DE1517749C3 - Verfahren zur Herstellung von bei Raumtemperatur lange haltbaren Trockenpräparaten der Phosphotransacetylase aus Escherichia coli - Google Patents

Description

Tabelle I \ _;

Beziehung zwischen der Züchtungsdauer von Escherichia coli und der Aktivität der Phosphotransäcetylase

■ .■··. in den Zellen

Züchtungsdauer (Std.) ;..

Spezifische Aktivität des Enzyms²)

2,6
4,0

■4,5

■4,7

6,6

5,3

22
0,5

Erläuterung der Tabelle

!) Erscherichia B würde unter Schütteln bei 37° C in einem Medium mit der vorstehend angegebenen ■ Zusammensetzung gezüchtet. Die Zellen wurden nach den angegebenen Zeiten gesammelt, und die Zellsuspension wurde 20 Minuten der Einwirkung von Ultraschall von 20 kHz ausgesetzt. .Es wurde die Phosphotransacetylase-Aktivität des rohen, durch Zentrifugieren bei 14 000 U/Min erhaltenen Rohextraktes bestimmt.

²) Die Aktivität der Phosphotransäcetylase ist die Menge Acetylphosphrosäure in μ-Mol, die in 15 Minuten bei 25° C in Gegenwart von 5 Einheiten Coenzym A nach der Methode von Stadt mann zersetzt wird; die spezifische Aktivität ist die Aktivität je 1 mg Enzymproein: .', ' ' '

B. Herstellung des Rohexträktes

Bei der Extraktion muß die Zellmebran gebrochen werden, weil die Substanz eine intrazellulare Komponente darstellt. Es ist hinsichtlich der Brechwirkung und der erforderlichen Zeit aiii zweckmäßigsten, die Zellsuspension mit Ultraschallwellen zu behandeln.

Die Phosphotransäcetylase wird nicht desaktiviert, wenn sie mit Ultraschallwellen behandelt wird. Die Zellmembran von Escherichia coli wird fast vollständig gebrochen, wenn man eine Suspension von 1 g trockenen Zellen in 20 ml einer schwach alkalischen Pufferlösung, beispielsweise einer 0,02molaren Kaliumbicarbonatlösung, 5 Minuten bei niedrigen Temperaturen mit Ultraschallwellen mit einer Frequenz von 10 bis 20 kHz, vorzugsweise von 20 kHz, behandelt, wobei das in den Zellen enthaltene Protein in ausreichendem Maße extrahiert wird. Am zweckmäßigsten beträgt die Zeit, während der das Material zur Extraktion des Enzyms mit Ultraschallwellen behandelt wird, 15 bis 20 Minuten, da die spezifische Aktivität des Enzyms bis zu 15 Minuten allmählich ansteigt. Ein Beispiel für die Extraktion ist in Tabelle II angegeben.

Tabelle II
Extraktion von Phosphotransäcetylase

aus Escherichia coli
durch Behandlung mit Ultraschallwellen (Rohextrakt)

Behandlungszeit	Protein *	Spezifische
mit		Aktivität
Ultraschallwellen	0	des Enzyms
0 Minuten	21,3 mg/ml	0
5 Minuten	22,0 mg/ml	3,9
10 Minuten	22,5 mg/ml	4,3
15 Minuten	22,5 mg/ml	4,5
20 Minuten	4,5

750 ηΐμ bestimmt, nachdem die Probe mit einer alkalischen Kupfersulfatlösung und dann mit Folin-Ciocalteu-Reagens zur Farbentwicklung behandelt worden war. .-, . ... ■-.■.-

C, Reinigung

Das in dem nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise hergestellten Rohextrakt enthaltene Protein wurde durch anteilsweise Zugabe von mit Schwefelsäure angesäuerter gesättigter Ammoniumsulfatlösung bei niedriger Temperatur fraktioniert gefällt, und die Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gesammelt. Die nassen Niederschläge, die eine kleine Menge Ammoniumsulfat enthielten, wurden in einer schwach alkalischen Pufferlösung (pH-Wert = 8), wie Tris-hydroxymethylaminomethan- oder Kaliumbicarbonatlösung, aufgelöst.

Die Aktivität der Phosphotransäcetylase, die sich in der bei einem Sättigungsgrad des Ammoniumsulfats von 0,3 bis 0,35 ausgefällten Proteinfraktion angereichert hat (Methode von Hoffmeister) und die spezifische Aktivität sind etwa drei- bis viermal so hoch wie beim Rohextrakt, wie es in Tabelle III angegeben ist. Die Ausbeute an Aktivität auf dieser Stufe beträgt etwa 80 %.

45

Tabelle III

Reinigung von Phosphotransäcetylase
durch fraktionierte Fällung des Rohextraktes

55

Erläuterung der Tabelle

0 1g trockene Zellen wurden in 20 ml 0,02molarer Kaliumbicarbonatlösung suspendiert, und die Suspension wurde während der angegebenen Zeiten mit Ultraschallwellen mit einer Frequenz von 20 kHz behandelt und dann 15 bis 30 Minuten bei 10000 bis 14 000 U/Min, zentrifugiert. In derüberstehenden Flüssigkeit wurden die Proteinmenge und die Enzymaktivität bestimmt.

²) Das Protein wurde colorimetrisch nach der Methode von Lowry bei einer Wellenlänge von

Sättigungsgrad des Ammonium- sulfats	Protein	Aktivität des Enzyms	Spezifische Aktivität
Rohextrakt	100	100	4,66
0 bis 0,3	17,5	16,8	4,56
0,3 bis 0,35	21,5	79,0	16,4
0,35 bis 0,4	23,4	3,0	0,6
0,4 bis 0,5	5,1	0	0
0,5 bis 0,75	3,1	0	0

Erläuterung der Tabelle

Das Protein und die Aktivität des Enzyms wurden nach der bei Tabelle I und II erläuterten Methode bestimmt, die Ergebnisse stellen Relativwerte für jede Fraktion dar, wobei die Werte für den Rohextrakt auf 100 bezogen wurden.

Es ist erwünscht, daß das zur Bestimmung des Coenzyms A verwendete Enzympräparat kein Co-

enzym A enthält. Bisher hat man die Proteinlösung im allgemeinen dialysiert, um die niedrigmolekularen Substanzen daraus zu entfernen. Die Phosphotransacetylase wird jedoch bei der Dialyse oder beim Filtrieren mit einem Dextran-Gel (an Stelle der Dialyse) stark desaktiviert, weshalb diese Behandlungsmethoden nicht zur Entfernung des Coenzyms A angewendet werden können. In der vorveröffentlichten Arbeit, bei der Clostridium kluyveri als Ausgangsmaterial verwendet wurde, wurde das Coenzym A durch Behandlung des Rohextraktes mit Aktivkohle entfernt. Es ist jedoch bekannt, daß der Coenzym-A-Gehalt in den Zellen von Escherichia coli sehr niedrig ist, d. h. nur etwa Ve des Gehalts von Clostridium kluyveri beträgt. Aus diesem Grunde ist keine Behandlung zur Entfernung des Coenzyms A erforderlich. Es wurde experimentell festgestellt, daß auf der Stufe nach dem Fraktionieren mit Ammoniumsulfat fast kein Coenzym A in dem Enzym enthalten war.

D. Konservierung des Enzyms

Wenn man den gemäß den Maßnahmen der obigen Erfindungsdefinition erhaltenen Niederschlag in einer Pufferlösung löst und diese Lösung schließlich der Gefriertrocknung unterwirft, wird ein Trockenpräparat erhalten, welches ohne besondere Vorkehrungen in entfernte Gegenden verschickt werden kann. Wird das so erhaltene Enzymtrockenpräparat bei Raumtemperatur (etwa 25° C) aufbewahrt, so findet man für die Enzymaktivität die in Tabelle IV angegebenen Werte.

Tabelle IV

Konservierungszustand eines Trockenpräparats

von Phosphotransacetylase
von Escherichia coli bei Raumtemperatur

Tage nach der Herstellung

Spezifische Aktivität
des Enzyms

Aufrechterhaltungsgrad der Aktivität

Erläuterung der Tabelle

11,3 11,3

100 100

13 35
11,3 10,9 100 96,5

Den Aufrechterhaltung'sgrad der Aktivität erhält man, wenn man für die Aktivität unmittelbar nach _ der Herstellung des Enzymtrockenpräparats den Wert 100 annimmt.

Claims (25)

1 2

Ziehungen zwischen der Abnormität des Coenzym-A-

Patentanspruch: Stoffwechsels und verschiedenen Krankheiten. Wäre

es möglich, Phosphotransacetylase leicht anzuwen-

Verfahren zur Herstellung von bei Raumtem- den, so könnte das Gebiet der biologischen, bioperatur lange haltbaren Trockenpräparaten der 5 chemischen und medizinischen Forschung über das

Phosphotransacetylase aus Escherichia coli, da- Coenzym A erweitert werden, was eine große Hilfe

durch gekennzeichnet, daß man Zellen für den Fortschritt der medizinischen Forschung

von Escherichia coli in einer schwach alkalischen wäre.

Pufferlösung zum Brechen der Zellmembranen Es ist bekannt, daß Phosphotransacetylase außer

mit Ultraschallwellen behandelt, daß man das im _i0 in Clostridium kluyveri auch in Escherichia coli,

Rohextrakt enthaltene Protein durch anteilweise Lactobacillus delbrueckii und Bacillus megatherium

Zugabe νρη mit Schwefelsäure angesäuerter, ge^ (Nature,. Vol. 179, 1957, S. 103 und 104) enthalten

sättigter Ammoniumsulfatlösung bei niedriger ist. Es wurde gefunden, daß sich Escherichia coli als

. Temperatur fraktioniert fällt und die dabei an- Quelle für Phosphotransacetylase am besten eignet,

fallenden Niederschläge entfernt, daß man die ₁₅ da diese Organismen sehr leicht gehandhabt und ge-

Proteinfraktion, die hierbei schließlich bei einem züchtet werden können, zur Züchtung nur geringe

Sättigungsgrad der Lösung mit Ammoniumsulfat Kosten erforderlich sind, das Enzym leicht aus den

von 0,3 bis 0,35 ausfällt, gewinnt, daß man diesen Zellen extrahiert werden kann und die Reinigung

feuchten, die Phosphotransacetylase und eine äußerst einfach ist. Im vorliegenden. Fall gelang die

kleine Menge Ammoniumsulfat enthaltenden _ao Extraktion und die Reinigung der Phosphotrans-

Niederschlag in einer Pufferlösung löst und diese acetylase aus Escherichia coli und die Herstellung

Lösung schließlich der Gefriertrocknung unter- eines Enzympräparats, das im trockenen Zustand bei

wirft- Raumtemperatur lange lagerfähig war. Das so herge-

- stellte Enzympräparat kann unmittelbar zur Bestim-

25 mung des Coenzyms A verwendet werden, und zwar

einfach, indem man es in einer für die Bestimmungs-

methode vorgeschriebenen Pufferlösung auflöst, weshalb es eine sehr bequeme Substanz für die Wissen-Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her- schaftler darstellt.

stellung eines Trockenpräparats von Phosphotrans- _{3o D}i_e Erfindung besteht nun in einem Verfahren zur acetylase, das bei Raumtemperatur lange haltbar ist, Herstellung von bei Raumtemperatur lange haltbaren aus Escherichia coli. Trockenpräparaten der Phosphotransacetylase aus Bisher wurde Coenzym A nach Methoden be- Escherichia coli und ist dadurch gekennzeichnet, daß stimmt, bei denen Taubenleberextrakte, aus Clostri- _man Zellen von Escherichia coli in einer schwach dium kluyveri extrahierte Phosphotransacetylase, ge- ₃₅ alkalischen Pufferlösung zum Brechen der Zellmemreinigte «-Ketoglutarat-Dehydrogenase und Succinyl- . branen mit Ultraschallwellen behandelt, daß man das Coenzym-A-Deacetylase, gereinigtes Citrat-Spalt- im Rohextrakt enthaltene Protein durch anteilweise enzym und ' Maleatdehydrogenase oder gereinigte Zugabe von mit Schwefelsäure angesäuerter, gesät-Fettsäuren aktivierende Enzyme aus Kalbsleber ver- _ti_gter Ammoniumsulfatlösung bei niedriger Tempewendet wurden. Bei allen diesen Methoden bedient 40 _ratur fraktioniert fällt und die dabei anfallenden man sich enzymatischer Reaktionen, an denen das Niederschläge entfern, daß man die Proteinfraktion, Coenzym A teilnimmt. Unter diesen Methoden ist die _{die hierbei} schließlich bei einem Sättigungsgrad der Methode, bei der Phosphotransacetylase verwendet Lösung mit Ammöniumsulfat von 0,3 bis 0,35 auswird, wegen der hohen Spezifität gegenüber dem zu fällt, gewinnt, daß. man diesen feuchten, die Phösphobestimmenden Coenzym A, wegen der leichten Her- 45 transacetylase und eine kleine Menge Ammoniumstellung des verwendeten Enzyms und wegen der _suif_at enthaltenden Niederschlag in einer Puffer-Einfachheit der Bestimmungsmethode am vorteil- lösung löst und diese Lösung schließlich der Gefrierhaftesten. Um diese Bestimmungsmethode anwenden trocknung unterwirft,
zu können, hat man Phosphotransacetylase bisher

aus Clostridium kluyveri extrahiert und gewonnen 50 Beispiel

(J. Biol. Chem., Vol. 191, 1951, S. 365 bis 576). . _ . . .. ,. , .

Jedoch ist Clostridium kluyveri als Enzymquelle un- ^A· Eschenchia coil als Ausgangsmatenal

günstig, da es zu einer Gruppe von Bakterien gehört, Escherichia coli B wird in einem Medium, das

die ein Nährmedium mit komplizierter Zusammen- χο/₀ Glukose, 0,4% Hefeextrakt, 0,4 % Pepton und

Setzung und vollständig anaerobe Wachstumsbedin- 55 0,8 °/o Dikaliumhydrogenphosphat enthält, etwa

gungen benötigen. Bei der Analysemethode mit die- 6 Stunden bei 37° C unter Schütteln gezüchtet. Eine

sem Enzym ist dessen Herstellung sehr schwierig, allzu lange Züchtung führt zu einer Erniedrigung der

und die Anwendbarkeit der Methode ist weitgehend Enzymausbeute, wie es in Tabelle I angegeben ist.

durch die den Enzymproteinen eigene Instabilität Nach dem Züchten werden die Zellen durch Zen-

beschränkt. Deshalb muß das Enzym zur Zeit noch 60 trifugieren usw. gesammelt und mit destilliertem

von Spezialisten hergestellt werden, deren Aufgabe Wasser gewaschen. Aus den so erhaltenen frischen

an sich die Forschung auf dem Gebiet des Coen- Zellen kann das Enzym unmittelbar durch Ultra-

zymsAist. schallwellen extrahiert werden; die Zellen können

Das Coenzym A ist eine Substanz, die allen Arten aber auch über einen langen Zeitraum als Ausgangs-

von Lebewesen, einschließlich des Menschen, eine 65 material für das Enzym gelagert werden, nachdem sie

wichtige Rolle im Zucker- und Fettstoffwechsel in einer geeigneten Menge destilliertem Wasser sus-

spielt. Viele Biochemiker und klinische Mediziner pendiert und bei niedrigen Temperaturen, beispiels-

beschäftigen sich mit Untersuchungen über die Be- weise durch Gefriertrocknung, getrocknet wurden.