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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum enzymatischen Enthaaren von Häuten. Bei dem alten Enthaarungsverfahren wurden die Häute in ein Bad gebracht, das Calciumhydroxyd und Natriumsulfid enthielt und einen pH-Wert von etwa 12 hatte. Dieses Enthaarungsverfahren ist schädlich für die Haare, die eventuell von kommerziellem Wert sind.
Während der letzten Jahre sind Enthaarungsmittelzusammensetzungen verwendet worden, die proteolytische Enzyme enthalten, und das Enthaaren ist bei einem niedrigeren PH-Wert von 7 bis 10, bei dem die Haare nicht beschädigt werden, durchgeführt worden. Anderseits wird keine erhebliche Quellung der Felle und Häute erreicht, wie es bei dem alten Enthaarungsverfahren der Fall war, was bei der weiteren Verarbeitung der Felle und Häute zu Schwierigkeiten führt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum enzymatischen Enthaaren von geweichten Häuten mit proteolytischen Enzymen in alkalischer Flotte, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Häute mit Enzymen, die eine optimale proteolytische Aktivität gegen Hämoglobin in Gegenwart von Harnstoff bei einem pH-Wert von mindestens 10 zeigen, behandelt werden.
Diese proteolytischen Enzyme sind bisher unbekannt, und ihr Vorhandensein in Enthaarungsmittelzusammen- setzungen stellt eine wesentliche Verbesserung auf diesem Fachgebiet dar.
Während des Stoffwechsels bilden eine grosse Anzahl von bisher unbekannten Bakterien proteolytische Enzyme, die eine schon erwähnte optimale proteolytische Aktivität zeigen.
Aus Proben von Erde, Tierdung und einer Reihe anderer in der Natur vorkommender Quellen haben die Erfinder etwa 100 Bakterienstämme isoliert, sie haben taxonomische Untersuchungen durchgeführt und festgestellt, dass all die bisher unbekannten Bakterien zu der Gattung Bacillus gehörten, dass aber keine von ihnen zu irgendeiner den Erfindern bekannten Art gehörten, und dass sie nach bestem Wissen der Erfinder nicht zu diesen Arten gehörten. Ausserdem gab es innerhalb der gleichen Arten in den meisten Fällen verschiedene Stämme und verschiedene Abarten.
Um die oben genannten, bisher unbekannten Bakterien zu isolieren, wurde ein neuartiges Verfahren verwendet.
Die Proben von Erde, Tierdung und anderen in der Natur vorkommenden Quellen wurden auf Nährmedien und mit einem hohen pH-Wert (9 bis 11) gebracht, und die Bakterien, die unter derartigen alkalischen Bedingungen wachsen können, werden dann isoliert und weiteren Untersuchungen hinsichtlich der Arten und Enzymproduktion unterzogen.
In den meisten Fällen werden auch eine Reihe von verschiedenen Anreicherungsverfahren angewendet.
Anreicherungsverfahren sind den Fachleuten bekannt. Wir können aufHayaishi in"Methods in Enzymology", Bd. l S. 126 bis 131 verweisen. Ein Prinzip besteht darin, eine aus der Natur kommende Probe auf einem Nährmedium mit einer spezifischen und ausgewählten Zusammensetzung, die das Wachstum eines Mikroorganismus begünstigt, der Stoffwechselprodukte mit den gewünschten Eigenschaften erzeugt, wachsen zu lassen. Ein weiteres Prinzip besteht darin, die aus der Natur kommende Probe zusammen mit einer Verbindung, z. B. einem anorganischen Salz, die die Entwicklung des gewünschten Mikroorganismus begünstigt, zu lagern (s. M. A. El-Nakeeb und H. A. Lechevalier, Appl.
Miorobiol., Bd. 11 [1963], S. 75, und danach die Probe auf ein geeignetes Nährmedium, dessen pH-Wert auf Werte zwischen 8 und 12 eingestellt ist, aufzubringen.
Einige der bisher unbekannten Mitglieder der Gattung Bacillus, die isoliert und taxonomisch auf die Erzeugung proteolytischer Enzyme untersucht wurden, sind inderbeiliegenden Tabelle I zusammengefasst, in der die erste Spalte die Bezugszahl der Erfinder, die zweite Spalte die Nummer, unter der das Bakterium bei The National Collection of Industrial Bacteria, Terry Research Station, Aberdeen, Scotland eingetragen wurde, die dritte Spalte die Isolierungsquelle und die vierte Spalte die verwendete Anreicherungsmethode enthält,
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EMI2.1
EMI2.2
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
EMI3.2
<Desc/Clms Page number 4>
inTabelle 1 (Fortsetzung)
EMI4.1
<tb>
<tb> Bezugs-Nr.
<SEP> NCIB-Isolierungsquelle <SEP> Anreicherungsmethode
<tb> Nummer
<tb> C <SEP> 413 <SEP> 10327 <SEP> Lehm <SEP> von <SEP> Wiese, <SEP> Stärkeanreicherung <SEP> (pH <SEP> 11)
<tb> aus <SEP> Ascheberg, <SEP> mit <SEP> anorganischem <SEP> Stickstoff
<tb> Holstein
<tb>
Die taxonomischen Untersuchungen all dieser Mitglieder der Gattung Bacillus wurden durchgeführt, wobei die von Smith, Gordon & Clark in "Aerobic Spore-forming Bacteria", U. S. Department of Agr., Monograph Nr. 16 [1952] beschriebenen Methoden angewendet wurden.
Bis jetzt werden diese Methoden als die geeignetsten angesehen, sie wurden jedoch angesichts der Tatsache, dass alle Nährmedien auf einen viel höheren pH-Wert als die von Smith, Gordon & Clark angegebenen Werte eingestellt werden mussten, da die in Tabelle I aufgeführten Bacillus-Arten bei höheren pH-Werten wachsen, modifiziert.
Die Bakterien können ziemlich genau in morphologische Gruppen eingeteilt werden. Diese Gruppen unterscheiden sich voneinander in einem Masse, dass sie eigentlich getrennte Arten darstellen.
Innerhalb der morphologischen Gruppen werden Schwankungen der biochemischen Reaktionen festgestellt.
Auf Grund dieser Schwankungen sind die Gruppen in Abarten aufgeteilt worden, die von einem oder mehreren Stämmen gebildet werden.
Die taxonomischen Untersuchungen werden in der Beschreibung der österr. Patentschrift Nr. 299101 beschrieben.
Auf Grund der taxonomischen Untersuchungen der Erfinder sollten die in Tabelle I aufgeführten Mitglieder der Gattung Bacillus so klassifiziert werden, wie es aus der Tabelle II hervorgeht.
Tabelle II
EMI4.2
<tb>
<tb> Arten <SEP> Abart <SEP> Stämme
<tb> a <SEP> C <SEP> 300, <SEP> C <SEP> 301, <SEP> C <SEP> 360
<tb> C <SEP> 372, <SEP> C <SEP> 374
<tb> b <SEP> C <SEP> 302, <SEP> C <SEP> 334 <SEP>
<tb> I
<tb> c <SEP> C <SEP> 323, <SEP> C <SEP> 339, <SEP> C <SEP> 352 <SEP>
<tb> C <SEP> 369 <SEP>
<tb> d <SEP> C <SEP> 304, <SEP> C <SEP> 311, <SEP> C <SEP> 335 <SEP>
<tb> , <SEP> f.
<SEP>
<tb> n <SEP> C <SEP> 335, <SEP> C <SEP> 341 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 303, <SEP> C <SEP> 354, <SEP> C <SEP> 357 <SEP>
<tb> C <SEP> 366, <SEP> C <SEP> 367, <SEP> C <SEP> 371 <SEP>
<tb> C <SEP> 357, <SEP> C <SEP> 378 <SEP>
<tb> IV <SEP> b <SEP> C <SEP> 351, <SEP> C <SEP> 356, <SEP> C <SEP> 364 <SEP>
<tb> C376, <SEP> C377, <SEP> C411 <SEP>
<tb> c <SEP> C358, <SEP> C410 <SEP>
<tb> V <SEP> C <SEP> 365, <SEP> C <SEP> 412 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 373 <SEP>
<tb> VI
<tb> b <SEP> C <SEP> 325, <SEP> C <SEP> 413 <SEP>
<tb> VII <SEP> C <SEP> 370
<tb>
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Die proteolytischen Enzyme, die im erfindungsgemässen Verfahren zum Enthaaren von Häuten verwendet werden, können durch aerobe Züchtung irgendwelcher in Tabellen I und II aufgeführten Arten und Stämme erzeugt werden.
Die Züchtung wird in Übereinstimmung mit den in der Fachwelt bekannten Prinzipien durchgeführt, abgesehen davon, dass das Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoffquellen enthält, während der Züchtung bei einem höheren pH-Wert als bisher gehalten wird, u. zw. vorzugsweise zwischen 7,5 und 10, 5.
Die erhaltenen Ausbeuten werden mit Hilfe der bekannten Ansonschen Hämoglobinmethode, s. Journal of General Physiology, Bd. 22 [1939] S. 79 bis 89 bestimmt. In dieser Beschreibung bedeutet eine Anson-Einheit die Menge proteolytischen Enzyms, die Hämoglobin bei einem pH-Wert von 10, 1 und einer Temperatur von 250C während einer Reaktionszeit von 10 min mit einer derartigen Anfangsgeschwindigkeit zersetzt, dass pro Minute eine derartige Menge von nicht mit Trichloressigsäure auszufällenden Spaltprodukten gebildet wird, dass diese Spaltprodukte mit einem Phenolreagenz die gleiche Farbe ergeben wie ein Milliäquivalent Tyrosin.
Das Nährmedium ist in Übereinstimmung mit den im Fachgebiet bekannten Prinzipien zusammengesetzt
EMI5.1
Getreide-, Malz-, Reis-, Sorghummehl usw. Die Kohlehydratkonzentration kann sehr schwanken, d. h. von bis zu 25% bis herunter auf 1 bis 51o, gewöhnlich sind jedoch 8 bis l o geeignet, wobei der Prozentsatz auf Dextrose berechnet ist. Es ist festgestellt worden, dass das Vorhandensein von Kohlehydraten im Nährmedium zur Bildung von sauren Bestandteilen führt, was während der Züchtung in einem Absinken des pH-Wertes resultiert. Da es äusserst wichtig ist, einen pH-Wert des Nährmediums zwischen 7 und 12 während der Züchtung aufrechtzuerhalten, sollten Messungen durchgeführt werden, so dass der pH-Wert nicht für eine längere Zeit während der Züchtung unter 7 sinkt.
Um den pH-Wert innerhalb des erforderlichen Bereiches zu halten, kann eine begrenzte Menge Kohlehydrate zusammen mit einer Puffersubstanz verwendet werden, die den erforderlichen pH-Wert aufrechterhalten kann. Es ist festgestellt worden, dass Karbonate, und besonders Sesquikarbonate, die in dem Medium bis zu einer Konzentration von 0, 2 M verwendet werden, einen pH-Wert von etwa 10,5 bzw. 9,3 hervorrufen können.
Andere Puffersysteme, wie Phosphatpuffer, können ebenfalls verwendet werden.
Es ist ebenfalls möglich, die Züchtung mit einem niedrigen Kohlehydratgehalt zu beginnen und kleine Mengen Kohlehydrate nacheinander während der Züchtung zuzugeben.
Eine dritte Möglichkeit besteht darin, durch Zugabe von verschiedenen basisch reagierenden Substanzen, die auf diesem Fachgebiet verwendet werden, die automatische pH-Regelung einzusetzen.
Die Verwendung von Karbonaten und Sesquikarbonaten als pH-Wert regulierende Substanzen ist sehr nützlich, und es ist überraschend, dass es während der Züchtung möglich ist, diese Verbindungen in den genannten Konzentrationen zu verwenden.
Die Stickstoffquelle in dem Nährmedium kann anorganischer und/oder organischer Art sein. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind manchmal Nitrate und Ammoniumsalze, und von den organischen Stickstoffquellen sind ziemlich viele wegen ihrer Verwendung in Gärvorgängen und bei der Züchtung von Bakterien bekannt. Illustrierende Beispiele sind Sojamehl, Baumwollsamen- und Erdnussmehl, Kasein, zum Quellen von Mais verwendete Flüssigkeit, Hefeextrakte, Harnstoff, Albumin usw.
Daneben sollte das Nährmedium natürlich die üblichen Spurensubstanzen enthalten.
Die Temperatur, bei der die Züchtung stattfindet, liegt normalerweise im gleichen Bereich, der für die Züchtung der bekannten Arten der Gattung Bacillus zur Anwendung kommt. Gewöhnlich ist eine Temperatur zwischen 25 und 550C angebracht. Vorzugsweise liegt die Temperatur zwischen 30 und 40oC.
Da die Züchtung unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden muss, ist es bei der Verwendung von Gär-
EMI5.2
tungsverfahren angewendet wird, ähnlich.
Im allgemeinen wird man nach einer Züchtungszeit von 1 bis 5 Tagen maximale Ausbeuten proteolytischer Enzyme erhalten.
Illustrierende Beispiele geeigneter Züchtungsmedien sind folgende :
1) Medium BPFA mit der folgenden Zusammensetzung :
EMI5.3
<tb>
<tb> Kartoffelmehl <SEP> 50 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Saccharose <SEP> 50 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Gerstenmehl <SEP> 50 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Sojamehl <SEP> 20 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Natriumkaseinat <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> NaHPO. <SEP> IZHO <SEP> 9 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Polyoxypropylenglycol <SEP> (Emulgator) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb>
<Desc/Clms Page number 6>
2) Medium BSX mit der folgenden Zusammensetzung :
EMI6.1
<tb>
<tb> Gerstenmehl <SEP> 100 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Sojamehl <SEP> 30 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb> Polyoxypropylenglykol <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> g/l <SEP> Leitungswasser
<tb>
Diese beiden Medien werden durch Zugabe von Sesquikarbonat oder Natron unter sterilen Bedingungen auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Vor der Sterilisation wird anwesende Stärke mittels Cl-Amylase verflüssigt.
Die beiden Züchtungsmedien BPFA und BSX bringen bei Unterwasserzüchtung in Tanks mit künstlicher Belüftung unter Verwendung von 550 1 fassenden rostfreien Stahltanks die Ergebnisse, die in der Tabelle III, die auch Informationen über die verwendeten Stämme und die Züchtungsbedingungen enthält, zusammengefasst sind.
Tabelle III
EMI6.2
<tb>
<tb> Stamm <SEP> C <SEP> 335 <SEP> C <SEP> 339 <SEP> C <SEP> 351 <SEP>
<tb> Medium <SEP> BPFA <SEP> BPFA <SEP> BSX
<tb> pH-Wert <SEP> vor
<tb> Inokulation <SEP> 10,2 <SEP> 10,5 <SEP> 10,2
<tb> Züchtungstemperatur <SEP> in
<tb> Grad <SEP> Celsius <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34
<tb> cm3 <SEP> Luft/min <SEP> 0,25 <SEP> 0,25 <SEP> 0,3
<tb> Züchtungszeit
<tb> in <SEP> Stunden <SEP> 84 <SEP> 97 <SEP> 83
<tb> Letzter <SEP> pH-Wert <SEP> 9,2 <SEP> 9, <SEP> 1 <SEP> 9,35
<tb> Letzte <SEP> proteolytische
<tb> Aktivität, <SEP> ausgedrückt
<tb> in <SEP> Anson-Einheiten
<tb> pro <SEP> kg <SEP> Substrat <SEP> 40 <SEP> 29 <SEP> 33
<tb>
Mit dem Stamm C 303 wurden in vier Durchgängen bei verschiedenen Bedingungen die in der folgenden Tabelle IV zusammengefassten Ergebnisse erzielt,
Tabelle IV
EMI6.3
<tb>
<tb> Züchtung <SEP> Nr.
<SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Gerstenmehl <SEP> g/l <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 150 <SEP> 200
<tb> Sojamehl <SEP> g/l <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 45 <SEP> 60
<tb> Polyoxypropylenglykol
<tb> ml/l <SEP> 0,03 <SEP> 0,03 <SEP> 0,03 <SEP> 0,03
<tb> Na. <SEP> CCL <SEP> (sterile <SEP> Zugabe <SEP> vor <SEP> der
<tb> Inokulation) <SEP> bis <SEP> 0,2 <SEP> M <SEP> 0,2 <SEP> M <SEP> 0,2 <SEP> M <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> M
<tb> pH <SEP> vor <SEP> der <SEP> Inokulation <SEP> 10,0 <SEP> 10,0 <SEP> 10,35 <SEP> 10,1
<tb> Züchtungstemperatur <SEP> oc <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34 <SEP> 34
<tb> m'Luft/min <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0,3 <SEP> 0,3 <SEP> 0,3
<tb>
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Tabelle IV (Fortsetzung)
EMI7.1
<tb>
<tb> Züchtung <SEP> Nr.
<SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Zf1chtungszeit <SEP> in <SEP> Stunden <SEP> 125 <SEP> 104 <SEP> 113 <SEP> 126
<tb> maximaler <SEP> pH-Wert <SEP> 9, <SEP> 3 <SEP> 9,3 <SEP> 9,6 <SEP> 9,3
<tb> Maximale <SEP> Anson-Einheiten/kg
<tb> 67 <SEP> 80 <SEP> 77 <SEP> 66
<tb>
Die proteolytischenEnzyme können aus der Züchtungsbouillon zurückgewonnen werden, indem die Bouillon zentrifugiert, die Enzyme aus der so erhaltenen Flüssigkeit durch Zugabe von Na30, oder Äthanol ausgefällt, der Niederschlag aus der Flüssigkeit durch Filtern mit Kieselgur als Filtermittel getrennt und der Niederschlag zu einem Pulver getrocknet wird, das die aktiven proteolytischen Enzyme enthält.
Genauere Informationen über die Erzeugung und Zurückgewinnung der proteolytischen Enzyme, die entsprechend der Erfindung zum Enthaaren von Häuten verwendet werden, findet man in der Beschreibung der österr.
Patentschrift Nr. 299101.
Die Analyse der proteolytischen Enzyme, die von den in Tabelle II aufgeführten Stämmen erzeugt werden, hat gezeigt, dass es wesentliche Unterschiede zwischen den Enzymen in bezug auf etliche Eigenschaften gibt.
In bezug auf die proteolytische Aktivität scheint es so, dass die Enzyme in zwei Gruppen oder Arten aufgeteilt werden können, wenn die proteolytische Aktivität nach der Ansonschen Methode bei pH 12 gemessen und in Prozent der Maximalaktivität ausgedrückt wird :
Art 1 : 100 bis 801o
Art 2 : 80 bis 5 Olo
Vorzugsweise sollen zum Enthaaren nach dem erfindungsgemässen Verfahren ein oder mehrere Enzyme von der Art 1 verwendet werden ; jedoch können auch die Enzyme der Art 2 verwendet werden.
Auf dem Fachgebiet ist es bekannt, dass Kalziumionen der Aktivität der meisten proteolytischen Enzyme stabilisieren. Die neuartigen Enzyme, die von den in Tabelle I aufgezählten und in Tabelle II in Arten und Abarten aufgeteilten Bakterien erzeugt wurden, wurden in bezug auf die stabilisierende Wirkung von Kalziumionen in einer Konzentration von 0,01 M bei einem pH-Wert von 10,5 bis 11 untersucht, und die Stabilisierung wurde in Prozent der Restaktivität ausgedrückt, nachdem man das Material 30 min bei 500C stehengelassen hatte.
Die Ergebnisse der Untersuchung auf Enzymarten und die Stabilisierungswirkung der Kalziumionen sind in Tabelle V zusammengefasst, in der "plus" bedeutet, dass die proteolytische Restaktivität beim Fehlen von Kalziumionen unter 8 Wo der entsprechenden Aktivität der Kontrollprobe in Anwesenheit von Kalziumionen liegt, und "minus" bedeutet, dass die proteolytische Restaktivität beim Fehlen von Kalziumionen über 805to der entsprechenden Aktivität der Kontrollprobe in Anwesenheit von Kalziumionen liegt.
Tabelle V
EMI7.2
<tb>
<tb> Arten <SEP> Abarten <SEP> Stämme <SEP> Enzymart <SEP> Ca-Stabilisierung
<tb> a <SEP> C <SEP> 300, <SEP> C <SEP> 301, <SEP> C <SEP> 360, <SEP> 1 <SEP> +++++
<tb> C372, <SEP> C374 <SEP>
<tb> b <SEP> C <SEP> 302, <SEP> C <SEP> 334 <SEP> l-w <SEP>
<tb> c <SEP> C <SEP> 323, <SEP> C <SEP> 339, <SEP> C <SEP> 352, <SEP> 2 <SEP> 8+++
<tb> C369
<tb> d <SEP> C <SEP> 304, <SEP> C <SEP> 311, <SEP> C <SEP> 336 <SEP> 1 <SEP> +++
<tb> II <SEP> C <SEP> 335, <SEP> C <SEP> 341 <SEP> 2 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 303, <SEP> C <SEP> 354, <SEP> C <SEP> 357' <SEP> -l-- <SEP>
<tb> C <SEP> 366, <SEP> C <SEP> 367, <SEP> C <SEP> 371,
<tb> IV <SEP> C <SEP> 375, <SEP> C <SEP> 378 <SEP>
<tb> b <SEP> C <SEP> 351, <SEP> C <SEP> 356, <SEP> C <SEP> 364) <SEP> 1 <SEP> -8---+
<tb> C <SEP> 376, <SEP> C <SEP> 377, <SEP> C <SEP> 41IJ <SEP>
<tb> c <SEP> C <SEP> 358,
<SEP> C <SEP> 410 <SEP> 1 <SEP> -+
<tb>
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Tabelle V (Fortsetzung)
EMI8.1
<tb>
<tb> Arten <SEP> Abarten <SEP> Stämme <SEP> Enzymart <SEP> Ca-Stabilisierung
<tb> V <SEP> C <SEP> 365, <SEP> C <SEP> 412 <SEP> 1 <SEP>
<tb> a <SEP> C <SEP> 373 <SEP> 1... <SEP>
<tb> b <SEP> ba <SEP> C <SEP> 325, <SEP> C <SEP> 413 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> ? <SEP>
<tb> VII <SEP> C370 <SEP> l <SEP>
<tb>
EMI8.2
nur bei PH 12 geprüft, sondern auch bei niedrigeren pH-Werten, um einen detaillierten Eindruck von der proteolytischen Aktivität bei verschiedenen pH-Werten und mehr Informationen über die Aktivität der drei Enzymarten zu gewinnen.
Zum besseren Verständnis verweisen wir auf Fig. 1, die die proteolytische Aktivität des von dem Stamm C 311 erzeugten Enzyms zeigt ; besagtes Enzym gehört zur Art l : Fig. 2, die in gleicher Weise die Aktivität des von dem Stamm C 335 erzeugten Enzyms zeigt ; besagtes Enzym gehört zur Art 2.
Man sollte verstehen, dass der Zweck der Aktivitätskurven, die in den Figuren gezeigt werden, darin besteht, die Unterschiede der Aktivität der drei Arten proteolytischer Enzyme prinzipiell bei unterschiedlichen pH-Werten zu zeigen, und dass die Aktivitätskurve für jede Art sich etwas ändern kann, ohne jedoch ihr charakteristisches Aussehen zu verlieren. Dass es von grossem Nutzen ist, wenn die neuartigen Enzyme in Enthaarungsmittelzusammensetzungen enthalten sind, ist aus den folgenden Prüfungen ersichtlich : a) Stabilität gegenüber Schaumerzeugern
Die Stabilität der das Enzym und verschiedene Schaumerzeuger enthaltenden Lösung wurde bestimmt, wobei drei typische Schaumerzeuger in Konzentrationen verwendet wurden, die den in der Waschlösung verwendeten Konzentration entsprechen.
EMI8.3
<tb>
<tb>
1, <SEP> Seife <SEP> 0,25 <SEP> g/l
<tb> 2, <SEP> DBS <SEP> - <SEP> ein <SEP> Alkyl-Aryl-Sulfonat <SEP>
<tb> (500/0) <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> 3, <SEP> TAS-Talg-Alkohol-Sulfat
<tb> (250/0) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb>
Die Enzymkonzentration betrug C, 1 Anson-Einheit/1. Die Untersuchungsbedingungen waren 30 min bei 50 C und PH 10, das Analysenverfahren war das Nitro-Kasein-Verfahren, s. E. v. Pechmann, Biochemische Zeitschrift, Bd. 321 (195), S. 248 bis 260.
Die Ergebnisse sind in rabelle VI zusammengefasst, wobei die Zahlen folgendermassen zu verstehen sind :
Die Zahl über dem Strich ist der Prozentsatz Restaktivität, wenn man die Analyse sofort nach der Zugabe des Schaumerzeugers durchführt, d. h. diese Zahl zeigt die Anfangsgeschwindigkeit der Inaktivierung an.
Die Zahl unter dem Strich ist der Unterschied zwischen dieser Anfangsrestaktivität und dem prozentualen Anteil der Restaktivität nach 30 min. b) Enzymart
Man hat festgestellt, dass alle Enzympräparate zeitweise oder vollständig durch Phenylmethylsulphonyl - fluorid inhibiert werden, was bedeutet, dass alle Enzyme im aktiven Zentrum Serin haben. c) pH-Stabilität
Mit fünf Enzympräparaten wurde die Stabilität bei verschiedenen pH-Werten unter den folgenden Bedingungen bestimmt :
EMI8.4
<tb>
<tb> Stehenlassen <SEP> : <SEP> 24 <SEP> h <SEP> bei <SEP> 250C
<tb> pH-Werte <SEP> : <SEP> 5-7-8-10-12 <SEP>
<tb> Enzymkonzentration <SEP> :
<SEP> 0,2 <SEP> Anson-Einheiten/l
<tb>
In Tabelle VI ist der pH-Bereich gegeben, in dem eine Restaktivität von 80 bis 10010 festgestellt wurde.
Die Untersuchung der von den Stämmen C 303 und C 347 erzeugten Enzympräparate gegenüber Natriumsulfat zeigte, dass das Enzym gegenüber diesem Reduktionsmittel nicht empfindlich ist. Das könnte darauf hinweisen, dass die S-S-Brücken für die tertiäre Struktur nicht wesentlich sind.
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Tabelle VI
EMI9.1
<tb>
<tb> Stamm <SEP> Enzympräparat <SEP> Aktivität <SEP> Anson-Ein- <SEP> Enzymart
<tb> in <SEP> Pulverform <SEP> heiten/g <SEP> bei <SEP> PH
<tb> g
<tb> C300 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> (10) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 301 <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> (10) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 302 <SEP> 3 <SEP> 0,7 <SEP> (10) <SEP> 1
<tb> C303 <SEP> 600 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 304 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 334 <SEP> 1500 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> (7, <SEP> 5)
<SEP> 1
<tb> C351 <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 354 <SEP> 42 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 360 <SEP> 117 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 364 <SEP> 456 <SEP> 0,9 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 365 <SEP> 2000 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 366 <SEP> 26 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 367 <SEP> 500 <SEP> 2,2 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 370 <SEP> 3000 <SEP> 0,6 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C371 <SEP> 50 <SEP> 1,0 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 372 <SEP> 430 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 376 <SEP> 17 <SEP> 7, <SEP> 8 <SEP> (7, <SEP> 5) <SEP> 1 <SEP>
<tb> C <SEP> 377 <SEP> 213 <SEP> 1,9 <SEP> (7,5) <SEP> 1
<tb> C <SEP> 335 <SEP> 1500 <SEP> 0,3 <SEP> (7,5) <SEP> 2
<tb> C <SEP> 339 <SEP> 217 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> (7, <SEP> 5)
<SEP> 2
<tb> C <SEP> 369 <SEP> 7,2 <SEP> 1,4 <SEP> (7,5) <SEP> 2
<tb>
Tabelle VI (Fortsetzung)
EMI9.2
<tb>
<tb> Stamm <SEP> Stabilität <SEP> Serin <SEP> pH-Stabilität
<tb> Schaumerzeuger
<tb> Seife <SEP> DBS <SEP> TAS <SEP>
<tb> C <SEP> 300 <SEP> 82/71 <SEP> 56/48 <SEP> 7/6 <SEP> + <SEP>
<tb> C301 <SEP> 50/47 <SEP> 35/31 <SEP> 4/2 <SEP> + <SEP>
<tb> C302 <SEP> 59/56 <SEP> 60/- <SEP> 3/1 <SEP> +
<tb> C <SEP> 303 <SEP> 85/50 <SEP> 40/30 <SEP> 23/18 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 0-10,
<SEP> 5 <SEP>
<tb> C304 <SEP> 57/56 <SEP> 34/31 <SEP> 3/0 <SEP> +
<tb> C <SEP> 334 <SEP> 100/83 <SEP> 90/27 <SEP> 93/73 <SEP> +
<tb> C <SEP> 351 <SEP> 93/67 <SEP> 67/50 <SEP> 53/45 <SEP> +
<tb> C <SEP> 354 <SEP> 77/33 <SEP> 60/38 <SEP> 60/53 <SEP> +
<tb> C <SEP> 360 <SEP> 97/94 <SEP> 76/70 <SEP> 75/75 <SEP> +
<tb> C364 <SEP> 81/31 <SEP> 27/11 <SEP> 16/8 <SEP> +
<tb> C <SEP> 365 <SEP> 100/0 <SEP> 72/30 <SEP> 92/48 <SEP> +
<tb> C <SEP> 366 <SEP> 92/42 <SEP> 67/14 <SEP> 68/61 <SEP> +
<tb> C <SEP> 367 <SEP> 88/2 <SEP> 58/34 <SEP> 71/52 <SEP> + <SEP> 5, <SEP> 0-11, <SEP> 0
<tb> C <SEP> 370 <SEP> 94/4 <SEP> 33/15 <SEP> 67/30 <SEP> +
<tb> C371 <SEP> 97/60 <SEP> 70/44 <SEP> 93/57 <SEP> +
<tb> C <SEP> 372 <SEP> 98/95 <SEP> 75/68 <SEP> 87/85 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 0-10,
<SEP> 5
<tb> C <SEP> 376 <SEP> 66/42 <SEP> 25/10 <SEP> 15/12 <SEP> +
<tb> C377 <SEP> 100/10 <SEP> 59/27 <SEP> 74/59 <SEP> +
<tb> C <SEP> 335 <SEP> 95/51 <SEP> 40/32 <SEP> 78/71 <SEP> + <SEP>
<tb> C <SEP> 339 <SEP> 89/10 <SEP> 75/57 <SEP> 83/62 <SEP> + <SEP> 6, <SEP> 3-10, <SEP> 3 <SEP>
<tb> C <SEP> 369 <SEP> 28/28 <SEP> 6/6 <SEP> 0/0 <SEP> +
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Aus Tabelle VI geht hervor, dass eine Anzahl Enzympräparate erstaunliche Stabilitätseigenschaften aufwei- sen.
Im allgemeinen sind die proteolytischen Enzyme in dem Enthaarungsverfahren in Form eines festen oder flüssigen Gemisches der proteolytischen Enzyme und anderer als Träger wirkender Bestandteile enthalten. Wenn die Enzympräparate oder -zusammensetzungen in fester Form vorliegen, können sie aus Körnchen bestehen, in denen die Enzyme, z. B. mit ändern Enzymen oder Substanzen zusammen, die andere für die Nützlichkeit der Enthaarungsmittelzusammensetzungen wertvolle Aktivitäten haben, enthalten sind. Wenn die Enzyme nicht in kristalliner Form verwendet werden, können sie Verunreinigungen organischer Art, z. B. Proteine und Kohlehydrate aus dem Züchtungsmedium, aufweisen.
DieEnzymzusammensetzungen in flüssiger Form können Lösungen oder Suspensionen bilden, die, falls notwendig, Stabilisatoren enthalten können.
Gewöhnlich sind die neuartigen Enzyme in geringen Mengen enthalten. Deswegen weisen Enzympräparate oder -zusammensetzungen normalerweise einen Enzymgehalt von nicht mehr als 10 Gew. -0/0 auf.
Das folgende Experiment illustriert die Wirkung des Vorhandenseins einiger der neuartigen proteolytischen Enzyme in Enthaarungsmittelzusammensetzungen.
EMI10.1
1: Eine gesalzeneschnitten. Die Stücke werden 24 h lang eingeweicht, Fett und Fleisch werden abgekratzt. Dann werden die Hautstücke in 400 ml verschiedener Enzymlösungen, die sich in Gläsern mit einem Fassungsvermögen von 500 ml befinden, gelegt. Die Gläser werden 24 h lang bei 300e im Brutschrank aufbewahrt. Danach werden die Stücke aus den Lösungen herausgenommen, und die Haare werden mit einem Stück Plexiglas abgekratzt. Die Enthaarungswirkung wird an Hand der folgenden Skala eingeschätzt :
1. Leichte und vollständige Entfernung der Haare.
2. Leichte Entfernung der Haare, jedoch bleiben Haarflecken auf der Haut zurück.
3. Keine oder schwierige Entfernung der Haare.
Die verwendeten proteolytischen Enzymlösungen enthalten 1 g Kalziumhydroxyd pro 130 g Wasser. Die Enzymmenge geht aus der folgenden Tabelle VII hervor, die auch die pH-Werte zu Beginn und bei Abschluss des Enthaarungsverfahrens und dessen Ergebnisse enthält.
Tabelle VII
EMI10.2
<tb>
<tb> TS <SEP> ! <SEP> r. <SEP> l <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Enzym <SEP> vom <SEP> Stamm <SEP> Kontrolle <SEP> C <SEP> 303 <SEP> C <SEP> 367 <SEP> C <SEP> 372
<tb> Enzymmenge
<tb> Anson-Einheiten <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 0,5 <SEP> 5 <SEP> 0,5 <SEP> 5
<tb> Anfangs-pH-Wert <SEP> 11,9 <SEP> 11,9 <SEP> 11,9 <SEP> 11,9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 12,0 <SEP> 11, <SEP> 9
<tb> End-pH-Wert <SEP> 11,9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11,8 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> 11,9 <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Ergebnis <SEP> der <SEP> Enthaarung <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 1
<tb>
Ausführungen zu den Beispielen 2 bis 4 :
10 x 10 cm Kuhhautstücke werden bei Raumtemperatur ohne Schütteln in gesättigter Kalklösung, die verschiedene Mengen von Enzymen enthält, stehengelassen.
In entsprechenden Abständen wird der Ablösungsgrad der Haare mit einer einfachen Kratztechnik und unter Abschätzung mit der folgenden willkürlichen Skala festgestellt :
1. vollständige Ablösung
2. stellenweise geringfügig festgehalten
3. ein wenig abgelöst
4. nirgendwo abgelöst.
Die Versuchsbedingungen waren folgende :
Temperatur : zwischen 16 und 250C (normaler Tag-Nacht-Wechsel)
PH-Wert : die gesättigte Kalklösung zeigte anfänglich einen pH-Wert von 12, 3, sank jedoch im Verlaufe des Versuches auf 11, 7 ab,
Zeit : die oben genannten Abschätzungen wurden in 24 h-Intervallen vorgenommen, und die Ablösung war nach etwa 48 bis 65 h vollständig. Die Versuche wurden nach 65 abgebrochen.
Wiederholung : Alle Versuche wurden zweimal wiederholt.
<Desc/Clms Page number 11>
Hinzugefügte Bakterizide : In Beispiel 2 bis4 wurden 0,002% des natriumsalzes der Äthyl-Quecksilbersulfidbenzoesäure als Bakterizid hinzugegeben.
Enzymkonzentration : 0,02, 0, 1 und 1, 0 Gel.-% ergibt den Bereich der Totalzahl von Anson-Einheiten in Lösungen wie folgt :
EMI11.1
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 0, <SEP> 27 <SEP> - <SEP> 13, <SEP> 56
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 0, <SEP> 26-12, <SEP> 96
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 0, <SEP> 42-20, <SEP> 80 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 0, <SEP> 28-13, <SEP> 92
<tb>
Alcalase ist das Warenzeichen und die Handelsbezeichnung für ein proteolytisches Enzym, das durch Kultivierung von Bacillus subtilis Stämmen hergestellt worden ist.
Beispiel 2 :
EMI11.2
<tb>
<tb> Kuhhaut <SEP> : <SEP> Jersey <SEP> Enthaarungsabschätzung
<tb> Enzym <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0,1% <SEP> 1,0%
<tb> Alcalase <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kalk-Kontrolle <SEP> 4
<tb>
Bereich der Anson-Einheiten pro g Kuhhaut (xi03)
EMI11.3
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> - <SEP> 96
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 8-81
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 3, <SEP> 4-117
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2, <SEP> 3-110
<tb>
Beispiel 3 :
EMI11.4
<tb>
<tb> Kuhhaut <SEP> : <SEP> Dänisch <SEP> schwarz <SEP> und <SEP> weiss <SEP> Enthaarungsabschätzung
<tb> Enzyme <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0,1% <SEP> 1,0%
<tb> Alcalase <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kalk-Kontrolle <SEP> 4
<tb>
EMI11.5
EMI11.6
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 1, <SEP> 4-69
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 5-74
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 150 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 79
<tb>
Beispiel 4 :
EMI11.7
<tb>
<tb> Kuhhaut <SEP> :
<SEP> Dänisch <SEP> rot <SEP> Enthaarungsabschätzung
<tb> Enzyme <SEP> 0, <SEP> 02% <SEP> 0,1% <SEP> 1,0%
<tb> Alcalase <SEP> 3 <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 372 <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP>
<tb> Kalk-Kontrolle <SEP> 4
<tb>
Bereich der Anson-Einheiten pro g Kuhhaut (x103)
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb> Alcalase <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> - <SEP> 120 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 303 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> - <SEP> 80 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr. <SEP> C <SEP> 367 <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> - <SEP> 140 <SEP>
<tb> Enzyme <SEP> von <SEP> Bez.-Nr.
<SEP> C <SEP> 372 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 110 <SEP>
<tb>
Zwei Punkte sind ganz klar ersichtlich aus den Resultaten.
1. Die Enzyme entsprechend der Erfindung sind wesentlich stabiler als die alkalische Protease (Bacillus sub- tilis - Art Protease), wenn sehr hohe pH-Werte angewandt werden, z. B. zirka 12, 3.
2. Die Enzyme in dem erfindungsgemässen Verfahren eignen sich ausgezeichnet als Enthaarungsmittel für Häute in einer Kombination mit dem Kalkprozess.
Das Flüssigkeit-pro-Haut-Verhältnis ist beträchtlich höher als es in der Praxis sein würde, aber es war bei der Art der Entwicklung notwendig, dies in den Beispielen so anzuwenden. Der Abfall in pH-Werten ist grösser als es erwartet wurde, und wahrscheinlich würde er praktisch über 12 bleiben.
Bei der industriellen Durchführung würde Gebrauch gemacht werden von der Temperatursteuerung und der Bewegung der Häute während der Enthaarung, wodurch die oben angeführten, in den Beispielen erhaltenen Ergebisse noch gesteigert werden können.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zum enzymatischen Enthaaren von geweichten Häuten mit proteolytischen Enzymen in alkali-
EMI12.2
Aktivität gegen Hämoglobin in Gegenwart von Harnstoff bei einem pH-Wert von mindestens 10 zeigen, behandelt werden.