DE1467833C3

DE1467833C3 - Verfahren zur Herstellung von Desmethyltetracyclinen

Info

Publication number: DE1467833C3
Application number: DE1467833A
Authority: DE
Inventors: Miklos Dr. Budapest Jarai
Original assignee: CHINOIN GYOGYSZER- ES VEGYESZETI TERMEKEK GYARA RT BUDAPEST
Current assignee: CHINOIN GYOGYSZER- ES VEGYESZETI TERMEKEK GYARA RT BUDAPEST
Priority date: 1963-11-05
Filing date: 1964-11-04
Publication date: 1974-05-02
Also published as: DE1467833B2; DE1467833A1; GB1091046A; GB1091045A; DK129243B; AT264710B; DK129243C

Description

H₂N —

.-— SO₈-NH-R (I)

Für die Herstellung von Desmethyltetracyclinen wurden bisher zur Fermentation gewisse Streptomycesaureofaciens-Stämme (Biochem. Biophis. Acta 58, 635 [1962]) verwendet, die einen gewissen Anteil an Desmethyltetracyclin produzieren, oder Chlortetracyciin produzierende Streptomyces-Stämme in Gegenwart von chemischen Verbindungen fermentiert, die den Methylierungsmechanismus des Mikroorganismus blockieren.

Nach den deutschen Auslegeschriften 1 123 086 und 1 140 668 ist es bekannt, zur Blockierung des Methy lierungsmechanismus bei Streptomyces-aureofaciens-Kulturen dem Fermentationsmedium Sulfonamide zuzusetzen, und nach der deutschen Patentschrift 1 178 171 ist es bekannt, bei Chlortetracyciin produzierenden Stämmen im Fermentationsmedium als Methylierungsinhibitor 4-Aminopteroylglutaminsäure zu verwenden. In allen Fällen war mit dem-Zusatz des Methylierungsinhibitors ein starker Rückgang der Antibioticumproduktion verbunden, die nach dem Verfahren der deutschen Auslegeschrift 1 123 086 etwa 200 bis 600 y/ccm und nach dem der deutschen Auslegeschrift 1 140 668 etwa 500 bis 1000 y/ccm beträgt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemischen Herstellung von Desmethyltetracyclinen durch aerobe, submerse Fermentation eines Streptomycesaureofaciens-Stammes in einem Nährmedium sonst üblicher Zusammensetzung, das als Methylierungsinhibitor ein Sulfonamid enthält, und ist dadurch gekennzeichnet, daß als Streptomyces-aureofaciens-Stamm der Stamm CDM-2114 (unter der Nummer 631008/25 beim Nationalen Institut für Hygiene, Budapest, hinterlegt) verwendet wird.

Bei dem gemäß Erfindung eingesetzten Stamm handelt es sich um einen Mikroorganismus, dessen Methylierungsmechanismus bereits blockiert ist. Dieser Stamm ist somit befähigt, auch in Abwesenheit von Sulfonamide!! als Methylierungsinhibitor im verwendet, wobei R ein organisches Radikal bedeutet. Diese Verbindungen können in einer Menge von 6 bis 5000 y/ccm verwendet werden. So kann man z. B. 50 bis 5000, vorzugsweise 400 bis 4000 y/ccm p-Amino-

j₃ benzolsulfonylguanidin und/oder 5 bis 500, vorzugsweise 50 bis 500 y/ccm 2-(p-Aminobenzolsulfonyl)-4-methylthiazol und/oder 10 bis 1000, vorzugsweise 100 bis 1000 y/ccm 2-(p-Aminobenzolsulfonyl)-4,6-dimethylpyrimidin und/oder 10 bis 1000, vorzugsweise

so ,100 bis 1000 y/ccm 2-(p-Aminobenzolsulfonyl)-6-methoxipyridazin verwenden.

Diese Sulfonamide werden nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung innerhalb der ersten 24 Stunden Fermentation im Abstand von 3 Stunden portionsweise zugegeben, wobei darauf zu achten ist, daß das Verhältnis zwischen den als Stoffwechselprodukte entstandenen Protein- und Nucleinsäuren einerseits und den Sulfonamiden andererseits konstant gehalten wird.

Es wurde gefunden, daß die Produktion der Tetracycline bzw. der Beginn der aktiven Methylierung erst zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Fermentationsbeginn einsetzt. Gibt man dagegen — wie bei den vorbekannten Fermentationsverfahren — die Gesamtmenge des Methylierungsinhibitors gleich zu Beginn in das Fermentationsmedium, wirkt sich das nachteilig auf den Proteinstoffwechsel des Mikroorganismus aus, was eine Ausbeuteverminderung zur Folge hat (J. Bacteriol. 82, 615, 1961).

Der für die Fermentation benutzte Nährboden enthält als Kohlenstoffquelle Stärke, Maismehl, als organische Stickstoffquelle Maiseinweichwasser, extrahierten Sonnenblumengrieß, Maismehl, Haselnußmehl und/oder Hefenextrakte. Es können außerdem noch Ammoniumsalze, insbesondere Chloride, Sulfate oder Nitrate, sowie Kaliumsalze, Calciumsalze und Magnesiumsalze, vorteilhaft Kaliumchlorid, Calciumcarbonat, Magnesiumchlorid oder Magnesiumsulfat, dem Nährboden zugesetzt werden.

Der Chlorid- bzw. Bromidionengehalt des Fermentationsmediums sollte bei der Produktion von Desmethylchlortetracyclin bzw. der von Desmethylbromtetracyclin mehr als 50 y/ccm betragen.

Bei der Produktion von Desmethyltetracyclin sollte das Nährmedium weniger als 50 y/ccm Halogen oder Chlorierungsinhibitoren enthalten.

Die Fermentation wird bei etwa 25 bis 30° C, zweckmäßig bei 27°C, durchgeführt. Man kann auch so verfahren, daß man anfangs nur bei 25 bis 26°C fermentiert und anschließend die Temperatur auf 30 bis J 7°C erhöht. Die Dauer der Fermentation beträgt 45 bis 75, vorteilhaft 50 bis 60 Stunden.

Mit dem neuen Streptomyces-aureofaciens-Stamm CDM-2114 können höhere Ausbeuten als mit den vorbekannten Streptomyces-aureofaciens-Stämmen erhalten werden. So konnten z. B. bei 4000 y/ccm Gesamtproduktion etwa 80 % Desmethyltetracyclin-Analoge erhalten werden.

Weitere Einzelheiten des Verfahrens sind in den Beispielen zu finden.

B e i s ρ i e 1 1

Mit 2 ecm einer wäßrigen Sporensuspension des Streptomyces-aureofaciens-Stammes CDM-2114 (10⁷/ccm Sporen) werden in einem 500-ccm-Erlenmayer-Kolben 100 ecm eines Inokulumnährbodens folgender Zusammensetzung beimpft:

Stärke 2,0%

Maiseinweichwasser

(Trockengehalt) 2,0 %

CaCO₃ 0,4%

Palmöl 0,2%

Der pH-Wert beträgt nach der Sterilisierung 6,8. Hieraus wird auf einem Schütteltisch mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 200/min bei 27° C 40 Stunden die Züchtung durchgeführt. Mit 300 ecm des so hergestellten Impfstoffs werden 61 eines Nährbodens folgender Zusammensetzung beimpft:

Stärke 2,8%

Maismehl 4,0%

Maiseinweichwasser 1>2%

extrahierter Sonnenblumengrieß 0,8 %

NH₄NO₃ 0,8%

KNO₃ 0,3%

KCl 0,2%

CaCO₃ 0,8%

Palmöl 0,5%

pH steril 6,2, beimpft. Hierauf werden in der 3., 6., 9., 12., 15., 18. bzw. 24. Stunde der Fermentation steril je 50, 125, 250, 500, 750, 1000 y/ccm, insgesamt also 9,8 g p-Aminobenzolsulfonylguanidin zugesetzt. Die Fermentationsbedingungen sind 27° C, 640 U/min und 6 l/min Lüftung. Nach 60 Stunden werden 2810 y/ccm Desmethylchlortetracyclin, 740 y/ccm Chlortetracyclin und 100 y/ccm Tetracyclin hergestellt.

Beispiel 2

Mit 300 ecm des nach Beispiel 1 hergestellten Impfstoffs werden 6 1 des Nährbodens vom Beispiel 1 beimpft. Hierauf werden in der 3., 6., 9., 12., 15., 18. bzw. 24. Stunde der Fermentation steril 6, 13, 30, 55, 80, 110, 165 y/ccm, also insgesamt 990 mg 2-(p-Aminobenzolsulfonyl)-4-methylthiazol zugesetzt.' Die Fermentationsbedingungen entsprechen denen

ίο vom Beispiel 1. Nach 60 Stunden werden 2510 y/ccm Desmethylchlortetracyclin, 680 y/ccm Chlortetracyclin und etwa 100 y/ccm Tetracyclin produziert.

B ei s ρ i el 3

6 1 eines synthetischen Nährbodens folgender Zusammensetzung werden mit 300 ecm eines nach Beispiel 1 hergestellten Impfstoffes beimpft:

Stärke 4,5%

ao NH₄NO₃ 0,8%

KNO₃ 0,34%

MgSO₄ 0,1%

KH₂PO₁ 0,05%

CaCO₃ 0,6%

MnSO₄... 0,003%

ZnSO₄ 0,01%

FeSO₄ 0,001%

Glutaminsäure 0,1 %

Palmöl 0,3%

Der Nährboden wird mit einem ionenfreien Wasser hergestellt. Der pH-Wert beträgt steril 6,2. Es wird bei 27° C unter Rühren (600 U/min) und Lüftung (6 l/min) fermentiert. In der 3., 6., 9., 12., 15., 18. bzw.

24. Stunde der Fermentation werden auf die Fermentflüssigkeit berechnet 25, 50, 120, 240, 360, 500, 700 y/ccm, also insgesamt 4,2 g p-Aminosulfonylguanidin zugegeben. Nach einer Fermentation von 60 Stunden wurden 1210 y/ccm Desmethyltetracyclin, 350 y/ccm Tetracyclin und etwa 100 y/ccm Desmethylchlortetracyclin erhalten.

Claims

467 833 Patentansprüche:

1. Verfahren zur biochemischen Herstellung von Desmethyltetracyclinen durch aerobe, submerse Fermentation eines Streptomyces-aureofaciens-Stammes in einem Nährmedium sonst üblicher Zusammensetzung, das als Methylierungsinhibitor ein Sulfonamid enthält, dadurch gekennzeichnet, daß als Streptomyces-aureofaciens-Stamm der Stamm CDM-2114 (unter der Nummer 631 008/25 beim Nationalen Institut für Hygiene, Budapest, hinterlegt) verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Sulfonamid portionsweise unter Aufrechterhaltung eines konstanten Verhältnisses zwischen der Menge der zugesetzten Sulfonamide und der als Stoffwechselprodukte entstandenen Proteine und Nucleinsäuren dem Fermentationsmedium zugesetzt wird.

Fermentationsmedium Desmethyltetracycline zu produzieren. Durch. Sulfonamidzusatz zum Fermentationsmedium wird jedoch die Desmethyltetracyclinproduktion gesteigert.
Als Sulfonamide werden Verbindungen der Formel: