometric assays by kinetic rate analysis",
Clin. Chem. 30/9, 1499-1501, 1984 beschrieben und werden als
sogenanntes "kinetisches Hook-screening" bezeichnet. Bei
diesem Verfahren werden mehrere Proben gleichzeitig mit
markiertem und gebundenem Antikörper inkubiert, und die
Reaktionsgeschwindigkeit für alle Proben wird gleichzeitig
bestimmt. Bei Proben mit Hook-Effekt sinkt die
Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmender Inkubationszeit
signifikant; aufgrund der schnelleren Bindung bei Proben ohne
Hook-Effekt ist damit eine Unterscheidung möglich. Das
Verfahren ist jedoch apparativ relativ aufwendig und
schwierig zu standardisieren.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Vorteile der
Zwei-Schritt-Technik in Bezug auf die Eindeutigkeit der
Meßergebnisse mit den Vorteilen der simultanen Inkubation
der Ein-Schritt-Technik sowie einer einfachen Handhabung zu
verbinden.
Dies wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß bei dem
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge eines
Analyten in einer Probe, dieser Probe ein Reagens mit
definierter Analyt-Konzentration zugesetzt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß der zu bestimmenden Probe Analyt oder ein Derivat des
Analyten in mindestens einer solchen Menge zugesetzt wird,
daß der Äquivalenzpunkt erreicht und damit ein maximales
Signal in der Konzentrations-Signal-Kurve erzielt wird.
Durch diese Maßnahme wird der ansteigende Teil der Hook-
Kurve sozusagen ausgeblendet und man mißt, falls der zu
bestimmende Analyt ein Antigen ist, im
Antigenüberschußbereich, bzw. falls der zu bestimmende
Analyt ein Antikörper ist, im Antikörperüberschußbereich.
Auf diese Weise ist die Eindeutigkeit des Meßsignals immer
sichergestellt.
Das erfindungsgemäße Testsystem bietet damit die Möglichkeit
einen Test für hohe Analytkonzentrationen in der Probe
gezielt unempfindlicher zu machen, d. h. die untere
Nachweisgrenze (absolute Empfindlichkeit) wird erhöht,
vorzugsweise um den Faktor 10-50, und die Probenverdünnung in
gleichem Masse reduziert.
Die Voraussetzung für die exakte Einstellung des jeweiligen
Analyten im Probenpuffer für ein gegebenes immunologisches
Testsystem ist die einmalige Charakterisierung der "High Dose
Hook"-Kurve durch Titration mit dem Analyten. Die
Konzentration des Analyten im Probenpuffer wird mit Hilfe
dieser Titrationskurve so gewählt, daß bei Einsatz des
Analyt- oder Analyt-Derivat-enthaltenden Reagens der
Äquivalenzpunkt und damit ein maximales Signal im Testsystem
erreicht wird.
Beispielsweise wird im Fall des Nachweises von HSA in
extrahierten Stuhlproben der Probe, den Kalibratoren und den
Kontrollen HSA (= Analyt) in einer Konzentration zwischen 0,3
bis 1 µg/ml, vorzugsweise 0,4 µg HSA/ml zugesetzt.
Lp(a) in Seren wird beispielsweise durch Zusatz von Lp(a)-
haltigem Reagens, enthaltend Lp(a) in einer Konzentration
zwischen 4 und 40 µg/ml, vorzugsweise 7 µg/ml, bestimmt.
Das Verfahren zur Bestimmung eines Analyten ist bevorzugter
weise ein immunologisches Testsystem und kann als homogener
oder als heterogener Assay durchgeführt werden.
Bei der zu bestimmenden Probe handelt es sich vorzugsweise um
ein biologisches Material oder um eine Chemikalie. Die Probe
liegt in der flüssigen Phase vor oder muß gegebenenfalls,
beispielsweise durch eine Extraktion, in die flüssige Phase
übergeführt werden. Das biologische Material kann
beispielsweise Blut, Plasma, eine Plasmafraktion, Harn,
Stuhl, Liquor oder eine andere Körperflüssigkeit, Gewebe-
oder Organextrakt oder eine sonstige analythaltige Lösung
sein.
Der zu bestimmende Analyt ist beispielsweise ein Protein,
Peptid, Polysaccharid, eine Nukleinsäure, eine lipidhaltige
Verbindung, ein rekombinantes Material oder ein anderes
Molekül mit antigenen Eigenschaften. Vorzugsweise wird
Albumin oder Lipoprotein(a) bestimmt.
Für die Bestimmung eines Analyten in einer Probe kann zur
Einstellung eines ternären Komplexes der Analyt selbst, aber
auch ein Derivat des Analyten verwendet werden. Das Derivat
des Analyten ist besonders ein immunreaktives Derivat,
beispielsweise handelt es sich bei dem Derivat um ein Dimeres
oder Polymeres eines oder mehrerer Epitope des Analyten.
Im speziellen kann als Derivat ein homologes oder heterologes
Epitopdimer verwendet werden. Dieses Epitopdimer wird von den
im Testsystem eingesetzten, vorzugsweise monospezifischen
Antikörpern erkannt, und wenigstens ein Epitop des Dimeren
weist eine Homologie zum Analyten auf.
Ist der Analyt ein Antigen, umfassend wenigstens zwei
Epitope, die im folgenden mit Epitop 1 und Epitop 2
bezeichnet werden, so umfaßt das homologe Epitopdimer zur
Einstellung des ternären Komplexes ebenfalls Epitop 1 und 2.
Die Epitope sind gegebenenfalls über einen Linker gebunden.
Epitop 1 und 2 können auch identisch sein. Der immobilisierte
Antikörper ist dann gegen das eine Epitop gerichtet und der
markierte Antikörper gegen das andere Epitop.
Bei heterologen Epitopdimeren ist nur ein Epitop zum Analyten
homolog. Der immobilisierte Antikörper ist dann ebenfalls
gegen dieses Epitop gerichtet, während der markierte
Antikörper ein anderes Epitop erkennt, welches keine
Homologie zum Epitop des Analyten aufweist, sondern der
zweiten Komponente des Epitopdimeren entspricht.
|←Anti-Epitop-1-Antikörper (immobilisiert) + Epitop-1-Epitop 2 +
Anti-Epitop-2-Antikörper (markiert)
|←Anti-Epitop-1-Antikörper (immobilisiert) - Epitop-1-Epitop-2- Antikörper (immobilisiert)
|←Anti-Epitop-1-Antikörper (immobilisiert) - Epitop-1-Epitop-2- Antikörper (immobilisiert)
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Haptene
bestimmbar, welche üblicherweise nur in einem kompetitiven
Testsystem bestimmbar sind. Voraussetzung für deren
Bestimmung ist die Einstellung des maximalen Meßsignals über
einen ternären Komplex unter Verwendung entsprechender
Analyt-Derivate, beispielsweise unter Verwendung von
Dihaptenen. Als Dihaptene kommen vorzugsweise homologe oder
heterologe Dihaptene infrage. Homologe Dihaptene bestehen aus
zwei miteinander, vorzugsweise über einen Linker verbundene
gleichartige Haptene, die in ihrer Struktur dem zu
bestimmenden Hapten in der Probe gleichen. So kann
beispielsweise zur Bestimmung von L-Thyroxin ein L-Thyroxin-
Linker-L-Thyroxin-Dihapten verwendet werden.
Heterologe Dihaptene bestehen dagegen aus zwei
unterschiedlichen Haptenen, von denen nur eine Haptenfunktion
jener der Probe entspricht. Zur Bestimmung von L-Thyroxin
kann beispielsweise ein L-Thyroxin-Linker-Tyramin-Dihapten
verwendet werden.
Um homologe Komplexbindungen in einem Ein-Schritt-Testsystem
zu unterbinden, werden bevorzugterweise heterologe Dihaptene
verwendet. Der immobilisierte Antikörper ist dann gegen die
Haptenfunktion gerichtet, und der Konjugatantikörper (der
markierte Antikörper) gegen die vom Hapten unterschiedliche
Struktur.
|←Anti-Hapten-1-Antikörper (immobilisiert) + Hapten-1-Hapten 2 +
Anti-Hapten-2-Antikörper (markiert)
|←Anti-Hapten-1-Antikörper (immobilisiert) - Hapten-1-Hapten-2- Antikörper (markiert)
|←Anti-Hapten-1-Antikörper (immobilisiert) - Hapten-1-Hapten-2- Antikörper (markiert)
Wie bereits an anderer Stelle beschrieben, wird auch in
diesem Fall durch Zugabe von Probenhapten die Bildung des
ternären Komplexes gestört und als Folge davon eine
Signalabnahme gemessen.
Geeignete Chemikalien, die mittels des erfindungsgemäßen
Verfahrens bestimmt werden können, sind beispielsweise
Phenobarbital, Digitoxin, Amphetamine, Opiate, Phencyclidine
und andere Drogen, Medikamente (z. B. Theophyllin, Nifedipin,
Propanolol, Beta-Blocker) und Antibiotika. Generell sind alle
Chemikalien bestimmbar, die haptene oder antigene
Eigenschaften aufweisen.
Ist der Analyt ein zu bestimmendes Antigen, sind mindestens
zwei Antikörper erforderlich. Ein Antikörper ist an der Fest
phase immobilisiert, der andere Antikörper ist mit einem
geeigneten Marker versehen. Die Antikörper gegen den zu
bestimmenden Analyten können polyklonal oder monoklonal sein,
sie können identisch oder unterschiedlich sein.
Zur Bestimmung von Antikörpern wird ein entsprechendes
Antigen an der Festphase immobilisiert und ein markiertes
Antigen verwendet, so beispielsweise ein Tetanus-
Toxoidkonjugat zur Bestimmung von Anti-Tetanus-Antikörpern.
An Stelle des immobilisierten Antigens kann zur Bestimmung
von Antikörpern auch ein anti-Antikörper immobilisiert
werden; an Stelle des markierten Antigens kann auch ein
markierter capture-Antikörper verwendet werden.
Die immunologischen Reaktionen können prinzipiell simultan
ablaufen. Die Gleichgewichtslage der Immunkomplexe kann aber
durch eine sukzessive Inkubation ohne BF-Trennung zugunsten
der immobilisierten binären und ternären Komplexe beeinflußt
werden.
Antikörper, Antigene oder Rezeptorsysteme können direkt oder
indirekt an einen festen Träger fixiert sein, beispielsweise
durch Adsorption, direkte kovalente Kopplung oder indirekte
Kopplung über ein weiteres bindendes Agens; im Falle der
Kopplung eines Antikörpers an die Festphase kann dies bei
spielsweise ein anti-Antikörper sein. Zur Bestimmung von
Liganden wird ein entsprechender Rezeptor an der Festphase
immobilisiert und ein markierter Rezeptor verwendet. Ein
Beispiel für ein Liganden-Rezeptor-Paar ist der tPA-PAI-
Komplex.
Die Art der Fixierung hängt insbesondere vom Material der
festen Phase ab. An Materialien wie beispielsweise
Nitrocellulose, Polystyrol oder Materialien mit ähnlichen
chemischen Eigenschaften, findet vorwiegend Adsorption statt.
Andere Materialien, wie beispielsweise Latex, Nylon und
ähnliche, enthalten Gruppen, die eine kovalente Bindung
ermöglichen.
Der feste Träger kann in unterschiedlichen Formen vorliegen,
beispielsweise als Mikrotiterplatten oder als Streifen, als
magnetisches Teilchen, in Kugelform oder in Form einer
Vorrichtung mit schichtförmigem Aufbau.
Zur Detektion des gebildeten Komplexes wird ein geeigneter
Marker verwendet, der an das spezifisch bindende Agens
gekoppelt ist. Als Marker sind unterschiedliche Stoffe mit
detektierbaren Eigenschaften verwendbar, beispielsweise
chromogene, katalytisch wirkende, isotopische, enzymatische,
lumineszierende oder fluoreszierende Stoffe. Auch neuere
Markersysteme, wie beispielsweise β-Lactamase,
Pyrophosphatase, Luciferase, Photoproteine, Pyridopyridazine,
Europium Cryptate oder Metall-Carbonyl-Komplexe sind möglich.
Der Nachweis eines Analyten in einer Probe erfolgt
vorzugsweise mittels eines Ein-Schritt-Enzym-Immunassays in
Form eines 2-Seiten-Bindungsassays (Sandwich-Assays).
Die Erfindung stellt auch ein Set zur Durchführung des Ver
fahrens zur Verfügung. Dieses Set umfaßt ein Immunreagens
oder ein geeignetes Rezeptorsystem, den Analyten, ein Derivat
des Analyten bzw. einen Liganden und ein für die Detektion
geeignetes Mittel. Die Art des Immunreagens richtet sich nach
dem zu bestimmenden Analyten: Ist der Analyt ein Antigen, so
umfaßt das Immunreagens entsprechende Anti-Analyt-
Antikörper, ist der Analyt hingegen ein Antikörper, so
umfaßt das Immunreagens entsprechende Antigene. Der Analyt,
das Derivat des Analyten bzw. der Ligand können entsprechend
vorverdünnt sein, beispielsweise in einem Verhältnis von
1 : 20.
Ein geeignetes Liganden-Rezeptor-Paar ist beispielsweise ein
Enzym-Inibitor-Komplex, wie z. B. der tPA-PAI-Komplex.
Die Fig. 1 und 2 dienen der näheren Erläuterung der
Erfindung
Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines ELISAs in Abhängigkeit von
der Humanalbuminkonzentration zur Bestimmung des
Äquivalenzpunktes (Beispiel 1d).
Fig. 2 gibt einen Funktionstest zur Bestimmung von
Humanalbumin wieder (Beispiel 1e).
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung noch näher
erläutern, ohne diese jedoch darauf zu beschränken.
4 mg eines Lyophilisats polyklonaler Kaninchen-Antikörper
gegen Humanalbumin (Fa. Dako) wurden in 1 ml bidest. Wasser
gelöst. 1 ml dieser Lösung wurde mit 1000 ml Puffer,
bestehend aus 0,50 mol/l Tris und mit 1 mol/l Salzsäure auf
pH 7,4 eingestellt, verdünnt und 30 Min. bei Raumtemperatur
(20-26°C) gerührt.
In jede Testvertiefung einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol
(Hersteller Greiser) wurden 0,2 ml der verdünnten
Antikörperlösung gefüllt und über Nacht (20 bis 24 h) bei
Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Testvertiefungen
vollständig entleert.
Für die Blockierung gegebenenfalls unbeschichteter
Polystyroloberflächen wurden die Testvertiefungen für 30 Min.
bei Raumtemperatur mit 0,220 ml einer wäßrigen
Nachbeschichtungslösung mit einer 1%igen Gelatinelösung
behandelt. Danach wurden die Testvertiefungen wieder
vollständig entleert und die nachstehenden Funktionstests
durchgeführt.
Zu 20 mg Meerrettich-Peroxidase in 3,5 ml 1 mmol/l
Natriumacetatpuffer, pH 4,5, wurden 11,5 mg Natriumperjodat
gegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei
Raumtemperatur wurde der Reaktionsansatz über Nacht bei 4°C
gegen 1 mmol/l Natriumacetatpuffer, pH 4,5, dialysiert.
20 mg Anti-Humanalbumin (Firma Dako) wurden in 2 ml 0,1 mol/l
Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5, gelöst.
Zur Konjugation wurde die Anti-Humanalbumin-Lösung unter
Rühren mit der aktivierten Meerrettich-Peroxidase-Lösung
versetzt und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Reinigung des Anti-Humanalbumin-Meerrettich-Peroxidase-
Kunjugats erfolgte über eine mit 0,01 mol/l Tris/HCl-Puffer,
pH 7,4, äquilibrierten Superose 12 (PHARMACIA). Die Konjugat
enthaltenden Fraktionen wurden gepoolt und über ein
Filtersystem (YM30 AMICON) auf 1 mg/ml konzentriert.
Für die Herstellung der Kalibratoren wurde ein
Humanalbuminstandard (Immuno AG) in den Konzentrationen 0,
10, 20, 30, 40, 50 und 60 µg/ml in einem 0,2 mol/l Tris/HCl-
Puffer, pH 7,4, gelöst.
Die nach Schritt a) mit Anti-Humanalbumin beschichtete
Mikrotiterplatte wurde in einem Ein-Schritt-ELISA eingesetzt.
Dabei wurde eine konstante Menge Anti-Humanalbumin
konjugierte Meerrettich-Peroxidase so eingesetzt, daß das
maximale Signal die Absorption von 2,0 nicht überschreitet.
Zur Ermittlung des Äquivalenzpunktes wurde dem Testansatz
Humanalbumin (Immuno AG) im Konzentrationsbereich zwischen 0
und 5 µg/ml zugesetzt. Hierbei ergaben sich die in Fig. 1
dargestellten Meßwerte. Der Äquivalenzpunkt liegt demnach
bei 0,4 µg Humanserumalbumin pro ml.
Für die Verdünnung der im Test verwendeten Kalibratoren,
Kontrollen und Proben wurde ein Reagans, bestehend aus 0,050
mol/l Tris, pH 7,4, eingestellt mit 1 mol/l Salzsäure und
einem Zusatz von 0,4 µg Humanalbumin pro ml verwendet.
Die nach a) hergestellten Anti-Humanalbumin-beschichteten
Mikrotiterplatten wurden für die Funktionsbestimmung
eingesetzt. In den Testvertiefungen wurde 0,1 ml Anti-
Humanalbumin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (hergestellt
nach b)) vorgelegt. Jeweils ein Teil der Humanalbumin-
Kalibratoren (hergestellt nach c)) wurde mit 20 Teilen
Humanalbumin-haltigem Reagens (hergestellt nach d)) verdünnt
und 0,1 ml dieser Lösung in die Testvertiefungen pipettiert.
Nach einer Reaktionszeit von 60 Minuten bei Raumtemperatur
wurde der Reaktionsansatz abgesaugt und die Testvertiefungen
mit Waschpuffer dreimal gewaschen. Die Meerrettich-
Peroxidase-Aktivität des an die Mikrotiterplatte gebundenen
Antikörper-Antigen-Antikörper-Enzym-Komplexes wurde durch
Zugabe von Wasserstoffperoxid und Tetramethylbenzidin
bestimmt. Die Enzymreaktion wurde nach 30 Min. durch Zugabe
von 2 mol/l Schwefelsäure gestoppt und das Meßsignal bei 450
nm gemessen. Hierbei ergab sich die in Fig. 2 dargestellte
Bezugskurve.
"Okkultes", also makroskopisch nicht sichtbares Blut im Stuhl
ist u. a. ein Indiz für Blutungsquellen im
Gastrointestinaltrakt. Neben vergleichsweise harmlosen
Erkrankungen, wie Entzündungen des Dickdarms, Entzündungen
der Magenschleimhaut oder Darmpolypen, kann ein kolorektales
Karzinom der Grund für die okkulte Blutung sein. Da die
Heilungschancen bei frühzeitig erkanntem kolorektalen
Karzinom sehr gut sind, ist ein zuverlässiger Okkultblut-
Nachweis erforderlich. Das im Blut enthaltene Hämoglobin
und/oder Albumin wird im allgemeinen auf chemische oder
immunologische Weise nachgewiesen. Da Albumin eine höhere
Stabilität im Stuhl aufweist als Hämoglobin, ist gerade der
Nachweis von Albumin spezifischer und weist eine höhere
Sensitivität auf, als etwa ein Nachweis, der auf der
Pseudoperoxidase-Aktivität des Hämoglobins beruht.
Stuhlproben wurden mit Spezialröhrchen entnommen, in
Extraktionspuffer, bestehend aus 0,2M Tris/HCl, pH 7,4, mit
0,005% Merthiolat aufgenommen (1 ml Stuhlprobe in 2 ml
Puffer) und suspendiert.
Diese Suspension wurde anschließend 10 Minuten in einer
Laborzentrifuge bei 4000 g abzentrifugiert und der Überstand
einer zweiten Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei
12000 g unterworfen. Der Überstand aus dieser zweiten
Zentrifugation wurde für die ELISA-Messung verwendet. Diese
Messung erfolgte innerhalb von 2 Stunden nach Herstellung des
Extraktes.
Die nach Beispiel 1 hergestellten Testkomponenten wurden vor
Testbeginn alle auf Raumtemperatur gebracht. Probe,
Kontrollen und Kalibratoren wurden mit dem analythaltigen
Reagens 1+20 verdünnt.
100 µl Konjugatlösung wurden in die mit anti-humanem Albumin
beschichteten Testvertiefungen vorpipettiert und jeweils
100 µl verdünnte Kalibratoren, verdünnte Kontrollen und
verdünnte extrahierte Stuhlproben zügig dazupipettiert. Die
Teststreifen wurden mit Folie abgedeckt und die Inkubation
der Komponenten erfolgte bei Raumtemperatur für 60 Minuten.
Während der Inkubation wird humanes Albumin aus den
extrahierten Stuhlproben, Kalibratoren und Kontrollen an die
Festphase gebunden und gleichzeitig durch das anti-human-
Albumin-POD-Konjugat markiert. Unspezifische
Probenbestandteile werden durch dreimaliges Waschen mit je
250 µl detergenshaltigem Tris/HCl Puffer, pH 7,4, entfernt. Im
zweiten Inkubationsschritt erfolgt die Substratreaktion.
Hierfür wurden 200 µl Substratlösung in die Testvertiefungen
pipettiert, diese wiederum mit Folie abgedeckt und für 30
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
In der Substratreaktion oxidiert die Peroxidase des Konjugats
das Chromogen mit dem Substrat H202 zu einer bleugefärbten
Substanz. Durch Zupipettieren von 50 µl Stopplösung (1,9
mol/l Schwefelsäure) in die Testvertiefungen wird diese
Reaktion gestoppt und ein Farbumschlag nach gelb erreicht.
Bei einer Wellenlänge von 450 nm wird die optische Dichte in
einem ELISA-Reader gemessen. Die Farbintensität der
Substratreaktion ist der Albumin-Konzentration in der Probe
indirekt proportional. Über eine Bezugskurve wird die
Albumin-Konzentration in der Probe quantitativ bestimmt.
Die Verdünnung der Kalibratoren, Kontrollen und extrahierten
Stuhlproben erfolgt mit einem Reagans, welches keinen
Analyten enthält, in einem Verhältnis von 1+250. Alle anderen
Reaktionsschritte erfolgen wie in dem erfindungsgemäßen
Test. Bei der Auswertung ist zu beachten, daß die
Farbintensität der Substratreaktion der Albumin-Konzentration
in der Probe direkt proportional ist (Sevier et al,
Clin. Chem. 27, 1797, 1981).
Die folgende Tabelle faßt alle Kenndaten und Vorteile des
erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zum
konventionellen Verfahren am Beispiel der Bestimmung von
Albumin in extrahierten Stuhlproben zusammen:
Das beschriebenen Verfahren erhöht im Vergleich zum
konventionellen Verfahren die Präzision der Bestimmung eines
Analyten. Die Präzisionsanalyse zeigt bei der Messung des
Analyten mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens eine
Standardabweichung in der Serie von 1,5 µg HSA/ml und einen
Variationskoeffizienten von VK = 3,3% mit n = 20. Bei
Einsatz des konventionellen Verfahrens und Messung des
Analyten im aufsteigenden Abschnitt der Kurve beträgt die
Standardabweichung in der Serie 2,5 µg HSA/ml und man erhält
einen Variationskoeffizienten von VK = 8,2% mit n = 20.
Der absolute Meßbereich wird durch das erfindungsgemäße
Verfahren zu höheren Konzentrationen verschoben und
expandiert.
Die Steigung der Kurve ist im aufsteigenden Abschnitt größer
als im absteigenden Abschnitt. Bei vergleichbarer
Analytkonzentration ist somit bei Vorliegen zweier Meßwerte
die Differenz der optischen Dichtewerte im absteigenden Teil
geringer. Die Konsequenz ist, daß die Störempfindlichkeit
durch HSA, das von anderen Quellen als von der Probe stammt,
(Crosskontamination) des Testsystems durch Kontamination im
absteigenden Abschnitt der Kurve herabgesetzt wird.
Claims (15)
1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge
eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet,
daß der zu bestimmenden Probe Analyt oder ein Derivat
des Analyten in mindestens einer solchen Konzentration
zugesetzt wird, daß ein maximales Signal in der
Konzentrations-Signal-Kurve erreicht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Bestimmung unter Verwendung eines immunologischen
Testsystems durchgeführt wird, wobei eine der
Testsubstanzen markiert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um ein homogenes oder heterogenes Testsystem
handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
zur Detektion des Signals isotopische, nicht
isotopische, enzymatische, lumineszierende oder
fluoreszierende Marker verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
poly- und/oder monoklonale Antikörper gegen den zu
bestimmenden Analyten verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
bei Verwendung von mindestens zwei Antikörpern sich
diese voneinander unterscheiden können, aber gegen
denselben Analyten gerichtet sind.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die immunologischen Reaktionen simultan oder sukzessiv
ablaufen.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
für den zu bestimmenden Liganden ein geeignetes
Rezeptorsystem verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der zu bestimmenden Probe um ein
biologisches Material handelt, das in flüssiger Phase
vorliegt oder durch ein entsprechendes Verfahren in eine
flüssige Phase gebracht wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei der zu bestimmenden Probe um eine Chemikalie
handelt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der zu bestimmende Analyt Albumin oder Lipoprotein (a)
ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der zu bestimmende Analyt ein Hapten ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Derivat des Analyten ein Dimeres oder Polymeres
eines oder mehrerer Epitope des Analyten ist.
14. Set zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1
umfassend
- a) ein für den Analyten geeignetes Immunreagens oder einen für den Analyten geeigneten Rezeptor,
- b) einen Analyten oder ein Derivat des Analyten in einer für die Einstellung des Äquivalenzpunktes geeigneten Menge, und
- c) ein für die Detektion des Komplexes aus Analyt- Immunreagens oder Analyt-Rezeptor geeigneten Mittel.
15. Set nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das
Immunreagens ein monoklonaler oder polyklonaler Anti-
Analyt-Antikörper oder ein Antigen ist.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995121388 DE19521388C2 (de) | 1995-06-13 | 1995-06-13 | Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen Substanz |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995121388 DE19521388C2 (de) | 1995-06-13 | 1995-06-13 | Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen Substanz |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19521388A1 true DE19521388A1 (de) | 1996-12-19 |
DE19521388C2 DE19521388C2 (de) | 1997-05-22 |
Family
ID=7764214
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1995121388 Expired - Fee Related DE19521388C2 (de) | 1995-06-13 | 1995-06-13 | Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen Substanz |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19521388C2 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001077179A1 (de) * | 2000-04-05 | 2001-10-18 | Scintec Diagnostics Gmbh | Proteine mit hoher immunreaktivität sowie ein verfahren zu ihrer herstellung |
DE102004042124A1 (de) * | 2004-08-30 | 2006-03-02 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Gegenwart eines Überschusses von kreuzreagierenden Substanzen |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0263401A1 (de) * | 1986-10-02 | 1988-04-13 | Hoechst Aktiengesellschaft | Immunometrisches Bestimmungsverfahren |
DE4309393A1 (de) * | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verringerung des Hook-Effekts in Immuntests mit teilchenförmigem Trägermaterial |
-
1995
- 1995-06-13 DE DE1995121388 patent/DE19521388C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0263401A1 (de) * | 1986-10-02 | 1988-04-13 | Hoechst Aktiengesellschaft | Immunometrisches Bestimmungsverfahren |
DE4309393A1 (de) * | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verringerung des Hook-Effekts in Immuntests mit teilchenförmigem Trägermaterial |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
FERNANDO, S.A., WILSON, G.S.: J.Immunol. Methods 151 (1992), 47-66 * |
HOFFMAN, K.L. et al.: Clin.Chem. 30 (1984) 9, 1499-1501 * |
SEVIER, E.D. et al.: Clin.Chem. 27 (1981) 11, 1797-1806 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001077179A1 (de) * | 2000-04-05 | 2001-10-18 | Scintec Diagnostics Gmbh | Proteine mit hoher immunreaktivität sowie ein verfahren zu ihrer herstellung |
US7264805B2 (en) | 2000-04-05 | 2007-09-04 | Scintec Diagnostics Gmbh | Proteins with a high immunoreactivity and a method for the production thereof |
US7820410B2 (en) | 2000-04-05 | 2010-10-26 | Scintec Diagnostics Gmbh | Proteins with high immunoreactivity and method for their production |
DE102004042124A1 (de) * | 2004-08-30 | 2006-03-02 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Gegenwart eines Überschusses von kreuzreagierenden Substanzen |
DE102004042124B4 (de) * | 2004-08-30 | 2006-07-06 | Dade Behring Marburg Gmbh | Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Gegenwart eines Überschusses von kreuzreagierenden Substanzen |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE19521388C2 (de) | 1997-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69022254T2 (de) | Liganden-Rezeptor-Assays unter Verwendung eines Schwellenwertes. | |
EP0363942B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz | |
DE3852117T2 (de) | Immunoassay mit Verwendung von nichtmetallischen, kolloidalen Teilchen. | |
DE69121021T2 (de) | Bindungsnachweisverfahren mit Konjugatrückgewinnung | |
DE68908432T2 (de) | Schwellwertimmunoassay. | |
EP0407904B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Analyten | |
DE3872500T2 (de) | Verwendung eines mit biotin verknuepften immobilisierten rezeptors in einer testvorrichtung, einem testsatz und einer methode zur bestimmung eines liganden. | |
EP0356964B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz | |
EP0544869B2 (de) | Immunologisches bestimmungsverfahren zur bestimmung von antikörpern in biologischen flüssigkeiten sowie kit zur durchführung des verfahrens | |
DE69131811T2 (de) | Antikörpern gegen Ligand-Analogen und ihre Verwendung in Ligand-Rezeptor Bestimmungen | |
WO1998023955A2 (de) | ANTIGENSPEZIFISCHER IgM-NACHWEIS | |
EP0349988B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer spezifisch bindefähigen Substanz | |
EP0291086B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung eines Antikörpers in menschlichen Körperflüssigkeiten | |
DE69331570T2 (de) | Agglutinationstest unter Anwendung eines multivalenten Liganden | |
EP0829723B1 (de) | Homogene Nachweisverfahren zur Bestimmung von Subpopulationen eines Analyten | |
EP0268978B1 (de) | Verfahren und Testträger zur Bestimmung eines Analyten | |
DE3850379T2 (de) | Wasser-unlösliches Reagenz, dieses enthaltende Elemente und Verwendungsverfahren. | |
DE69328727T2 (de) | Immunologisches nachweisverfahren unter verwendung von zwei bestimmbaren markern | |
EP2147313A2 (de) | Verfahren zum nachweis spezifischer antikörper der immunglobulinklasse g | |
EP0366092B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von für ein Antigen klassenspezifischen Antikörpern und dazu geeignetes Reagenz | |
DE19521388C2 (de) | Technik zur Bestimmung einer spezifisch-bindefähigen Substanz | |
DE69116820T2 (de) | Chemilumineszierender Immunotest | |
EP0599803B1 (de) | Verfahren zum Nachweisen von Antikörpern und Antigenen | |
DE3781841T2 (de) | Diagnostisches immuntest-verfahren mittels festphasenabscheidung. | |
DE4136010A1 (de) | Verfahren zur bestimmung einer immunologisch bindefaehigen substanz |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: PROGEN BIOTECHNIK GMBH, 69123 HEIDELBERG, DE |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |