DE1916421C3 - Verfahren zur fermentativen Gewinnung von L Senn - Google Patents

Description

erfindungsgemäßen \ er-

-Τ"^Ät'-nidS¹ genoss=, ν .

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermente!·- ^"⁵J" . Kohlenstoffquelle, eine Sticko,■■, ven Gewinnung von i-Serin durch aerobesZüchten yon *S '^ieISJ^ ' _nische Verbindungen u.dgl., die ^, Mikroorganismen in einem hierfür üblichen Nähr- ^^V^en Mikroorganismus in geeignet,, medium bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40 C und Pensen benötigt werden. .

einem pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,5 und anschließende Menge" *ⁿ° ^ „_{e seien} beispielsweise Koh„-Abtrennung des in der Kulturbrühe angere.cherten AIs ^o M Fructose, Maltose, Sacchar. .-

■-Serins. ³° siä_rie sTärkehydrolysate. Melasse, Mannose, üiyce

L-Serin ist eine bekannte Aminosäure, die als Arz- Markt,^ _{ ^ _irgende!neanderegee_ip ' neimittel und Kosmetikum verwendet werden kann. "ⁿ^°™ J „ _wiez. _B.Zuckeralkohole,organ·,«-. :,-L-Serin stellt auch ein wertvolles Zwischenprodukt fur Kohlcnstonq -^ _Milchsäure, Brenztrauhu-. die Herstellung anderer wichtiger Verbindungen, wie ^"'^e%_umarsäure oder Aminosäuren, wie Aspara, μ ζ. B. N-Methy!serin, dar. · 35 saure, * "¹¹¹J_{1 insäure> erw}ähnt. Im FaI1 der ν er

Bisher wurde L-Serin gewonnen durch Synthese von saure ^unü _h, _{vasserstoffas}similierender M.kro. ·. ^ »■:^Seri" ._^U"^d_ lÄiSTSLl^SJ auc-h £ r_m ^de^U;^SkLnen Kohlenwasserstoffe, wie.Paraf

„,,Serin und anschließende Aufspaltung in ^%^_η Kohlenwasserstoffe, wie nParaf,;.

entsprechenden optischen Isomeren. Es sind auch be- rnsmen Kon _{lfraktionen> zu} denen Leicht, .ic,

reits Verfahren bekannt, L-Serin auf .fermentativem ^^er°^sl _r ⁿ _öle ^U _u ⁿ _ndp_araffinölegehören,indemNahrmedu_!m

Wege herzustellen. So ist beispielsweise in der be- 4o «ⁿ*^c™^" Kohlenstoffquelle oder m Komb.nat.on

kanntgemachten japanischen Patentanmeldung 17728/ Js ^{a 1}^¹¹¹S _mehreren der anderen obengenannten

1967 ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von mit eineJ °£er _{ndet werden}. Es kann ent-

L-Serin unter Verwendung von nL-Glycennsaure als ^^oh'^_m^_nzelne Kohlenstoff quelle oder ein Gem.sch

Substrat bekannt. Aus der USA.-Patentschr.ft3 222258 ^"!^„ehrerc-i verwendet werden.

ist bereits ein Verfahren zur Gewinnung von L-Serin 45 ^ν0"^°£Χ^_1ε können verschiedene Arten

durch Züchten eines L-Serin erzeugenden Mikroorga- J ^{s bt}'™q _{hef Salze oder Ve}rbindun-

nismus in einem Kohlenwasserstoffe enthaltenden ^^'^X^ _A^_moniak oder Ammoniumsalze,

Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 20 bs &«f°- _{Q m umch}i_orid, Ammoniumsulf at Amrno-

40⁰C und einem pH-Wert von 5,0 bis 9,5 bekann . w«. ^^m7_mmoniumacetat, Ammoniumphosphat Sowohl das bekannte synthet.sche Verfahren als 50 ~^_ni^_c ^m _arbonat oder natürliche stickstoffhal-

auch die bekannter., vorstehend genannten fennenta- Aj ^nm _B Maisquellwasser, Hefe-

tiven Verfahren jaben jedoch den Nachte.1 daß danach ^^eJ_t ^ub™_h^_trakt, _Pepton, Fischmehl, oder ver-

das .-Serin in einer außerordentl.ch niedrigen Au - ^^f_AS^e _usubstanzen davon, Bouillon, Casein-

hlt id so daß diese Verfahren fur die ^^Ι~^βη^J^ ihbt Reiskle.eextrakt

das .-Serin in einer außerordentl.ch niedrg ^^f_AS_usubstanzen davon, Bouillon, Casein

beute erhalten wird, so daß diese Verfahren fur die ^.^Ι~^βη^J^,^ _Fi_schsubstanz, Reiskle.eextrakt, technische Herstellung von L-Senn nicht gee.gne sind 55 ^^^^jabohnenrückstände oder Abbausubs^n-

Diese suDsian^cii ωικη,» ...^

3,6 mg/1 Kulturbrune, wanrenu uci i«nu,_Uu,.₆ oder in Kombinationen von zwei oder mehreren ver-

Candida tropicalis nach Beispiel 19 dieser Patentschrift 6o wendet werden.

die Ausbeute nur 3,9 mg/1 beträgt. Hinzu kommt, daß Zu den anorganischen Verbindungen, die dem Nähr-

das in dem aus der bekanntgemachten japanischen medium zugesetzt werden können, gehören z. B. Ma-Patentanmeldung bekannten Verfahren eingesetzte gnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihyclrogen-Ausgangsmaterial dl -Glycerinsäure sehr kostspielig phosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulist, worunter die Wirtschaftlichkeit dieses bekannten 65 fat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Verfahrens sehr stark leidet. Zinksulfat, Mangansulfat und Calciumcarbomit.

Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein verbessertes Falls der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganis-

Verfahren zur Herstellung von L-Serin anzugeben, mit mus andere Nährstoffe zu seinem Wachstum benötigt,

sollten natürlich entsprechende Mengen der ?ur Befriedigung der speziellen Bedürfnisse erforderlichen Nährstoffe dem Nährmedium zugcsei/t werden. Diese Nährstoffe sind bisweilen in den dem Medium als Stickstc:ITquelle zugesetzten natürlichen Substanzen enthalten und müssen nicht eigens zuge^cUi werden. Gesebeienfalls können diese Substanzen jedoch dem Medium als solche zugesetzt werden, und sie enthalten Wachstumsfaktoren, wie z. B. Ammiwuiren. Vitamine.

Zusammensetzung der Lösung A:

88 mg/1 Na„B₄O₇- ΙΟΗ,Ο,

37 ma/1 (NH₄I₆Mo₇O.,, · 4H..O.

970me/l FeCl₃-6 Η,θ"

8.8 ma/1 ZnSO₄-7H,0,

2Cmg/l CuSO,-5H.,O,

7.2 mg/1 MnCl, -4H₂O.

Die Kultivierung wird dann unter aerobem Schütteln

. Uli IMInIl^lUM₅

»;-: beispielsweiseThiamin und C obalamin oder Biotin. io der Kultur in dem Fermentationsmedium Dei

Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen. 96 Stunden lang durchgeführt. Dabei wird eine Menge 7. >3. unter aerobem Schütteln der Kultur oder unter
Belüften und Rühren einer Suhmerskukur hei einer

mperatur von beispielsweise etwa 20 bis 40 C und

führt. Um hohe Ausbeuten an : -Serin vii erhalten, K es erwünscht, den pH-Wert des K uli urmediums etwa Mm Neutra.ounkt (7,0) während der KuHmerune zu halten. Nach etwa Ibis 5 Tagen K uliis ierungszeit unter di Bdi hb ih btähtlih Men

von 3 3 nWml T.-Senn Γη der Kühlflüssigkeit gebildet. 1 des nach Entfernen der Mikroorganismenzellen

und der anderen unlöslichen Stoffe aus der Kulturen em pH-Wert von beispielsweise etwa 5 bis 9.5 durch- 15 flüssigkeit enthaltenen Filtrats werden durch eine Ko- *-führt. Um hohe Ausbeuten an : -Serin vii erhalten, lonne mit einem stark sauren kanonischen Poly^tryoi-

austauscherharz gegeben, um das i.-Senn zu adsoi me-

ren. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen und mit

alten. Nach etwa Ibis 5 Tagen K uliis ierungszeit unter Ammoniakwasser eluiert. Die gesammelten i.-sermdiesen Bedingungen haben sich beträchtliche Mengen 20 Fraktionen werden eingeengt. Dabei enthalt man 4.. _{fc t},n i.-Serin gebildet und in der erhaltenen Kulturflüssig- L-Serin-Kristalle. i- eit angereichert. Beispiel 2

Nach beendeter Kultivierung werden die Mikro- . . . , _w.»;~ _Ilnri

„reanismenzellen und unerwünschte Ausfällungen von Die Kultivierung wird in der gleicheniWuse _un a

dir Kulturflüssigkeit abgetrennt, und das 1 .-Serin wird a₅ unter den gleichen Bedingungen ^w'^e "J ^B"^¹ aus der Flüssigkeit auf übliche Weise, beispielsweise durchgeführt, wöbe, diesmal jedoch ein kulturmedium. .lurch lonenaustauscherharzbehandlun,. Extraktion das 5% Sorbit an Stelle des beschnebenen n-AIkangemit Lösungsmitteln, Ausfällung. Adsorption. Chroma- mischs als e.ne Kohlenstoffque Ie in dem F™ta ■ ographie oder Konzentrierung Gewonnen. Eine be- tionsmedium enthalt, verwendet wird. Die Menge an sonders geeignete Abtrennungsmethode ist die Ionen- 30 gebildetem i.-Serin betragt _.J mg mi. austauscherharzbehandlupg, d>e im folgenden Bei- Beispiel 3

spiel 1 beschrieben wird. ,_c ,_ΤΓΓ ->i ->iq

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Arthrobacter paraffines ^{ATCC 2l 2}^'

Erfindung Falls nicht anders angegeben, beziehen sich bildender M.kroorgan.smus der '^ die Prozentgehalte in den Beispielen und der gesamten 35 pimelinsäure oder Ly.in ™^ Beschreibung auf das Gewicht pro Liter Wasser. ^t^rd alsjmpjstamm verwendet.

durchgeführt, wobei diesmal jedoch ein Fermentations-Beispiel 1 medium der folgenden Zusammensetzung verwendet

Als Impfbakterium wird der i.-Serin-bildende Stamm 40 wird:

r-

Arthrobacter paraffineus ATCC 21 218, ein Isoleucin- und Methionin benötigender Mikroorganismus, verwendet. Dieser Stamm wird in 250 ml-Erlenmeyerkolben, die 20 ml eines sterilisierten Impfkulturmediums enthalten, das 2% Sorbit, 1% Fleischextrakt, l°/₀ Pepton, 0,5 °/₀ Hefeextrakt, 0,3 °/₀ NaCl und 50 mg/1 Mesodiaminopimelinsäure enthält, eingeimpft. Die Kultivierung wird unter aerobem Schütteln bei 30° C 24 Stunden lang durchgeführt.

2 ml der dabei erhaltenen Impfkultur werden in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben eingeimpft, der 20ml eines sterilisierten Fermentationsmediums (pH 7,4) der folgenden Zusammensetzung enthält:

5%
2°/o
0,1 °/e
0,1%
0,1%
2%
lmg/1
10 mg/1

5 % n-Alkangemisch (C₁₂ — C₁₄), 2% (NH₄J₂SO₄,

0,1% K₄HPO₄,

0,1% KH₂PO₄,

0,1% MgSO₄-7H₂O,

2% CaCO₃,

1 mg/1 Thiamin,

100 mg/1 L-Methionin,

1 ml/1 Lösung A.

55

60

n-Alkangemisch (Cj, — C₁₁),

(NH₄)₂SO„

KoHPO₄,

KH₂PO₄,

MgSO₁ -7 H₂O,

CaCO,,

Thiamin,

ι» i..₆,. !.-Isoleucin,
100 mg/1 L-Lysin-hydrochlorid, 1 ml/1 Lösung A (vgl. Beispiel 1).

Die Menge an gebildetem L-Serin in der erhaltenen Kühlflüssigkeit beträgt 2,5 mg/ml.

Beispiel 4

Die Kultivierung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 3 durchgeführt, wobei diesmal jedoch ein Kulturmedium, das 5% Sobrit an Stelle des n-Alkangemischs enthält, als eine Kohlenstoffquelle in dem Fermentationsmedium verwendet wird. Die Menge an i.-Serin„ das in der erhaltenen Kulturflüssigkeit gebildet wurde, beträgt 1,8 mg/ml.

Claims (1)

1. dessen Hi.fe.es j^gS

   _auf^ verhältn.srnaBj^emfache ^

   ⁵ "Ten in'" das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

   Verfahren zur fermentative Gewinnung von -.den ^nn ^ _Arthrobacter paraffineus ATCC

   L-Serin durch aerobes Züchten von Mikroorgams- als M e, ^ _{m verwendet}

   men in einem hierfür üblichen Nährmedmm bei Λ Δ* ode _erfindungsgemäßen Verfahrens ist es

   einer Temperatur von etwa 20 bis 40⁰C und einem M ^{H M eQ}. _{f einfach}e und w.rtschafthche .Art

   pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,5 und anschließende i- moglκ£ς Senn _{Ausbeiiten (} ^ ,.

   Abtrennung des in der Kulturbrühe angereicherten und Wto folgenden Beispiele) herzustellen.

   ,,Serins, dadurch gekennzeich netdaß rl _mi i t es nach dem erfindungsgemaßen Verfahren

   man als Mikroorganismus Arthrobacter paraffineus Damit s ^_{n imRahmen eines} großtechn,-

   _ATCC Z, 2, O^ -ATCC „ _Jl9 .— _i A^ ---S ^ί" Si"