DE1088447B

DE1088447B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Glutaminsaeure

Info

Publication number: DE1088447B
Application number: DEK30666A
Authority: DE
Inventors: Shukuo Kinoshita; Shigezo Udaka; Sadao Akita
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1956-05-17
Filing date: 1956-12-17
Publication date: 1960-09-08
Also published as: NL101580C; MY6100060A; GB839597A; NL213525A; GT196811002A; BE554612A

Description

DEUTSCHES

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Glutaminsäure.

Es ist bekannt, daß Mikroorganismen in einem geeigneten Medium verschiedene Arten von Aminosäuren erzeugen können. Die hierbei erzeugten Mengen sind jedoch außerordentlich gering, und es wurde nie darüber berichtet, daß irgendeine besondere Art von Aminosäure in größerer Menge in dem Medium durch Gärung angesammelt werden konnte. -

Der Grund für die außerordentlichen Schwierigkeiten bei der Gewinnung beliebiger Aminosäuren in einem Gärmedium ist der, daß Aminosäuren die Bestandteile von Proteinen sind und daß alle einmal in einem Medium erzeugten Aminosäuren leicht wieder zu Proteinen, Polypeptiden od. dgl. resynthetisiert oder durch verschiedenartige biochemische Umsetzungen in andere Substanzen umgewandelt oder dazu zersetzt werden können. Mit anderen Worten: Eine Aminosäure kann kaum in monomerem Zustand in einem Kulturmedium angesammelt werden. Das Wort »monomerer Zustand« wird hierbei zur Bezeichnung des monomolekularen Zustands sowohl der freien Säure als auch eines Salzes verwendet.

Dies ist der Grund, weshalb ein Gärverfahren, also die direkte Verwendung von biochemischen Aktivitäten einer lebenden Kultur von Mikroorganismen, noch nie zur Biosynthese und Anhäufung von 1-Glutaminsäure vorgeschlagen worden ist. Die bekannte Biosynthese erfolgt in einem enzymatischen System, d. h., eine besondere Art von Enzymen wird aus Mikroorganismen oder aus bestimmten tierischen oder pflanzlichen Geweben extrahiert, und das Enzym wird mit geeigneten, Subtraten, z. B. α-Ketoglutarsäure und Ammoniumverbindungen, unter sehr begrenzten Reaktionsbedingungen umgesetzt.

So sind zur Herstellung von a-Ketoglutarsäure und 1-Glutaminsäure dienende Verfahren bekannt geworden, deren eines das gewünschte Produkt durch Gärung aus Glucose erzeugt und deren anderes sich einer enzymatischen Reduktion und Aminierung von α-Ketoglutarsäure bedient. Die bekannten Verfahren laufen jedoch in zwei Stufen ab, und es ist nicht möglich, durch ihre bloße Kombination 1-Glutaminsäure in einer einzigen Stufe direkt zu erzeugen.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Glutaminsäure offenbart, das erstmalig die großtechnische Herstellung von Glutaminsäure durch Gärung in besonders vorteilhafter und auch wirtschaftlich sinnvoller Weise ermöglicht.

In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird als Kohlenstoffquelle des Nährsubtrates für die verwendete Mikrococcusart mindestens ein · Kohlenhydrat, und zwar Glucose; Fructose, Saccharose, Maltose, Xylose oder hydrolysierte Stärke, verwendet.

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von !-Glutaminsäure

Anmelder:

Fa. Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha, Tokio

Vertreter: Dipl.-Ing. H. Leinweber, Patentanwalt,
Mündien 2, Rosental 7

Beanspruchte Priorität:
Japan vom 17. Mai 1956

Shukuo Kinoshita, Shigezo Udaka und Sadao Akita,

Tokio,
sind als Erfinder genannt worden

Schließlich wird nach einem weiteren Merkmal der Erfindung irgendeine Mutante von Mikrococcus glutamicus Nr. 534 als Organismus verwendet. '" '
Es wurde gefunden, daß ein Mikroorganismus, der zwei biochemisch spezifische Forderungen erfüllt, nämlich einmal eine Fähigkeit zur Bildung von α-Ketoglutarsäure aus zuckerhaltigen Stoffen und zum anderen eine starke 1-Glutaminsäuredehydrogenaseaktivität, insbesondere eine starke Aktivität gegen die Umkehrreaktionen der obigen reversiblen enzymatischen Reaktion, d. h. eine Aktivität zur reduktiven Aminierung von α-Ketoglutarsäure aufweist, zur direkten Erzeugung beträchtlicher Mengen 1-Glutaminsäure durch Gärungsverfahren geeignet ist.

Das charakteristische Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt in der Erzeugung und Ansammlung von 1-Glutaminsäure in dem Kulturmedium durch die biochemischen Aktivitäten während des Wachstums und der Vermehrung der Art. Der wesentliche Unterschied der vorliegenden Erfindung gegenüber der erwähnten enzymatischen Herstellung, bei der 1-Glutaminsäure durch die Umsetzung eines extrahierten Enzyms und mit spezifischen Substraten synthetisiert wird, ist also offensichtlich.

Die Erfinder fanden eine neue zu der Gattung Mikrococcus gehörende Art, die als Mikrococcus Nr. 534 oder »Mikrococcusglutamicus« bezeichnet wird. Die allgemeinen Eigenschaften der Art werden im folgenden beschrieben: Die meisten der Versuche

009 590/69

10

wurden nach dem »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« angestellt (Society of American Bacteriologists, 9. Auflage).

A. Morphologische Beobachtungen I. Mikroskopische Beobachtungen: (Agarnährboden, 37° C, 18 Stunden)

1. Form: Mikrococci,. einzeln, in Paaren oder

unregelmäßigen Massen auftretend, kugelig oder schwach ellipsoidförmig. Größe der Mehrzahl: 0,6 bis 1,2 μ.

2. Beweglichkeit: Keine.

3. Sporen: Keine.

4. Gramreaktion: Positiv.

II. Agarabstrich:

(Agarnährboden, 37° C, 18 Stunden)

1. Wachstum: Mäßig.

2. Form des Wachstums: Ablegerform.

3. Glanz: Stumpf.

4. Farbentwicklung: Milchigweiß bis schwach

gelblichweiß.

5. Geruch: Keiner.

6. Konsistenz: Butterartig bis schwach klebrig-

viskos.

7. Farbe des Mediums: Unverändert.

III. Agarkolonien:

(Agarnährboden, 37° C, 20 Stunden)

1. Form: Kreisförmig.

2. Oberfläche: Glatt.

3. Rand: Vollständig.

■ 4. Aufriß: Schwach ansteigend. 5. Aussehen: Undurchsichtig.

IV. Agarstich:

(Agarnährboden, 37° C, 18 Stunden)

1. Wachstum: Am besten an der Oberfläche.

11. Citronensäureverbrauch: Negativ.

12. Stärkeverflüssigung: Keine.

13. Milch: Keine Veränderung oder schwach

alkalisch.

14. Katalase: Sehr schwach.

15. Urease: Stark.

16. 1-Glutaminsäuredehydrogenaseaktivität: Sehr

stark.

17. Säurebildung: ct-Ketoglutarsäure, Milch

säure werden gebildet. Andere organische Säuren in Spuren.

18. Zuckergärung:

35 Arabinose
Xylose ...
Glucose ...
Fructose .
Galaktose .
Mannose .
Laktose ..
Dextrin ..
Glycerin ..
Saccharose
Maltose ...
Trehalbse .
Raffinose .
Melecitose

Stärke

Mannit ...

Sorbit

Salicin ...

Inulin

Glykogen .

Säure- | Gasentwicklung)

V. Nährlösung:

(Nährlösung, 37° C, 18 Stunden)

1. Oberflächenwachstum: Ringförmig.

2. Trübung: Gering.

3. Geruch: Keiner.

4. Abscheidung: Flockig, gering.

B. Physiologische Eigenschaften

- 1. Wachstumstemperatur: Kein Wachstum oberhalb 47° C; geringes Wachstum um 42⁰C; gutes Wachstum zwischen 27 und 37° C; Optimum um 30° C.

2. Sauerstoff: Vollständig aerob.

3. Nitratreduktion: Stärk.
.4. Indolbildung: Keine.

5. Schwefelwasserstoff: Nicht gebildet.

6. Indikatorreduktion: Methylenblau, 2,6-Di-

chlorphenolindophenol, . Janusgrün, 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid werden reduziert. 6g

7. Gelatineverflüssigung: Negativ oder sehr

schwach.

8. Caseinabbau: Schwach.

9. Voges-Proskauer-Reaktion: Negativ.

10. Methylrotreaktion: Schwach sauer.

Im Hinblick auf die oben aufgeführten Eigenschaften und Beobachtungen erkannten die Erfinder, daß die vorliegende Rasse zu einer neuen Art der Gattung Mikrococcus gehörte, weil sie mit keiner der in Bergey's Manual aufgeführten identifiziert werden konnte.

Gärungsverfahren

Die Zusammensetzung des Mediums kann jede bekannte und zum Wachstum des Mikrococcus geeignete sein. Als Kohlenstoffquelle können alle vergärbaren Zucker, die aus der obigen Tabelle ersichtlich sind, verwendet werden. Für die Stickstoffquellen und anderen Nährstoffen bestehen keine besonderen Einschränkungen wie bei der Kohlenstoffquelle. Um einen kräftigen Kohlenhydratstoffwechsel in der Kultur zu erhalten, sollten verschiedene Arten von organischen oder anorganischen stickstoffhaltigen Substanzen und verschiedene Mineralstoffe, die von dem Organismus gebraucht werden, dem Kulturmedium zugesetzt werden. Die Kultur wird unter aeroben Bedingungen bei 27 bis 30° C geimpft und. vermehrt. Im Verlauf der Gärung pflegen sich organische Säuren zu bilden und das Medium sauer zu machen. Es wurde gefunden, daß die Bildung von 1-Glutaminsäure durch den p_H-Wert des Mediums während des Verlaufs der Gärung stark beeinflußt wird. Die Bildung von 1-Glutaminsäure wird günstig beeinflußt, wenn der p_H-Wert zwischen 6,0 und 9,0 gehalten wird; die günstigsten P_n-Werte scheinen zwischen etwa 7,0 und 8,5 zu liegen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der P₁₁-Wert durch Zugabe von einer der Verbindungen,

die einen basischen, stickstoffhaltigen Rest enthalten, in den Bereich von 6,5 bis 8,5 gebracht und dort gehalten. So wird durch die katalytische Wirkung der starken reduktiven Aminierung von 1-Glutaminsäuredehydrogenase, die in der Rasse enthalten ist, einmal 5 gebildete ct-Ketoglutarsäure mit den aus dem zugesetzten "basischen stickstoffhaltigen Rest entstehenden Ammoniumionen umgesetzt und 1-Glutaminsäure gebildet. Wegen der starken reduktiven Aminierungsaktivität der 1-Glutaminsäuredehydrogenase der vorliegenden Rasse und durch Halten des p_H-Wertes in dem günstigsten Bereich werden die verschiedenen ungünstigen Nebenreaktionen auf ein Mindestmaß beschränkt. Die 1-Glutaminsäurebildung übertrifft also die Nebenreaktionen und führt zur Anhäufung von 1-Glutaminsäure in großer Menge.

Verschiedene Verfahren sind zum Neutralisieren des Kulturmediums verwendbar. In jedem Falle sollte dem Medium eine erforderliche Menge Ammoniumionen zugeführt werden. Die gleichzeitige Verwendung von Ammoniumsalzen und Alkalien liegt ebenfalls innerhalb des Bereichs dieser Erfindung. Es ist mindestens für die vorliegende Erfindung wesentlich, daß die Kulturbedingungen nicht sehr weit außerhalb des Bereichs für das Wachstum der vorliegenden Rasse liegen. Wie jeder Fachmann leicht erkennen wird, können auch Mutanten der vorliegenden Rasse innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Die in dem Medium angesammelte 1-Glutaminsäure — bzw. ihr Salz — wird nach einem bekannten, geeigneten Verfahren isoliert, z. B. durch Ionenaustausch, wobei ein solches Verfahren an sich kein wichtiger Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Schüttelkulturgärung durch ein synthetisches Medium

40

Mikrococcus Nr. 534 wurde 24 Stunden in Glucosebouillon durch Schüttelkultur bei 28° C geschüttelt und als Impfgrundlage verwendet. 30 ecm Gärmedium wurden in einem 250-ccm-Koiben verteilt und aus der obigen Stammkultur geimpft und mit einem rotierenden Schüttler von 220 Umdrehungen je Minute geschüttelt. Die Zusammensetzung des Gärmediums war folgende: Glucose 50 g, Harnstoff 8 g, K₂HPO₄ 0,5g, MgSΟ₄·7H₂O 0,1g und FeCl₃-OH₂O 5 mg auf 11.

Die analytischen Ergebnisse sine	Züch tungs- dauer	Tabelle 1	Restliche Glucose	in Tabelle 1 an-	Ausbeute auf ver- ⁵⁵ brauchte Glucose
gegeben.		PH- Wert			bezogen
	Tage		g/100 ecm		Vo
Kultur- tempe- ratur	1		2,8	1-GIut- amin- säure	60 30,0
	2	8,6		mg/	22,0
⁰C	2	7,3	2,3	100 ecm	22,6
33 {	3	8,2	1,2	660	21,3
f	4	6,8	0,2	700	23,5 65
28 \		8,7	610
1		810
	1130

Beispiel 2

S chüttelkulturgärung
durch zusammengesetztes Medium

Stammkultur (Impfkeim) und Verfahren waren die gleichen wie im Beispiel 1. Das Gärmedium setzte sich wie folgt zusammen: Glucose 100g, Fleischextrakt g, NZ-Amin 5 g, Harnstoff 15 g, K₂HPO₄ 1 g und MgS O₄-7 H_?O 0,25 g auf 11. Temperatur bei 28° C.

Die analytischen Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

	p_H-Wert	Tabelle	2	Ausbeute in "/ο, auf
Züch-		Restlicher	1-Glutamin	verbrauchten Zucker
tungs- dauer-	8,4	Zucker	säure	bezogen
Tage	8,2	g/100 ecm	mg/100 ecm	13,6
1	7,3	7,2	370	28,4
2	6,2	5,5	1280	30,1
3	3,5	1960	35,2
4	2,9	2480

Die obigen Beispiele sollen nur zur Erläuterung dienen. Es können verschiedenartige andere zuckerhaltige Stoffe und verschiedene andere organische und anorganische Stickstoffquellen, z. B. Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlodd, Ammoniumsulfat, Ammoniumkarbonat, Ammoniumacetat u. dgl., Pepton, verdautes Sojabohnenmehl, verdautes Fischmehl, Caseinhydrolysat und Maisquellflüssigkeit an Stelle der Nährstoffe in dem Gärmedium von Beispiel 2 verwendet werden.

Wie aus den obigen Beschreibungen hervorgeht, kann in einem synthetischen Medium wie auch in einem organischen Medium eine Menge von bis zu 20 bis 30V» des verbrauchten Zuckers in 1-Glutaminsäure umgewandelt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 1-Glutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, daß die neue, in der Beschreibung morphologisch definierte Mikrococcusart »Mikrococcus glutamicus« in einem üblichen Nährsubstrat, das vergärbare Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Stoffe enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet und der pg-Wert des Nährsubstrates im Bereich von 6 bis 9 durch Zugabe von Neutralisationsmitteln gehalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlenstoffquelle des Nährsubstrats mindestens ein Kohlenhydrat, und zwar Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Xylose oder hydrolysierte Stärke, verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Organismus irgendeine Mutante von Mikrococcus Nr. 534 verwendet wird.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Journal Am. Chem. Soc, Vol. 74, 5142 (1952);
Deutsche Patentschrift Nr. 931 582.

009 590/69 8.60