CN110699314B - 一种发酵生产6-去甲基四环素的方法 - Google Patents

一种发酵生产6-去甲基四环素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种发酵生产6‑去甲基四环素的方法，其结构式为：

Description

一种发酵生产6-去甲基四环素的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵生产6-去甲基四环素的方法，属于工业微生物技术、发酵工程领域。
背景技术
6-去甲基四环素，四环素类抗生素，是金色链霉菌产生。6-去甲基金霉素与四环素相比，缺失了C-6位置的甲基。是6-去甲基金霉素化学合成法合成米诺环素的中间体。如直接使用发酵法生产的6-去甲基四环素作为其合成的起始原材料，不但能够提高产率，减少甲醇和钯碳等原料使用量，还能够降低副产物产生，有利于米诺环素的清洁生产。目前没有微生物发酵方法生产6-去甲基四环素的报道，无具体生产工艺。盐酸米诺环素为高效、速效、长效的半合成四环素新制剂，抗菌作用为该属中最强，抗菌谱与多西环素相似，具有高效广谱，有效剂量低，口服吸收迅速，体内分布广及长效等优点。近年来，对于其研究的深入，科学家发现了其除了有很好的抗菌作用外，还具有其它一些生物学的特征，其在抗炎症、免疫抑制、抑制皮脂分泌、抗胶原酶活性等方面也有很好的作用。而且米诺环素治疗其它疾病的新作用也被越来越多的发现以及研究，特别是在治疗类风湿关节炎上，不仅有效而且不良反应少。
米诺环素是半合成的四环素类抗生素。抗菌谱与四环素相近，具有高效和长效性质。在四环素类中该品抗菌作用最强。
Figure BDA0002243259050000011
鉴于此，开发了一种发酵法生产6-去甲基四环素的方法。
发明内容
本发明是为解决去6-甲基四环素发酵效价低，不适用于生产的缺陷，得到了一种新的培养基和补料配方，提高了6-去甲基四环素发酵水平的方法。
为实现提高6-去甲基四环素发酵效价，技术方法如下：
1、斜面培养基组成：
培养基组成为W/V：麸皮1.5-3％，琼脂1.5-2.5％，磷酸氢二钾0.005-0.015％，磷酸氢二铵0.005-0.015％，pH自然。
2、种子罐组成：
种子罐培养基为W/V：玉米粉1.0-2.5％，麦芽糊精1.0-2.0％，酱油豆粕粉1.5-3.5％，棉籽饼粉0.5-1.0％，玉米浆0.5-1.5％，硫酸铵0.5-1.0％，轻质碳酸钙0.5-1.0％，溴化镁0.15-0.25％，消泡剂0.01-0.03％，剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成：
发酵罐组成为W/V：玉米粉6.0-8.0％，麦芽糊精1.0-2.0％，酱油豆粕粉3.0-4.0％，棉籽饼粉0.5-1.5％，玉米浆0.5-1.5％，硫酸铵0.5-1.0％，轻质碳酸钙0.5-0.7％，溴化镁0.15-0.25％，M-促进剂0.0015-0.0025％，α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.01％，消泡剂0.01-0.03％，剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比：
补料配比W/V：玉米淀粉40-50％，玉米浆0.5-1.5％磷酸镁0-0.2％，溴化镁0.15-0.25％，M-促进剂0.002％，α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.01-0.03％，pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产，通过补料进行工艺控制，其特征为：
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中，pH6.5-7.5，培养温度31.5℃-32.5℃，培养5-7天，至斜面孢子呈白色，孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中，接种量为1个斜面/200L，培养温度31.5-32.5℃，通气量为0.6-1.2v/v/min，转速为150rpm-350rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％，培养28-36h，离心固形物含量达到20％以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中，种子体积/接种后的发酵罐体积＝0.08，培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃，26-80h 29.5℃30.5℃，81h-放罐31.5℃-32.5℃；发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1，26-80h 5.8-6.0，81h-放罐5.7-5.9，通气量0.6-1.2v/v/min，转速150rpm-550rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL，81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL，101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡，81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
采用上述技术方案本发明取得的技术进步是：
本发明提供的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法，6-去甲基四环素发酵前期代谢较快，主要为菌丝生长，主要快速利用速效氮源和溶磷，同时消耗大量的氧气，需要通过提高通气比、提高搅拌转速来提高溶氧。伴随速效效氮源和溶磷的消耗完毕，温度的下调，耗氧量逐渐下降，菌体转入次级代谢，发酵液颜色转入深棕色、棕黑色，伴随氨水、补料的补入，溶氧、pH逐渐稳定，合成产物合成加速。
本发明根据6-去甲基四环素代谢特点，根据单罐产量最大化的理念，将配方中的关键物质进行调整；并通过补料添加磷酸镁，防止因玉米浆等原材料原因，造成发酵过程中溶磷浓度的变化，继续提高发酵单位。实验证明，优化后的发酵罐培养基和补料配方，能够有效提高6-去甲基四环素发酵单位，比原始发酵工艺提高774％，本发明提高6-去甲基四环素的方法比较简单，且容易实现，可以作为其他四环素类发酵的参考。
具体实施方式
附图说明
图1是本发明原发酵方法液相色谱图；
图2是6-去甲基四环素标准品液相色谱图；
图3是本发明方法6-去甲基四环素液相色谱图。
实例1：
1、斜面培养基组成：
培养基组成为W/V：麸皮1.5％，琼脂1.5％，磷酸氢二钾0.005％，磷酸氢二铵0.005％，pH自然。
2、种子罐组成：
种子罐培养基为W/V：玉米粉1.0％，麦芽糊精1.0％，酱油豆粕粉1.5％，棉籽饼粉0.5％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，轻质碳酸钙0.5％，溴化镁0.15％，消泡剂0.01％，剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成：
发酵罐组成为W/V：玉米粉6.0％，麦芽糊精1.0％，酱油豆粕粉3.0％，棉籽饼粉0.5％，玉米浆0.5％，硫酸铵0.5％，轻质碳酸钙0.5％，溴化镁0.15％，M-促进剂0.0015％，α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.01％，消泡剂0.01％，剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比：
补料配比W/V：玉米淀粉40％，玉米浆0.5％磷酸镁0％，溴化镁0.15％，M-促进剂0.002％，α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.01％，pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产6-去甲基四环素生产，通过补料进行工艺控制，其特征为：
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中，pH6.5-7.5，培养温度31.5℃-32.5℃，培养5-7天，至斜面孢子呈白色，孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中，接种量为1个斜面/200L，培养温度31.5-32.5℃，通气量为0.6-1.2v/v/min，转速为150rpm-350rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％，培养28-36h，离心固形物含量达到20％以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中，种子体积/接种后的发酵罐体积＝0.08，培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃，26-80h 29.5℃-30.5℃，81h-放罐31.5℃-32.5℃；发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1，26-80h 5.8-6.0，81h-放罐5.7-5.9，通气量0.6-1.2v/v/min，转速150rpm-550rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL，81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL，101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡，81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据：
发酵周期小时 发酵单位微克/毫升
实验例1 186 3832
对照例 186 623
实例2：
1、斜面培养基组成：
培养基组成为W/V：麸皮2.2％，琼脂2.0％，磷酸氢二钾0.01％，磷酸氢二铵0.01％，pH自然。
2、种子罐组成：
种子罐培养基为W/V：玉米粉1.7％，麦芽糊精1.5％，酱油豆粕粉2.0％，棉籽饼粉0.75％，玉米浆1.0％，硫酸铵0.75％，轻质碳酸钙0.75％，溴化镁0.20％，消泡剂0.02％，剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成：
发酵罐组成为W/V：玉米粉7.0％，麦芽糊精1.5％，酱油豆粕粉3.5％，棉籽饼粉1.0％，玉米浆1.0％，硫酸铵0.75％，轻质碳酸钙0.6％，溴化镁0.20％，M-促进剂0.0020％，α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.02％，剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比：
补料配比W/V：玉米淀粉45％，玉米浆1.0％磷酸镁0％，溴化镁0.20％，M-促进剂0.002％，α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.02％，pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产，通过补料进行工艺控制，其特征为：
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中，pH6.5-7.5，培养温度31.5℃-32.5℃，培养5-7天，至斜面孢子呈白色，孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中，接种量为1个斜面/200L，培养温度31.5-32.5℃，通气量为0.6-1.2v/v/min，转速为150rpm-350rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％，培养28-36h，离心固形物含量达到20％以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中，种子体积/接种后的发酵罐体积＝0.08，培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃，26-80h 29.5℃-30.5℃，81h-放罐31.5℃-32.5℃；发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1，26-80h 5.8-6.0，81h-放罐5.7-5.9，通气量0.6-1.2v/v/min，转速150rpm-550rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL，81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL，101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡，81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据：
发酵周期小时 发酵单位微克/毫升
实验例2 186 4673
对照例 186 623
实例3：
1、斜面培养基组成：
培养基组成为W/V：麸皮3％，琼脂2.5％，磷酸氢二钾0.015％，磷酸氢二铵0.005-0.015％，pH自然。
2、种子罐组成：
种子罐培养基为W/V：玉米粉2.5％，麦芽糊精2.0％，酱油豆粕粉3.5％，棉籽饼粉1.0％，玉米浆1.5％，硫酸铵1.0％，轻质碳酸钙1.0％，溴化镁0.15-0.25％，消泡剂0.03％，剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成：
发酵罐组成为W/V：玉米粉8.0％，麦芽糊精2.0％，酱油豆粕粉4.0％，棉籽饼粉1.5％，玉米浆1.5％，硫酸铵1.0％，轻质碳酸钙0.7％，溴化镁0.25％，M-促进剂0.0025％，α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.01％，消泡剂0.01-0.03％，剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比：
补料配比W/V：玉米淀粉50％，玉米浆1.5％磷酸镁0％，溴化镁0.25％，M-促进剂0.002％，α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.03％，pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产，通过补料进行工艺控制，其特征为：
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中，pH6.5-7.5，培养温度31.5℃-32.5℃，培养5-7天，至斜面孢子呈白色，孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中，接种量为1个斜面/200L，培养温度31.5-32.5℃，通气量为0.6-1.2v/v/min，转速为150rpm-350rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％，培养28-36h，离心固形物含量达到20％以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中，种子体积/接种后的发酵罐体积＝0.08，培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃，26-80h 29.5℃-30.5℃，81h-放罐31.5℃-32.5℃；发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1，26-80h 5.8-6.0，81h-放罐5.7-5.9，通气量0.6-1.2v/v/min，转速150rpm-550rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL，81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL，101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡，81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据
发酵周期小时 发酵单位微克/毫升
实验例3 186 4562
对照例 186 623
实例4：
1、斜面培养基组成：
培养基组成为W/V：麸皮2.2％，琼脂2.0％，磷酸氢二钾0.010％，磷酸氢二铵0.010％，pH自然。
2、种子罐组成：
种子罐培养基为W/V：玉米粉1.7％，麦芽糊精1.5％，酱油豆粕粉2.0％，棉籽饼粉0.75％，玉米浆1.0％，硫酸铵0.75％，轻质碳酸钙0.75％，溴化镁0.20％，消泡剂0.02％，剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成：
发酵罐组成为W/V：玉米粉7.0％，麦芽糊精1.5％，酱油豆粕粉3.5％，棉籽饼粉1.0％，玉米浆1.0％，硫酸铵0.75％，轻质碳酸钙0.6％，溴化镁0.20％，M-促进剂0.0020％，α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.02％，剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比：
补料配比W/V：玉米淀粉40-50％，玉米浆0.5-1.5％，磷酸镁0.10％，溴化镁0.15-0.25％，M-促进剂0.002％，α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.01-0.03％，pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产，通过补料进行工艺控制，其特征为：
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中，pH6.5-7.5，培养温度31.5℃-32.5℃，培养5-7天，至斜面孢子呈白色，孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中，接种量为1个斜面/200L，培养温度31.5-32.5℃，通气量为0.6-1.2v/v/min，转速为150rpm-350rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％，培养28-36h，离心固形物含量达到20％以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中，种子体积/接种后的发酵罐体积＝0.08，培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃，26-80h 29.5℃-30.5℃，81h-放罐31.5℃-32.5℃；发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1，26-80h 5.8-6.0，81h-放罐5.7-5.9，通气量0.6-1.2v/v/min，转速150rpm-550rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL，81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL，101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡，81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据
发酵周期小时 发酵单位微克/毫升
实验例4 186 4825
对照例 186 623
实例5：
1、斜面培养基组成：
培养基组成为W/V：麸皮2.2％，琼脂2.0％，磷酸氢二钾0.010％，磷酸氢二铵0.010％，pH自然。
2、种子罐组成：
种子罐培养基为W/V：玉米粉1.7％，麦芽糊精1.5％，酱油豆粕粉2.0％，棉籽饼粉0.75％，玉米浆1.0％，硫酸铵0.75％，轻质碳酸钙0.75％，溴化镁0.20％，消泡剂0.02％，剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成：
发酵罐组成为W/V：玉米粉7.0％，麦芽糊精1.5％，酱油豆粕粉3.5％，棉籽饼粉1.0％，玉米浆1.0％，硫酸铵0.75％，轻质碳酸钙0.6％，溴化镁0.20％，M-促进剂0.0020％，α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.02％，剩余配比均为水。pH自然。
3、发酵罐组成：
发酵罐组成为W/V：玉米粉7.0％，麦芽糊精1.5％，酱油豆粕粉3.5％，棉籽饼粉1.0％，玉米浆1.0％，硫酸铵0.75％，轻质碳酸钙0.6％，溴化镁0.20％，M-促进剂0.0020％，α淀粉酶(玉米粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.02％，剩余配比均为水。pH自然。
4、补料配比：
补料配比W/V：玉米淀粉40-50％，玉米浆0.5-1.5％磷酸镁0.20％，溴化镁0.15-0.25％，M-促进剂0.002％，α淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.02％，消泡剂0.01-0.03％，pH自然。
5、使用以上培养基发酵生产去6-甲基四环素生产，通过补料进行工艺控制，其特征为：
5.1、将6-去甲基四环素产生菌金色链霉菌由沙土管接种到斜面培养基中，pH6.5-7.5，培养温度31.5℃-32.5℃，培养5-7天，至斜面孢子呈白色，孢子成熟。
5.2、将成熟孢子接入种子罐中，接种量为1个斜面/200L，培养温度31.5-32.5℃，通气量为0.6-1.2v/v/min，转速为150rpm-350rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％，培养28-36h，离心固形物含量达到20％以上即达到移种条件。
5.3、将以上合格种子转入灭后发酵罐中，种子体积/接种后的发酵罐体积＝0.08，培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃，26-80h 29.5℃-30.5℃，81h-放罐31.5℃-32.5℃；发酵过程使用氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1，26-80h 5.8-6.0，81h-放罐5.7-5.9，通气量0.6-1.2v/v/min，转速150rpm-550rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20％。通过补加补料控制总糖浓度0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL，81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL，101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.4、0-80补加灭菌后的大豆油消泡，81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
6、试验结果数据：
发酵周期小时 发酵单位微克/毫升
实验例5 186 4803
对照例 186 623

Claims (5)

1.一种发酵生产6-去甲基四环素的方法，其特征在于所述生产方法如下：首先将金色链霉菌接种在斜面培养基上，待孢子成熟，转入种子培养基中培养，种子培养完成后转入发酵罐培养基中，补料培养至放罐；
所述种子罐培养基配比W/V为：玉米粉 1.0-2.5%，麦芽糊精 1.0-2.0%，酱油豆粕粉1.5-3.5%，棉籽饼粉 0.5-1.0%，玉米浆 0.5-1.5%，硫酸铵 0.5-1.0%轻质碳酸钙 0.5-1.0%，溴化镁 0.15-0.25%，消泡剂 0.01-0.03%，剩余配比均为水；
所述发酵培养基配比W/V为：玉米粉6.0-8.0%，麦芽糊精1.0-2.0%，酱油豆粕粉3.0-4.0%，棉籽饼粉0.5-1.5%，玉米浆0.5-1.5%，硫酸铵0.5-1.0%，轻质碳酸钙0.5-1.0%，溴化镁0.15-0.25%，M-促进剂0.0015-0.0025%，α淀粉酶的用量为玉米粉用量质量百分比的0.01%，消泡剂0.01-0.03%，剩余配比为水；
所述补料配比W/V为：玉米淀粉40-50%，玉米浆0.5-1.5%，磷酸镁0.0-0.20%，溴化镁0.15-0.25%，M-促进剂0.002%，α淀粉酶为玉米淀粉用量质量百分比的0.02%，消泡剂0.01-0.03%，剩余配比均为水。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法，其特征在于：所述种子培养条件，特征为：培养温度31.5℃-32.5℃，通气量为0.6-1.0v/v/min，搅拌转速150rpm-350rpm，罐压0.04Mpa，控制溶氧高于20%，培养28-36h。
3.根据权利要求1所述的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法，其特征在于：所述发酵培养条件，特征为：培养温度0-25h 31.5℃-32.5℃，26-80h 29.5℃-30.5℃，81h-放罐31.5℃-32.5℃；发酵过程补加氨水控制pH 0-25h 5.9-6.1，26-80h 5.8-6.0，81h-放罐5.7-5.9，通气量0.6-1.2v/v/min，转速为150rpm-550rpm，罐压为0.04Mpa，控制溶氧高于20%。
4.根据权利要求1所述的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法，其特征在于：所述补料方法，特征为：补加补料控制发酵培养基中总糖，当总糖下降到4.5g/100mL以下，补加补料，0-80h 4.5g/100mL-3.5g/100mL，81-100h 4.0g/100mL-2.5g/100mL，101h-放罐3.5g/100mL-2.0g/100mL。
5.根据权利要求1所述的一种发酵生产6-去甲基四环素的方法，其特征在于：所述发酵培养过程中，0-80h补加灭菌后的大豆油消泡，81h-放罐补加灭菌后的消泡剂消泡。
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