DE2418349A1 - Fortimicin b, verfahren zu seiner herstellung, mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittel - Google Patents
Fortimicin b, verfahren zu seiner herstellung, mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittelInfo
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Description
" Fortimicin B, Verfahren zu seiner Herstellung, Mikroorganismen
zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel t!
Priorität: 17. April 1.973, Japan, Nr. 42 696/1973
Die Erfindung betrifft das als Fortimicin B bezeichnete Antibiotikum,
ein Verfahren zu seiner Herstellung, Mikroorganismen zur Durchführung des Verfahrens und Arzneimittel, die das Fortimicin'
B enthalten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Antibiotikum mit einem breiten WirkungsSpektrum gegenüber den verschiedensten
Bakterien zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf der Auffindung einer neuen Art eines Mikroorganismus, der aus einer Bodenprobe
isoliert vmrde, die aus einem Reisfeld in einer Vorstadt von Hiroshima, Japan, entnommen wurde. Diese neue Art bildet
bei ihrer Züchtung in einem Nährmedium das neue Antibiotikum Fortimicin B, das antibiotische Aktivität gegenüber gram-positiven
und gram-negativen Bakterien, insbesondere gegenüber Staphylococcen, Escherichia und anderen Bakterien, zeigt. _j
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Gegenstand der Erfindung ist somit Fortimicin B der Summenformel C^cH^pN^Oc, dem Molekulargewicht 3^8, dem Ultraviolett-Absorptionsspektrum
gemäß Figur 1, dem Ultrarot-Absorptionsspektrum
gemäß Figur 2 und dem NMR-Spektrum gemäß Figur 3, und seine Salze mit Säuren.
Figur 4 zeigt das NMR-Spektrum des Aminocyclit-Tsils des Fortimicin
B-Moleküls und Figur 5 zeigt das NMR-Spektrum des N-Acetylderivats des Aminocyclit-Teils des Fortimicin B-Moleküls.
Vermutlich hat Fortimicin B die Formel
3 , NHCH,
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von
Fortimicin B, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der di'e Fähigkeit zur Bildung
von Fortimicin B besitzt, in einem Nährmedium züchtet, das Antibiotikum aus dem Nährmedium isoliert und gegebenenfalls durch
JJmsetzen. mit einer anorganischen oder organischen Säure das Salzj
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bildet.
Ein besonders: geeigneter Mikroorganismus gehört zur Art Micromonospora
olivoasterospora. Sein typischer Stamm wurde ursprünglich als Stamm MK-70 identifiziert. Dieser Stamm wurde bei der
American Type Culture Collection, Rockville Maryland, V.St.A.,
unter der Nummer ATCC 21819 hinterlegt. Der MK-70 Stamm hat folgende
Eigenschaften:
I. Morphologie
Der MK-70 Stamm ist gram-positiv. Auf üblichem Agar-Nährboden
bildet der MK-70 Stamm kein echtes Luftmycel, wie dies bei Streptomyces beobachtet wird. Bei guter Sporenbildung beobachtet
man auf der Oberfläche eines Agarnährbodens eine olivgrüne,
wachsähnliche, glänzende Schicht von Sporen. Beim Züchten des Stamms in einem flüssigen Nährmedium zeigt die Kulturflüssigkeit
während der Anfangsstufen der Züchtung eine hellbraune
Farbe, in den Endstufen der Züchtung eine dunkel-olivgrüne Farbe. In der Kulturflüssigkeit kann eine große Zahl von Sporen
beobachtet werden. Die mikroskopische Untersuchung der Zellen des MK-70 Stammes, der in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet
wurde, hat ergeben, daß das Mycel einen Durchmesser von etwa 0,5 Mikron aufweist, gut entwickelt und nicht septiert ist.
Eine einzige Spore wird am Ende jedes Sporophoren (etwa 0,3 bis 1,0 Mikron lang) gebildet, die vom Substratmycel abzweigt. Die
Sporen werden über das gesamte, verhältnismäßig lange Substratmycel gebildet. Die reifen Sporen sind kugelförmig und haben
einen Durchmesser von etwa 1,0 Mikron. Unter dem Elektronenmikroskop
erscheinen die Sporen wie ein Stern, da aus ihnen
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r . "ι
eine große Zahl von Vorsprüngen herausragen, deren Enden abgerundet
sind.
II« Wuchsformen
In Tabelle I sind die Wuchsformen des Mikroorganismus MK-70
auf verschiedenen Standard-Nährböden zusammengefaßt. Die Angaben über die Farbe werden nach der Einteilung in Color Harmony
Manual (Container Corporation of America) gegeben. Der Tyrosin-Agar ist von Gordon & Smith in J. Bact., Bd. 69 (1955), S. 147
beschrieben.
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Nährboden
Wachstum und Koloniegestalt Farbe des Bildung von Substratmycels löslichem
Pigment
Czapek's Agar
mäßig; flach staubig olivgrün fi 1g)
keines
Glucose-AsOaragin-Agar
mäßig, flach, wachsartig olivgrün
(1 Pl)
(1 Pl)
keines
Nähragar
gut; erhaben, gefurcht · olivgrün
(1 l)
(1 l)
keines
Eialbumin-Agar
mäßig; flach, wachsartig hell olivgrün keines gelbbraun (1 Ii)
Stärke-Agar
gut;
flach schwach olivgrün (1 po)
flach schwach olivgrün (1 po)
keines
Malzextrakt-r
Hefeextrakt-Ägar
Hefeextrakt-Ägar
gut;
erhabeny gefurcht dunkel olivgrün (1 pn)
dunkel olivgrün (1-1/2 pn)
Hafermehl-Agar
gut;
faltig,
wachsartig bernstein-karamelfarben
(3 1c)
dunkelbraun
(2 pn)
(3 1c)
dunkelbraun
(2 pn)
staubig olivgrün (1 Pg)
Dextrose (1%) NZ-Amin (3#)-Agar
mäßig, flach, wachsartig hell weizenfarben
(2 ea)
(2 ea)
keines
Bennet's Agar
gut;
erhaben,
gefurcht dunkel olivgrün (1 pn)
keines
Emerson's Agar
mäßig;-erhaben, gefurcht, wachsartig olivfarben
(1 ni)
(1 ni)
keines
Glucose-Hefeextrakt-Agar
gut;
erhaben, gefurcht, wachsartig dunkel oliv- keines grün (1 pn)
Pepton-Eisen-Agar
mäßig; flach, wachsartig dunkel oliv- keines grün (1 nl)
Tyrosin-Agar
mäßig; flach, wachsartig olivgrün
(1 ni)
(1 ni)
keines
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III. Physiologische Eigenschaften
Die physiologischen Eigenschaften des Stammes MK-70 sind in Tabelle
II zusammengefaßt. In den Versuchen, ausgenommen den Versuchen zur Bestimmung des Temperaturoptimums und der Einwirkung
gegenüber Milch und Cellulose, wird der Stamm 2 Wochen bei 27°C gezüchtet. Das Temperaturoptimum wird nach 5-tägiger Züchtung
bestimmt. Die Einwirkung auf Milch und Cellulose wird nach 1monatiger Züchtung bestimmt.
bestimmt. Die Einwirkung auf Milch und Cellulose wird nach 1monatiger Züchtung bestimmt.
(1) Verwertung von Kohlenstoffquellen:
Kohlenstoffquelle: D-Arabinose fc
D-Galactose D-Glucose Glycerin D-Lactose D-Fructose L-Inosit
D-Mannit b-Raffinose L-Rhamnose
Sucrose Stärke D-Xylose
(2) Verflüssigung von Gelatine
(3) Einwirkung auf Milch
(4) Cellulosezersetzung
(5) Stärkehydrolyse
(6) pH-Optimum des Wachstums
(7) Temperaturoptimum des Wachstums
(8) Nitrat-Reduktion
(9) Tyrosinase-Reaktion
(10) Bildung von melanoiden Pigmenten
Verwertung:
schwach Peptonisierung schwach positiv positiv 6,8 bis 7,5 30 bis 380C
positiv negativ negativ
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Der MK-70 Stamm ist ein mesophiler Mikroorganismus, der bei der
Züchtung auf einem Agar-Nährboden kein echtes Luftmycel bildet, sondern auf dem Substratmycel eine einzige Spore bildet. Die
Analyse der Zellwand dieses Stammes hat ergeben, daß sie Mesodiaminopimelinsäure
enthält. Dementsprechend gehört der MK-70 Stamm zu einem Stamm der Gattung Micromonospora.
Zuverlässige Grundlagen für die systematische Klassifizierung von Arten der Gattung Micromonospora wurden nicht geschaffen.
Deshalb wurde die Klassifizierung der Mikroorganismen dieser Gattung bis jetzt durch einen Gesamtvergleich der morphologischen
und physiologischen Eigenschaften durchgeführt. Entsprechend
dieser Klassifizierungsmethode wurden 3 Stämme berechnet, die zur Gattung Micrcmonospora gehören, nämlich Micromonospora
echinospora subsp. echinospora NRRL-2985 (ATCC 15837),
Micromonospora echinospora subsp. pallida NRRL-2996 (ATCC 15838) und Micromonospora echinospora subsp. ferruginea NRRL-2995
(ATCC 15836). Diese besitzen runde Vorsprünge auf der Oberfläche der Spore. Diese drei Stämme von M. echinospora bilden Sporen
von dunkelbrauner bis schwarzer Farbe, wenn sie auf einem üblichen Agar-Nährboden gezüchtet werden. Sie zeigen jedoch nicht
eine, olivgrüne Farbe, wie der MK-70 Stamm. Die drei Stämme von
M. echinospora können im Gegensatz zum MK-70 Stamm L-Rhamnose verwerten. Ferner können diese drei bekannten Stämme zwei antibiotisch
aktive Verbindungen bilden, von denen eine nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirkt und einen R^-Wert von 0,4
bis 0,5 bei der Papierchromatographie mit Wasser gesättigtem n-Butanol als Entwicklungslösungsmittel hat, sowie das Antibio-Gentamicin,
das einen EU-Wert von 0,00 besitzt. Der
x J
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Γ Π
~8~ 2418348
MK-70 Stamm kann dagegen drei antibiotisch aktive Verbindungen
bilden, nämlich eine Substanz, die nur gegenüber gram-positiven Bakterien wirksam und einen Rf-¥ert von 0,05 bis 0,1 bei der
Papierchromatographie mit dem vorgenannten Entwicklungslösungsmittel hat, eine Verbindung, die nur gegenüber gram-positiven
Bakterien wirksam ist und einen R^-Wert von 0,00 hat, sowie die
Verbindung Fortimicin B, die sowohl gegenüber gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien wirkt und einen R^-Wert von
0,00 hat. Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß der MK-70
Stamm sich von den drei bekannten Stämmen von M. echinospora unterscheidet.
Der MK-70 Stamm zeigt eine olivgrüne bis dunkel olivgrüne Farbe■
bei der Züchtung auf einem Nährboden, der zur Sporenbildung geeignet ist, und er bildet ein lösliches, olivgrünes Pigment in
anderen Nährmedien. Unter den Stämmen der Gattung Micromonospora gibt es einige Stämme, die olivgrüne Sporen bilden können,
nämlich Micromonospora chalcea und Micromonospora fusca. Diese Stamme unterscheiden sich jedoch im Aussehen der Sporenoberfläche
und der Farbe der löslichen Pigmente.
Andere Arten von Micromonospora, nämlich Micromonospora coerulea zeigen gewöhnlich eine grün-blaue Farbe und bilden
blaugrüne lösliche Pigmente. Die Pigmente wirken als Säure-Base-Indikatoren und sind daher verschieden von dem Pigment des
MK-70 Stammes. Die Sporen von M. coerulea liegen traubenförmig vor und die Sporerioberflache ist glatt. Somit ist M. coerulea
verschieden vom MK-70 Stamm.
U _J
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Wie vorstehend beschrieben, gibt es keine Stämme unter den bis Jetzt bekannten Stämmen der Gattung Micromonospora, die dem
MK-70 Stamm entsprechen. Deshalb wird der MK-7O Stamm als ein
neuer Stamm angesehen, der zur Gattung Micromonospora gehört. Er wurde deshalb mit Micromonospora olivoasterospora bezeichnet.
Der Name dieser Art leitet sich von der Bildung olivgrüner kugelförmiger Sporen mit Vorsprüngen ab. Wie vorstehend beschrieben,
wurde der MK-70 Stamm bei der American Type Culture Collection als Micromonospora sp. MK-70 hinterlegt. Der MK-70
Stamm wurde ferner beim Fermentation Research Institute, Tokyo, Japan hinterlegt unter der Nummer FEElMP-Nr. 1560.
Es wurden ferner zwei Variantenstäinme von Micromonospora
olivoasterospora isoliert, die ebenfalls Fortimicin B bilden können. Diese Varianten unterscheiden sich vom Typenstamm dadurch,
daß sie D-Galactose, D~Fructose und D-Xylose verwerten
können. Bei der Züchtung dieser Varianten auf den verschiedensten Nährböden zeigen sie eine helle Weizenfarbe, da sie nicht
die Fähigkeit haben,auf dem Mycel Sporen zu bilden. In anderer
Hinsicht sind die Varianten dem Typenstamm sehr ähnlich. Diese beiden Varianten wurden ebenfalls bei der American Type Culture
Collection unter der Nummer ATCC 31009 und ATCC 31010 hinterlegt.
Diese Varianten sowie der Typenstamm sind der Öffentlichkeit für Forschungszwecke zugänglich.
Ebenso wie andere Stämme von Actinomyceten können die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Mikroorganismen durch
mutagene Mittel, wie UV-Licht, Bestrahlung mit Co60, Röntgenstrahlen
und den verschiedensten mutagenen chemischen Verbin-
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Γ" ~1
düngen mutiert werden. Alle Stämme und Mutanten, die die Fähigkeit
zur Bildung von Fortimicin B besitzen, können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. ' '
Im allgemeinen können im erfindungsgemäßen Verfahren die üblichen Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten verwendet werden.
Für das Nährmedium können die verschiedensten Nährstoffe eingesetzt werden. Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise
Glukose, Stärke, Mannose, Fructose, Sucrose und Melassen und deren Gemische. Ferner können z.B. Kohlenwasserstoffe, Alkohole
und organische Säuren verwendet werden, je nach der Verwertungsfähigkeit des eingesetzten Mikroorganismus. Anorganische und
..organische Stickstoffquellen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat, sowie natürliche
Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, .Hefeextrakt,
Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Casaminosäure, und lösliche pflanzliche Proteine können entweder allein oder im
Gemisch verwendet werden. Ferner können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Phosphate
dem Nährmedium zugesetzt werden. Schließlich können organische oder anorganische Verbindungen dem Nährmedium zugesetzt werden,
welche das Wachstum des Mikroorganismus und die Bildung von Fortimicin B fördern.
Im erfindungsgeraäßen Verfahren wird vorzugsweise ein flüssiger Nährboden eingesetzt und das Verfahren als Submersverfahren und
. unter Rühren durchgeführt. Vorzugsweise wird die Züchtung bei
Temperaturen von 25 bis 400C und bei annähernd neutralem pH-Wert
durchgeführt. Nach etwa 4 bis 15-tägiger Züchtung hat ,
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r ■ ι
sich in der Kulturbrühe eine ausreichende Menge des Antibiotikums
gebildet. Sobald die Ausbeute an Fortimicin B in der Kulturbrühe ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen,
die Zellmasse von der Kulturflüssigkeit abgetrennt und das Antibiotikum aus dem Filtrat isoliert und gereinigt. Die Isolierung
und Reinigung von Fortimicin B aus dem Filtrat wird nach üblichen Methoden zur Isolierung und Reinigung von mikrobiellen
Stoff Wechselprodukten aus Kulturflüssigkeiten durchgeführt. Da Fortimicin B eine Base darstellt und in Wasser löslich, Jedoch
in üblichen organischen Lösungsmitteln schlecht löslich ist, kann das Antibiotikum nach üblichen Methoden zur Reinigung sogenannter
wasserlöslicher basischer Antibiotika gereinigt werden. Die Reinigung von Fortimycin B kann insbesondere durch eine ge- .
eignete Kombination von Adsorption und Desorption an Kationenharzaustausehern,
Säulenchromatographie an Cellulose., Adsorption und Desorption an Sephadex LH-20 und Chromatographie an Kieselgel
gereinigt werden.
Beispielsweise wird das zellfreie Kulturfiltrat zunächst auf
einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und hierauf an einem Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform adsorbiert. Nach dem Waschen
mit Wasser wird mit 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingedampft und hierauf
auf eine Säule eines Anionenharzaustauschers in der OH"-Form
! gegeben. Die adsorbierten Substanzen werden mit Wasser eluiert und die eluierten aktiven Fraktionen vereinigt und unter vermindertem
Druck eingedampft. Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt, das Fortimicin B und andere aktive Komponenten enthält.
L · -J
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18349
Zur Isolierung des Fortimicin B aus dem Rohprodukt'z.B. an
Kieselgel chromatographiert. Als Entwicklungslösungsmittel wird die untere Schicht eines Gemisches aus Chloroform, Isopropanol
und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (2:1: 1) verwendet. Das pulverförmige Rohprodukt wird im Entwicklungslösungsmittel
gelöst und auf die Kieselgelkolonne gegeben. Sodann
wird mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt.. Die erste aktive Fraktion enthält Fortimicin B. Andere aktive Komponenten, .
wie die vorläufig mit XK-70-1 bezeichnete Substanz sind in den nachfolgenden eluierten Fraktionen enthalten. Die Fortimicin B
enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft.- Nach dem Gefriertrocknen des Konzentrats
wird ein weißes Pulver erhalten, das die Base des Antibiotikums enthält.
Die Fortimicin B enthaltenden aktiven Fraktionen werden durch aufsteigende Papierchromatographie mit Filterpapier Whatman
Nr. 1 bestimmt. Die Entwicklung wird bei Raumtemperatur während 10 bis 15 Stunden unter Verwendung der unteren Schicht eines
Gemisches aus Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (2 : 1 : 1) durchgeführt. Der R^-Wert von
Fortimicin B auf dem Papierchromatogramm beträgt etwa 0,65.
Fortimicin B ist eine weiß gefärbte basisch reagierende Sub- · stanz mit einem Molekulargewicht von 348 und einem Schmelzpunkt,
von 101 bis 1030C. Die Elementaranalyse ergibt folgende
Werte: C = 51,72 %; H- 9,20 %; N=16,16 %; 0= 22,92 %. Die Ver
bindung hat die Summenformel
5*
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ORlGfNAL INSPECTED
In Figur 1 ist das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung von Fortimicin B wiedergegeben. Das Spektrum zeigt keine
charakteristischen Maxima im Spektralbereich von 220 bis
360 mu und lediglich eine Endabsorption.
Die freie Base des Fortimicin B hat folgenden optischen Drehwert /ά/β4 = + 22,2 (C = 1,01, H2O).
In Figur 2 ist das Ultrarot-Absorptionsspektrum des Antibiotikums
als Kaliumbromid-Preßling wiedergegeben. Fortimicin B zeigt Absorptionsmaxima bei folgenden Wellenzahlen (cm"* ):
523, 561, 650, 702, 755, 815, 879, 917, 993, 1034, 1066,
1250,
•1093, 1150,/1336, 1370, 1470, 1578, 210Ö, 2930 und 3355.
•1093, 1150,/1336, 1370, 1470, 1578, 210Ö, 2930 und 3355.
Das NMR-Spektrum von Fortimicin B ist in Figur 3 wiedergegeben.
Die Absorption bei 5,6 2 ppm, bezogen auf ein anomeres Proton, deutet auf die Gegenwart eines Monoglycosids im Antibiotikum.
Das Spektrum zeigt ferner ein Hethyl-Dublett bei 1,59 ppm,
einen Methylenpeak bei 2,0 bis 2,5 ppm und eine Absorption bei 3,3 ppm benachbart zu einem anomeren Proton.
Bei der Hydrolyse von Fortimicin B mit 6 η Salzsäure und an- .
schließender Dünnschichtchromatographie wird ein Fleck in der ■ gleichen Stellung beobachtet, wo Purpurosamin B einen Fleck
bei der Dünnschichtchromatographie des Hydro lysats eines anderen Antibiotikums, nämlich Gentamicin C2,bildet. Aus diesen Befunden
und dem Massenspektrum, das nachstehend diskutiert wird, ist der Monoglycosidteil des Fortimicin B vermutlich das
Purpurosamin B der Formel
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Figur 4 zeigt das NMR-Spektrum eines Aminocyclit-Teils, der
durch Hydrolyse von Fortimicin B erhalten wird. Das Spektrum hat Singulett-Peaks bei 3,17 ppm und 3,95 ppm, welche die Gegenwart
einer N-Methylgruppe und einer O-Methylgruppe anzeigen.
Figur 5 zeigt das *NMR-Spektrüm des N-Acetylderivats des Aminocyclit-
Teils. Der einzige Peak bei 2,48 ppm zeigt die Gegenwart einer N-Acetylgruppe, d.h. die Gegenwart von Stickstoff
im Aminocyclit-Teil.
Im Massenspektrum wurden Peaks bei folgenden m/e-Werten aufgezeichnet:
349.2442, 331.2099, 286.1762, 235.1297, 207.1338, 143.1184, 126.0916, 100.0768, 97.0890, 88.0752, 87.0669, 86.0596,
82.0642, 72.0440, 70.0646, 56.0497, 44.0499.
Auf Grund der vorstehend angegebenen Werte des Massenspektrogramms
sind die Werte ein Indiz für den M -Zustand. Das
positive heißt, die im Molekül induzierte/Ladung ist das Ergebnis der
Anlagerung eines Wasserstoffkerns und nicht der übliche Verlust eines Elektrons.
Deshalb ist jeder Wert um einen Faktor von 1 höher als der rieh
tige Wert. Aus diesen Werten ist ersichtlich, daß der Wert des
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Molekülions M+ = m/e 349 und der von M - H2O = m/e 331 ist.
Außerdem zeigt der Wert m/e 143 die Gegenwart von Purpurosamin B an.
Das N-Acetylderivat des Aminocyclit-Teils, der bei der Hydrolyse von Fortimicin B erhalten wird, hat ein Molekularion von
M+1 von m/e 249, M+1 - H2O von m/e 231, M+1 - 2H2O von ra/e 213
und M+ - CH-,ΟΗ von m/e 217. Somit muß es die Suramenforinel
C10H20N2Oc haben.
Aus dem NMR-Spektrum und den Werten des Massenspektrums des Aminocyclit-Teils »-ergibt sich, daß das Fortimicin B-Molekül
eine O-Methylgruppe, eine N-Methylgruppe und zwei Hydroxylgruppen
enthält. Diese Analyse wird durch den Befund gestützt, daß bei der Oxidation von Fortimicin B mit Perjodsäure 2 Mol
Perjodsäure pro Mol Fortimicin verbraucht werden. Bei der Acetylierung
des Antibiotikums mit Essigsaureanhydrid und anschließender Behandlung mit Perjodsäure wird keine Perjodsäure
verbraucht. Aufgrund der vorstehenden Befunde hat Fortimicin B vermutlich folgende Strukturformel:
L ' · J
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■ NHCH3
Die Gegenwart der "aufgeführten Substituenten ist zwar sicher,
.ihre Stellung im Molekül wurde jedoch noch nicht bestimmt.
Die freie Base des Fortimicin B ist in Wasser gut löslich, in Methanol löslich, in Äthanol mäßig löslich und in organischen
Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Diäthyläther, Petroläther und η-Hexan unlöslich.
Fortimicin B ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Kaliumpermanganat-Reaktion,
sowie eine negative Sakaguchi-, Elson-Morgan- und Biuret-Reaktion.
Die R~-Werte von Fortimicin B bei der Papierchromatographie
und DünnschichtChromatographie mit den verschiedensten Entwicklungslösungsmitteln
sind in den Tabellen III, IV und V zu-
wurdeji
sammengefaßt. Diese Werte / mit den Rf-Werten verschiedener
ähnlicher Antibiotika verglichen, die in gleicher Weise entwickelt wurden.
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Tabelle III
R^-Werte von Fortimicin B im aufsteigenden Papier-
R^-Werte von Fortimicin B im aufsteigenden Papier-
chromatogramm bei 280C
Entwicklungslösungsmittel ' Rf-¥ert Entwicklungs-
20gewichtsprozentige Ammonium- ο «^ χ
Chloridlösung u'ö:? ^
wassergesättigtes N-Butanol' O 00 - 15
n-Butanol-Essigsäure-Wasser η na -m
.(3:1:1) ' ' u>uy Ί5
wassergesättigtes Äthylacetat ' ·0 00 4
2 Gewichtsprozent p-Toluolsul- 0 07 15
fonsäure und 2 Volumprozent * ' -*
wassergesättigtes n-Butanol mit
2 Gewicht
fonsäure
Piperidin
Rf-Werte von Fortimicin B und Gentamicin C Komplex
bei der DUnnschichtchromatographie an Kieselgel; entwickelt bei Raumtemperatur während 5 Stunden
Entwickler | *)' | Antibiotikum | Rf-¥ert |
I | Fortimicin B | 0,80 | |
I | Gentamicin C Komplex |
0,71 | |
II | Fortimicin B | 0,62 | |
. II | Gentamicin C Komplex |
0,06 bis 0,16 |
*) Entwickler I: Die obere Schicht eines Gemisches von Chloroform,
Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2:1 : 1)
Entwickler II: lOprozentige Ammoniumacetatlösung und Methanol (Volumverhältnis 1:1).
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..18- · Π
Rp-Werte bekannter Antibiotika bei der aufsteigenden Papiercnromatographie
unter Verwendung der unteren Schicht des Gemisches von Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger
Ammoniaklösung (Volumverhältnis 2 : 1 ; 1) als Entwicklungslösungsmittel, entwickelt bei Raumtemperatur während 12 Stunden
Antibiotikum R^
Streptomycin A 0,02
Streptomycin B 0,00
Bluensomycin ' 0,01
Ribostamycin 0,00
Lividomycin A 0,00
Lividomycin B 0,03
Lividomycin D 0,02
Spectinomycin 0,45
Kasugamycin 0,01
Butirosine A 0,00
Butirosine B 0,01
Hygromycin B 0,02
Destomycin A · 0,03
Gentamicin A 0,00
Gentamicin B 0,00
Gentamicin C1a 0,18
Gentamicin C1 0,59
Gentamicin C2 0,38
Sisomicin 0,18
Neomycin A 0,00
Neomycin B 0,03
Neomycin C 0,00
Antibiotic Nr. 460 0,01
Kanamycin A 0,02
Kanamycin B 0,01
Kanamycin C . 0,02
Paromomycin 0,00
Nebramycin Komplex 0,01
Tobramycin 0,02
Apramycin 0,02
XK-62-2 0,49
Fortimicin B 0,65 L
409845/1113
In Tabelle VI ist die minimale Hemmkonzentration von Fortimicin
* ■
B gegenüber verschiedenen pathogenen Mikroorganismen zusammengefaßt.
Mikroorgani smus minimale Hemmkon-
ζ entration, γ/ρ,ιΐ
Streptococcus faecalis ATCC 10541 >416,5
Staphylococcus aureus ATCC 6538P 6,6
Staphylococcus aureus KY 8942
(resistent gegenüber Kanamycin, Paromomycin und Streptomycin) 104,2
Staphylococcus aureus KY 8950 52,1
(resistent gegenüber Streptomycin, Tetra- . ■
cyclin, Penicillin und Sulfonamiden)
Staphylococcus aureus KY 8953 26,1
(resistent gegenüber Streptomycin. Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin, Neomycin,
Kanamycin B und Erythromycin)
Staphylococcus aureus KY 8956 0,83
(resistent gegenüber Streptomycin, Paromomycin, Tetracyclin, Erythromycin und Oleandomycin)
Staphylococcus aureus KY 8957 1,65
(resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin B, Tetracyclin und Paromomycin)
Bacillus subtilis Nr. 10707; KY 4273 104,2
Bacillus cereus ATCC 9634 104,2
Bacillus cereus var.mycoides ATCC 9463 10^,2
, Klebsieila pneumoniae ATCC 10031 26 1
Escherichia coli ATCC 26 13 1
Escherichia coli KY 8302 208,3
(resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin und
L. opectmomycin;
409845/1113
Tabelle IV - Fortsetzung
Mikroorganismus minimale Hemmkon
zentration, v/ml
Escherichia coli KY 8310 52,1
(resistent gegenüber Chloramphenicol,
Streptomycin, Kanamycin, Gentamicin,
Kanamycin B, Paromomycin,· Tetracyclin
und Spectinomycin)
Streptomycin, Kanamycin, Gentamicin,
Kanamycin B, Paromomycin,· Tetracyclin
und Spectinomycin)
Escherichia coli KY 8314 · 26,1
(resistent gegenüber Streptomycin)
Escherichia coli KY 8315 26,1
(resistent gegenüber Streptomycin,
Kanamycin, Paromomycin und Neomycin)
Kanamycin, Paromomycin und Neomycin)
Escherichia coli KY 8327 13,1
(resistent gegenüber Kanamycin ,
Gentamicin, Sisomicin und Tobramycin)
Gentamicin, Sisomicin und Tobramycin)
Escherichia coli KY 8331 1,65
(resistent gegenüber Kanamycin, Ribostamycin,
Neomycin, Paromomycin und Lividomycin)
Neomycin, Paromomycin und Lividomycin)
Escherichia coli KY 8332
(resistent gegenüber Kanamycin und Tobramycin) 3,3
Pseudomonas aeruginosa BMH Nr. 1 208,3
Proteus vulgaris ATCC 6897 26,1
Shigella sonnei ATCC 9290 52,1
Salmonella tvphosa ATCC 9992 13,1
Aus Tabelle VI ist ersichtlich, daß Fortimicin B eine antibakterielle Aktivität gegenüber den verschiedensten gram-positiven
und gram-negativen Bakterien sowie auch gegenüber Staphylococcus aureus und Escherichia coli besitst«, die gegenüber
den verschiedensten bekannten Antibiotika resistent sind. Aufgrund des breiten antibakteriellen ftirkungespektrums und der
charakteristischen-Struktur eignet sich Fortimicin 3 als Desinfektionsmittel.,
Ferner ist Fortimicin B sine trertvolle Aus-
S / 1 1 1 3"
Γ Π
gangsverbindung zur Herstellung der verschiedensten Derivate.
Fortimicin B ist ein. neues Antibiotikum. Als wasserlösliche
basische Antibiotika, die durch Mikroorganismen der Gattung Micromonospora erzeugt werden, und die ein breites antibakterielles
WirkungsSpektrum besitzen, sind beispielsweise folgende Verbindungen
bekannt:
Gentamicin (M.J. Weinstein et al., Antimicrobial Agents and
Chemotherapy 1963, 1 und D. J. Cooper et al., J. Infect. Dis., Bd. 119, (1969), S. 342),
Antibiotikum Nr. 460 (japanische Patentveröffentlichung
Nr. 16 153/71),
.Sisomicin (M.J. Weinstein et al., J. Antibiotics, Bd. 23 (1970),.
S. 551, 555 und 559).
Aus Tabelle IV und V ist ersichtlich, daß die R^-Werte von
Fortimicin B bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel und der Papierchromatographie sich deutlich unterscheiden von den
Komponenten des Gentamicin A, B, C ^ , C« und Cj, Antibiotikum
Nr. 460, Sisomicin und XK-62-2. Selbst beim Vergleich mit den wasserlöslichen basischen Aminoglykosid-Antibiotika, die ähnliche
Eigenschaften haben wie Fortimicin B oder dessen Bestandteile, wie Neomycin A (Neamine), Paromomycin und Gentamicin, wobei
die letztgenannten Antibiotika das Desoxystreptamin als Bestandteil
erhalten, während Fortimicin B kein Desoxystreptamin enthält, unterscheiden sich diese Antibiotika deutlich. Ferner
unterscheidet sich die chemische Struktur von Fortimicin B von den anderen bekannten Antibiotika.
i 8 y -j)
■-2Ü-
Da Fortimicin basische Gruppen enthält, kann es in Form von Salzen mit Säuren vorliegen. Die Salze leiten sich von anorganischen
Säuren, v/ie Salzsäure, Bromwasserstoff säure, Jodwasserstoff
säure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure und Phosphorsäure,
oder organischen Säuren, v/ie Maleinsäure, Essigsäure, Citronen säure, Oxylsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Weinsäure,
Fumarsäure, Äpfelsäure, Mandelsäure oder Ascorbinsäure, ab.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Micromonospora olivoasterospora (ATCC 21819; FERM-P Nr. 1560)
wird als Einsaatstamm in einem ersten Vorkulturmedium gezüchtet, das 2 Prozent Glukose, 0,5 Prozent Pepton, 0,5 Prozent
Hefeextrakt und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Das Nährmedium wurde vor der Sterilisation auf einen pH-Wert von 7,2
eingestellt. Eine Platinöse des Einsaatstammes wird in 10 ml" des Vorkulturmediums in einem 50 ml fassenden großen Reagensglas
beimpft. Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 300C durchgeführt. Sodann werden 10 ml der ersten Vorkultur
in 30 ml eines zweiten Vorkulturmediums in einem 250 ml Erlenmeyerkolben überimpft. Die Zusammensetzung des zweiten
Vorkultunaediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums.
Die Züchtung wird 2 Tage unter Schütteln bei 300C durchgeführt»- Sodann werden 30 Hl des zweiten Vorkulturmediums
in 300 Ml eines dritten Vorkulturmediums is einem 2 Liter fassenden
Erlenmeyerkolben überimpft s der mit Prallplatten ausgerüstet
ist. Die Zusammensetzung des drittes! Forkulturmediums
ist die gleiche wie die des erstes Yorkulturmediums. Die Zücfc-
4ÖS84S/1113
tung im dritten Vorkulturmedium wird 2 Tage unter Schütteln bei 300C durchgeführt. Sodann werden 1,5 Liter der dritten Vorkulturbrühe
- entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben - in 15 Liter eines vierten Vorkulturmediums in einem 30 Liter fassenden
Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Vorkulturmediums ist die gleiche wie die des ersten Vorkulturmediums.
Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung und Rühren (350 U/min; Belüftung 15 Liter/min) bei
300C durchgeführt. Schließlich werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe
in 150 Liter eines Mediums in einem 300 Liter fassenden
Fermenter aus Edelstahl überimpft. Dieses Nährmediuoi
enthält 4 Prozent Stärke, 2 Prozent Sojabohnenmehl, 1 Prozent
. Maisquellwasser, 0,05 Prozent K2HPO^, 0,05 Prozent MgS0^.7H20,
0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO3. Vor der Sterilisation
wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die Züchtung in dem Fermenter wird 4 Tage unter Belüftung und
Rühren (150 U/min; Belüftung 80 Liter/min) bei 300C durchgeführt.
Die erhaltene Gärmaische wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt und 30 Minuten
gerührt. Sodann werden etwa 7 kg einer Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600) eingetragen und die Zellen abfiltriert. Das
Filtrat wird mit 6 η Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit etwa 20 Liter eines Kationenharzaustauschers
in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Die durch das Austauscherbett abfließende Flüssigkeit wird verworfen. Aktive
Verbindungen sind am Austauscher adsorbiert. Nach dem Waschen des Austauscherbetts mit Wasser werden die adsorbierten
aktiven Verbindungen sait 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert.
^ Die Aktivität" des Eluats wird durch ein Antibiogramm nach der J
409845/1113
r ■ -ι
Testplättchenmethode auf einer Agarplatte und mit Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt,
und das Gemisch wird unter vermindertem Druck auf etwa 1 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit 500 ml
eines Anionenharzaustauschers in der OH"-Form gegeben. Sodann
wird das Austauscherbett mit etwa 2 Liter Wasser gewaschen, um Verunreinigungen abzutrennen. Die aktiven Verbindungen v/erden
mit Wasser eluiert, die aktiven Fraktionen gesammelt und unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml eingedampft. Sodann
wird das Konzentrat auf eine mit etwa 50 ml pulverisierte Aktivkohle gefüllte Kolonne gegeben. Die aktiven Verbindungen werden
an der Aktivkohle "adsorbiert. Die Kolonne wird mit Wasser ausgewaschen^und
das abfließende Wasser und das Waschwasser wird verworfen. Sodann werden die adsorbierten aktiven Verbindungen
mit 0,2 η Schwefelsäure eluiert. Die Aktivität des Eluats wird nach der Testplättchenmethode am Bacillus subtilis bestimmt.
Die aktiven Fraktionen werden gesammelt. Die erhaltenen Fraktionen werden auf eine mit einem Anionenharzaustauscher in der
OH"-Form gefüllte Kolonne gegeben. Die aktiven Verbindungen werden sodann mit Wasser eluiert, die aktiven Fraktionen gesammelt
und auf etwa 50 ml eingedampft. Das erhaltene Konzentrat wird lyophilisiert. Es wird ein pulveriges Rohprodukt erhalten,
das Fortimicin B enthält. Die Ausbeute beträgt etwa 32 g. Das Rohprodukt besitzt eine Aktivität von 680 Einheiten/
mg (die Aktivität von 1 mg reiner Verbindung entspricht .· 1000 Einheiten).
Das erhaltene Rohproduktpulver v/ird gleichmäßig auf den Kopf einer mit 1 Liter Kieselgel dicht gefüllten Kolonne aus Glas ,
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Γ - *5 - Π
gegeben. Die Kieselgelkolonne wird folgendermaßen hergestellt: Zunächst wird das Kieselgel in einem Lösungsmittelgemisch aus
Chloroform, Isopropanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (Volumenverhältnis 2:1 : 1) suspendiert. Die Suspension
wird in die Kolonne in gleichmäßiger Schicht eingefüllt und sodann mit dem gleichen Lösungsmittel gut gewaschen. Hierauf wird
das Rohproduktpulver in den Kopf der Kolonne eingefüllt. Sodann wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch eluiert, das
langsam in den Kolonnenkopf eingespeist wird. Danach wird das · Eluieren bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 50 ml/Std.
fortgesetzt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 20 ml gesammelt. Die Aktivität jeder Fraktion wird nach der Test-.
plättchenmethode bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie unterworfen, und die Fortimicin B enthaltenden
Fraktionen werden gesammelt. Fortimicin B ist die aktive
Komponente, die zu Beginn aus der Kolonne eluiert wird. Beim weiteren Eluieren werden andere Nebenprodukte, einschließlich
des Antibiotikums XK-70-1, die im Rohproduktpulver enthalten
sind, eluiert. Die Fortimicin B enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
Das Konzentrat wird sodann in wenig Wasser gelöst und gefriergetrocknet. Es werden 1,5 g Fortimicin B als freie Base
erhalten. Die Aktivität des Präparats beträgt 965 Einheiten/mg.
Der in Beispiel 1 verwendete Stamm wird als Einsaatstamm verwendet.
Es wird ferner ein Einsaatmedium für die vier Stufen
der Vorkultur verwendet, das 1 Prozent Glucose, 1 Prozent lösliche Stärke, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 0,5 Prozent Pepton
Λ09845/1113
und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Die vier Vorkulturen
werden gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Sodann werden 15 Liter
der vierten Vorkulturbrühe in 150 Liter eines fünften Vorkulturmediums
der gleichen Zusammensetzung in einem 300 Liter fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Die Züchtung in diesem
Fermenter wird 2 Tage unter Be3.üftung und Rühren bei 30°C durchgeführt. Hierauf werden 150 Liter der fünften Vorkulturbrühe
in 1200 Liter eines Nährmediums in einem 2000 Liter fassenden Tankfermenter überimpft. Dieses Nährmedium enthält
4 Prozent lösliche Stärke, 3 Prozent gepulverte Trockenhefe (Ebios), 0,05 Prozent K2HPO5, 0,05 Prozent MgSO^.7H2O,
0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO3. Die Fermentation wird
4 Tage unter Belüftung und Rühren bei 370C durchgeführt. Die
Produktion an aktiven Verbindungen erreicht 96 Stunden nach Beginn
der Züchtung ein Maximum. Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das Fortimicin B
in gleicher Weise isoliert und gereinigt. Ausbeute 34 g eines Präparats mit einer Aktivität von 950 Einheiten/mg.
Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora Mm 744,
KY1OO67 (ATCC 31009; FERM-P 2193) verwendet. Als Einsaatmedium
für die erste bis vierte Vorkultur wird ein Nährmedium verwendet, das 2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Pepton, 0,3 Prozent Hefeextrakt
und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthält. Vor der
Sterilisation wurde das Nährmediura auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. Die erste bis vierte Vorkultur wird gemäß Beispiel
1 durchgeführt. Sodann werden 15 Liter der vierten Vorkulturbrühe
in 150 Liter eines Nährmediums in einem 300 Liter
409845/1113
fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Dieses Nährmedium enthält 2 Prozent lösliche Stärke, 0,5 Prozent Sojabohnerimehl,
2 Prozent Glucose,» 1 Prozent Maisquellwasser, 1 Prozent Hefeextrakt,
0,05 Prozent K2HPO^, 0,05 Prozent MgS04.7H20,
0,03 Prozent KCl und 0,1 Prozent CaCO5. Vor der Sterilisation
wurde das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Züchtung wird 4 Tage unter Belüftung und Rühren (150 ü/min;
Belüftungsgeschwindigkeit 80 Liter/min) bei 300C durchgeführt.
Nach beendeter Züchtung wird die Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das Fortimicin B isoliert und gereinigt.
Ausbeute 1,3 g eines Präparats mit einer Aktivität von 962 Einheiten/mg.
Beispiel 4 ·
Als Einsaatstamm wird Micromonospora olivoasterospora MKr80,
KY 11055 (ATCC 31010; FERM-P 2192) verwendet. Als Einsaatmediura für die erste bis fünfte Vorkultur wird ein Nährmedium
verwendet, das 1 Prozent Glucose, 1 Prozent lösliche Stärke, 0,5 Prozent Hefeextrakt, 0,5 Prozent Pepton und 0,1 Prozent
Calciumcarbonat enthält. Der pH-Wert des Nährmediums wurde vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt. Die erste bis fünfte
Vorkultur wird gemäß Beispiel 2 durchgeführt. Sodann werden
150 Liter der fünften Vorkulturbrühe in 1200 Liter eines Nährmediuias
in einem 2000 Liter fassenden Tankfermenter überimpft. Dieses Nährmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie die des
Beispiels 1. Die Züchtung wird 4 Tage unter .Belüftung und Rühren
bei 30°C durchgeführt. Nach beendeter Züchtung wird die
Gärmaische gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und das Fortimicin B abgetrennt und gereinigt. Ausbeute 38 g eines Präparats mit
einer Aktivität von 972 Einheiten/mg. ■ j
1113
Claims (8)
1. Fortimicin B der Summenformel ^i5^30^4°5» ^era Molekulargewicht
348, dem Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß
Figur 1, dem Ultrarot-Absorptionsspektrum gemäß Figur 2 und dem NMR-Spektrum gemäß Figur 3, und seine Salze mit Säuren.
Figur 1, dem Ultrarot-Absorptionsspektrum gemäß Figur 2 und dem NMR-Spektrum gemäß Figur 3, und seine Salze mit Säuren.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindimg gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der die Fähigkeit zur Bildung von Fortimicin
B besitzt, in einem Nährmedium züchtet und aus dem Nährmedium die Verbindung isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Art von Micromonospora
olivoasterospora verwendet.
olivoasterospora verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micromonospora olivoasterospora
ATCC 21819t Microraonospora olivoasterospora ATCC 31009 oder Micromonospora olivoasterospora ATCC 3101O verwendet.
ATCC 21819t Microraonospora olivoasterospora ATCC 31009 oder Micromonospora olivoasterospora ATCC 3101O verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 4O0C und einem
pH-Wert um den Neutralpunkt durchführt.
6. Micromonospora olivoasterospora ATCC 21819, 31009 oder
31010 zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis
J 409845/1113
7. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln
und/oder HiIfsstoffen. ' '
8. Verwendung von Fortimicin B als Desinfektionsmittel.
409845/1113
Leerseite
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |