DE1517777C3

DE1517777C3 - Verfahren zur Herstellung von Uricase aus einer mit Harnsäure auf Uricase eingestellten Hefe der Art Candida utilis

Info

Publication number: DE1517777C3
Application number: DE1517777A
Authority: DE
Inventors: Kunio Nara Kano (Japan)
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1965-07-28
Filing date: 1966-07-27
Publication date: 1974-01-10
Also published as: DE1517777B2; DE1517777A1; US3475276A; GB1104197A

Description

1517 7/7

Züchtung kann bei einem pH-Wert von etwa 6 und bei einer Temperatur von 25 bis 30° C unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden. Die zur Züchtung erforderliche Zeit beträgt gewöhnlich · etwa 30 bis 72 Stunden. Wie üblich kann das Medium auch eine kleine Menge an Mineralien, wie Magnesiumsulfat, dibasisches Kaliumphosphat u. dgl. enthalten.

Nach der Züchtung werden die Zellen abgetrennt und aus dem Medium gesammelt. Dies kann auf jede zweckmäßige Weise erfolgen, wie beispielsweise Abtrennung durch Zentrifugieren oder Filtrieren, und anschließendes Waschen mit Wasser.

Die so gezüchtete Hefe wird dann in an sich bekannter Weise auf Harnsäure eingestellt. Diese Einstellung kann durchgeführt werden, indem die Hefezellen mit einem wäßrigen Medium behandelt werden, welches das gleiche sein kann, wie es bei der vorhergehenden Züchtung der Hefe verwendet wurde, das jedoch Harnsäure als Quelle für Stickstoff enthalten muß. Auch die Züchtungsbedingungen der Einstellung können die gleichen sein wie diejenigen der anfänglichen Hefezüchtung.

Die so auf Harnsäure eingestellte Hefe wird dann ' gefroren werden, um sie für eine beliebige lange Zeitspanne zu lagern. Die Temperatur muß irgendeine Temperatur sein, die tiefer liegt als diejenige, bei welcher die nassen Hefezellen gefrieren. So werden die Hefezellen bei einer Temperatur von. —10°C oder darunter gefroren.

Die Zellen der gefrorenen Hefe können zu jedem gewünschten Zeitpunkt zur Extraktion von Uricase verwendet werden. Zur Extraktion wird die gefrorene Hefe aufgetaut und einer Autodigerierung durch Zugabe einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 oder höher, vorzugsweise 7,0 bis 9,15, und einer Konzentration von ¹Z₂₀- bis ¹/_amolar unterzogen und dabei das Gemisch bei einer Temperatur von 15 bis 35°C, vorzugsweise etwa 25°C, stehengelassen. Schließlich wird der Extrakt von dem Gemisch abgetrennt, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird als Phosphatpufferlösung eine Lösung von dibasischem Kalium- oder Natriumphosphat von einem pH-Wert von 7,0 bis 9,15 verwendet.

Uricase kann aus dem Extrakt, ,nachdem dieser von dem Autodigerierungsgemisch mit den Abfallzellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt wurde, in jeder bekannten Weise gewonnen und gewünschtenfalls gereinigt werden, beispielsweise durch Aussalzen, Dialyse oder Gefriertrocknung. So wird beispielsweise, der Uricaseextrakt mit Ammoniumsulfat versetzt, bis er zu 0,3 gesättigt ist, um Verunreinigungen auszufällen, die entfernt werden. Das Filtrat wird weiter mit Ammoniumsulfat versetzt, um Uricase auszufällen, die gesammelt und der Dialyse unterworfen wird. Die dialysierte Flüssigkeit wird gefriergetrocknet, um Uricasepulver zu erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1

Mit Candida utilis 6020 (an der Universität Osaka erhältlich), wurde ein synthetisches Kulturmedium vom pH 6,5 beimpft, das aus 5°/₀ Glucose, 25°/₀ Asparagin, 1% Kaliumphosphat (dibasisches Salz), 3°/₀ Magnesiumsulfat und 4°/₀ Ammoniumsulfat bestand, wonach die Züchtung bei 25° C 3 Tage lang durchgeführt wurde. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt, mit reinem Wasser gewaschen und dann zur Anpassung an Harnsäure in 100 ml eines Züchtungsmediums, das 4 g Glucose, 100 mg dibasisches Kaliumphosphat, 200 mg Magnesiumsulfat und 10 mg Harnsäure je Gramm/Zellen (in feuchtem Zustand) enthielt, etwa 4 Stunden zur Einstellung auf Harnsäure geschüttelt. Die Einstellungszeit, die Zersetzungswirkung auf Harnsäure (Uricaseaktivität) der Zellen und die Veränderung der spezifischen Aktivität der extrahierten Uricase für die entsprechende Zeit waren wie in Tabelle I angegeben. Es wurde gefunden, daß die richtige Einstellungszeit 120 bis 300 Minuten bzw. 180 bis 240 Minuten betrug.

Tabelle I

Uricaseaktivität

(7o)

Spezifische
Aktivität (°/₀)

Einstellungszeit (Minuten)	120	180	240
60	-83	90	100
58	87	100	93
53

51 einer m/10-Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 wurden zu 1 kg auf Harnsäure eingestellter Candida utilis (in feuchtem Zustand), die bei —20° C gelagert war, zugegeben, und das Gemisch wurde etwa 16 Stunden lang bei 25 ⁰C der Autodigerierung belassen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und mit kaltem Wasser gewaschen. Nach Sammeln der überstehenden Flüssigkeit wurden 8,5 1 eines Uricaseextraktes mit einer Uricaseaktivität von 0,34 E/ml, einer Gesamtaktivität von 2900 E und einer spezifischen. Aktivität (Aktivität je Adsorptionseinheit bei 280 ΐημ und 1 cm Sichtweg) von 0,035, erhalten.

Die Beziehung zwischen der Extraktions-Autodigerierungszeit und der Uricaseaktivität ist in Tabelle II angegeben. Die maximale Extraktion hat sich oach etwa 16 Stunden ergeben.

Tabelle II

Extraktionszeit (Stunden)
4 I 8 I 16 I 24 I 48

Uricaseaktivität (%) 30 68 100 "72

Der Extrakt wurde dann fraktioniert mit Ammoniumsulfat ausgesalzen, so daß sich eine Sättigung von 0,3 bis 0,8 ergab, und mit einer Cellophanmembran dialysiert. Beim Gefriertrocknen der dialysierten Flüssigkeit wurden 16,333 g eines Uricasepulvers mit einer Uricaseaktivität von 0,155 E/mg und einer Gesamtaktivität von 2530 E erhalten.

Die oben angegebene Einheit (E) ist diejenige Aktivität, welche Harnsäure mit einer Geschwindigkeit von ΙμΜοΙ/min in Boratpufferlösung von pH 8,5 bei 25⁰C in Allantoin überführt.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch das Autodigerieren unter Zusatz von 51 einer 0,5 m-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 9,15 zu lkg nasser Zellen, welche bei — 20⁰C vorher eingefroren waren, durchgeführt wurde. Der ver-

wendete, auf Harnsäure eingestellte Candida-utilis-Stamm entsprach demjenigen vom Beispiel 1.

Das Gemisch wurde zur Autodigerierung 24 Stunden bei 15° C stehengelassen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt und mit .kaltem Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser wurden gesammelt, wobei 8,51 eines Uricaseextraktes mit einer Uricaseaktivität von 0,22 E/ml einer Gesamtaktivität von 1885 Einheiten und einer spezifischen Aktivität von 0,073 erhalten wurde. ■ · ^;

Die Beziehung zwischen der Extraktions-(Autodigerierungs-)zeit und der Uricaseaktivität ist in der folgenden Tabelle III aufgeführt, wobei die maximale Extraktion bei 24 Stunden erreicht wurde.

Tabelle III

Uricaseaktivität (%)

Extraktionszeit (Stunden) 8 j 16 j 24 j 48 I 72

100

93.

Claims

1 2 zu extrahieren. Bei der Durchführung der AutoPatentansprüche: digerierung unter Zusatz von Mengen anderer Salze wie Ammoniumsulfat, Kochsalz, Kaliumchlorid, Na-

1. Verfahren zur Herstellung von Uricase aus triumsulfat, Natriumzitrat oder Natriumlactat ergab einer mit Harnsäure auf Uricase eingestellten 5 sich keine Extraktionswirkung. Nur die Zugabe einer Hefe der Art Candida utilis, dadurch ge- Phosphatpufferlösung unter den genannten spezi-. kennzeichnet, daß die eingestellte Hefe fischen Bedingungen ist wirksam.

zuerst eingefroren und dann aufgetaut wird, die Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine ausaufgetaute Hefe einer Autodigerierung durch gezeichnete Methode zur Extraktion von Uricase Zugabe einer Phosphatpufferlösung mit einem io in industriellem Maßstab. Alle anderen ExtraktionspH-Wert von 6,5 oder höher, vorzugsweise 7,0 methoden besitzen niedrigere Ausbeuten oder erforbis 9,15, und einer Konzentration von V20- bis dern komplizierte, mühsame Verfahrensschritte. Vainolar unterzogen und dabei das Gemisch bei So wurden verschiedene Extraktionsmethoden untereiner Temperatur von 15 bis 35° C stehengelassen sucht, nämlich

wird und schließlich der Extrakt vom Gemisch 15' j _{die Hefe Wurde unter} Verwendung eines Glasabgetrennt wird. · pulvers zur Zerstörung der Zellen zerkleinert;

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- _{2 die Hefe}. _wurde .„ _einem potter-Elvehien-Homozeichnet, daß als Phosphatpufferlosung eine Lo- ~ _genisator zerstört, und '

sung von dibasischem Kalium- oder Natrium- - ;. _TT * .·/. ...

phosphat von einem pH-Wert von 7,0 bis 9,15 20 ³· die. Hefe wurde eingefroren und aufgetaut, verwendet wird. ' . Bei der Durchführung dieser Methoden wurde

■ · gefunden, daß sie eine niedrigere Ausbeute ergeben

und/oder Verfahrensschritte und Vorrichtungen erfor- - dern, welche in technischem Maßstab unpraktisch

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel- 25 sind, so daß sie praktisch kommerziell und industriell lung von Uricase aus einer mit Harnsäure auf Uricase nicht durchgeführt werden können. Im Gegensatz eingestellten Hefe der Art Candida utilis. zu der aus »Science« 1. c. bekannten Arbeitsweise,

Uricase ist ein Enzym, das zur Heilung von durch bei welcher eine Hughes-Presse und ein Arbeiten Störungen des Harnsäurestoffwechsels hervorgeru- bei Trockeneistemperatur erforderlich sind, genügt fener Gicht wirksam ist und ferner zur Bestimmung 30 es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, eine Einvon Harnsäure im Blut und Urin verwendet wird. friervorrichtung bei —10°C zum Einfrieren der Hefe

Uricase wurde bis jetzt erzeugt, indem es aus zu verwenden. Alle nachfolgenden Operationen köninneren Organen von Tieren, wie Rinderniere und nen bei normaler Zimmertemperatur durchgeführt Schweineleber, extrahiert wurde, jedoch sind die werden, so daß das Verfahren zur Herstellung von tierischen Organe so schwierig als Ausgangsmaterial 35 Uricase in großem Maßstab angewandt werden kann, zu erhalten, daß keine Massenproduktion von Uricase Es ist an sich bekannt, daß ein Enzym aus Hefe

möglich war. Ferner haben Untersuchungen gezeigt, extrahiert werden kann, wenn die Zellen mechanisch daß Uricase in einigen Arten von Bakterien und" zerstört sind. Eine solche Arbeitsweise ist jedoch für Hefen vorliegt. Aus »Science«, Bd. 124 (1956), S. 125/ industrielle bzw. technische Zwecke nicht praktikabel. 126, ist es bereits bekannt, eine Hefe der Gattung 40 Darüber hinaus werden bei einer solchen Arbeits-Torulopis utilis (Candida utilis) durch Behandeln weise noch andere. Substanzen als das gewünschte mit einem Harnsäure enthaltenden wäßrigen Medium Enzym extrahiert, z. B. andere Enzyme, Proteine, so einzustellen, daß Uricase gebildet wird. Ferner Nukleinsäuren, Zucker und niedermolekulare Subist aus der USA.-Patentschrift 2 773 002 eine Selbst- stanzen, so daß eine Reinigungsstufe angeschlossen digerierung von Hefezellen bekannt. Bei dem aus 45 werden muß, die unter Umständen äußerst schwierig »Science« 1. c. bekannten Verfahren wurden die sein kann.

Uricaseaktivitäten in den Hefeextrakten mit einem Die Autodigerierung von Hefe ist ebenfalls an

Boratpuffer von pH = 9,5 bestimmt, wobei der sich bekannt. Es wurde jedoch gefunden, daß die Hefeextrakt mit Hilfe einer bei. Trockeneistempe- Autodigerierung unter den speziellen erfindungs-" ratur betriebenen Hughes-Presse erhalten wurde. 50 gemäßen Bedingungen wesentlich für die wirksame

Es wurde nun gefunden, daß man unter ganz und selektive Extraktion von Uricase ist. Aus diesem bestimmten Bedingungen in einfacher Weise Uricase Grunde ist die Kombination von Einfrieren und aus einer mit Harnsäure auf Uricase eingestellten Auftauen und einer speziellen Autodigerierung we-Hefe der Art Candida utilis herstellen kann. sentlich, um die Extraktion von Uricase in tech-

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung 55 nischem Maßstab wirkungsvoll durchführen zu könen. von Uricase aus einer mit Harnsäure auf Uricase Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung

eingestellten Hefe der Art Candida utilis ist dadurch kann jede Hefe verwendet werden, die zur Gattung gekennzeichnet, daß die eingestellte Hefe zuerst ein- Candida utilis gehört.

gefroren und dann aufgetaut wird, die aufgetaute Die Züchtung der Hefe kann in einer Weise durchHefe einer Autodigerierung durch Zugabe einer 60 geführt werden, die an sich zur Züchtung von Hefen, Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 die zur Gattung Candida utilis gehört, bekannt ist. oder höher, vorzugsweise 7,0 bis 9,15, und einer So wird z. B. ein Medium verwendet, das eine Quelle Konzentration von V20- bis ¹/₂molar unterzogen und für Kohlenstoff, wie Glucose, Rohrzucker, Melasse, dabei das Gemisch bei einer Temperatur von 15 bis Sulfitzellstoffablauge, Maisquellwasser od. dgl. und 35° C stehengelassen wird und schließlich der Extrakt 65 eine Quelle für Stickstoff, wie eine Aminosäure oder vom Gemisch abgetrennt wird. -säuren, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Am-

Die oben aufgeführten Stufen des erfindungs- moniak, Harnstoff od. dgl., enthält. Es kann auch gemäßen Verfahrens sind erforderlich, um Uricase ein synthetisches Medium verwendet werden. Die