DE2061756C3 - Verfahren zur Herstellung von Adenosin durch aerobes Zuchten eines Bacillus - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von AdenoMn durch aerobes Züchten eines Bacillus in einem Nährmedium bei pH-Werten von 5 bis 7 und Temperaturen von 30 bis 37 C. a°

Adenosin ist eine be.standteilbildende Komponente der Ribonucleinsäure, weiche man in allen lebenden Organismen findet. Adenosin ist ferner eine Vorstufe des Adenosin-triphosphats, welche im lebenden Organismus eine energieliefernde Quelle ist. Einige Derivate dieses Nucleosids sind brauchbar als Bactericide. Antikrebsmittel oder Substanzen, weiche den Stoffwechsel in lebenden Organismen regulieren. Daher hat die Anwendung von Adenosin für Arzneimittel bzw. chemische Substanzen kürzlich in der Öffentlichkea Beachtung auf sich gezogen.

Adenosin wurde bisher aus Ribonucleinsäure des tierischen Organismus oder aus Ribonucleinsäure der Zellen von Mikroorganismen, beispielsweise Hefezellen, erhalten. Der Aufwand zu ihrer Herstellung war daher sehr hoch. Es sind Untersuchungen angestellt worden, welche sich auf ein wirtschaftlicheres Verfahren zur Herstellung dieser Substanz durch direkte Fermentierung beziehen. In der japanischen PatentveröfTentliehung 1699/62 ist eine Methode zum Gewinnen von Adenosin unter Verwendung von Bacillus subtilis-Mutanten beschrieben. Diese Methode ist jedoch für ein technisches Verfahren zu unwirtschaftlich, da sie nur geringe Ausbeuten an Adenosin ergibt. Außerdem ist der Erhalt der anzuwendcnden Mutante in der genannten japanischen Auslegeschrift nicht reproduzierbar beschrieben.

Erfindungsgegenstand ist nun ein Verfahren zur Herstellung von Adenosin durch aerobes Züchten eines Bacillus in einem Nährmedium bei pH-Werten von 5 bis 7 und Temperaturen von 30 bis 37 C. dadurch gekennzeichnet, daß man den Bacillus ATCC 21 616 in einem Nährmedium üblicher Zusammensetzung, das jedoch zusätzlich noch Guanin und Aminosäure enthält, einsetzt.

Der Adenosin erzeugende Stamm wird erhalten, indem man bei dem Bacillus-Grundstamm, welcher aus dem Boden in den Vororten der Stadt Beppu in der Provinz Öita, Japan, isoliert worden ist, verschiedene Mutationsbehandluncen anwendet. Dieser Grundstamm ist der Bacillus ASB-5741 (ATCC 21 615).

Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Grundstammes ASB-5741 (ATCC 21 615) wurden geprüft gemäß dem ^ Manual of Microbiological Method« (herausgegeben von der American Bacteriological Society) sowie gemäß »Suikin-Gaku Jisshü Teiyö (•'Leitfaden des mikrobiologischen Versuchs") (hera u·. ge L'ehe π von der Gesellschaft der Mitschüler des

Forschungsinstituts für Infektionskranheiien der Universität Tokio).

Λ Mikroskopische Beobachtung (24 bis 48 Stunden bei 37 C auf Schrägagar als Nährmittel kultiviert)

1. Stabförmige Zelle, 0,7 bis 0,9 · 2,5 bis 3,5 Mikron, nicht in Ketten:

2. Unbeweglich;

3. Sporenbildend, jedoch sehr schwach,

0,8· 1,3 Mikron, ellipsoid, zentral, Sporangia nicht definitiv gequollen;

4. grampositiv bei 24stündiger Kultivierung, jedoch gramnegativ bei weiter verlängerter Kultivierung.

B. Kultivierungseigenschaften (kultiviert bei 37 C)

1. Nährmittel: Schrägagar.

(1) Wachstum: mäßig;

(2) Wachstumsform: faserförmig;

(3) Schein: stumpf, matt;

(4) Färbung: grau-weiß;

(5) Haftung: leicht;

(6) Geruch: keiner.

2. Kolonien auf Nähragar.

(1) Form: kreisförmig;

(2) Oberfläche: rauh, bisweilen glatt:

(3) Rand: unregelmäßig;

(4) Erhebung des Wachstums: leicht konvex;

(5) Optische Eigenschaften: opak, stumpf:

(6) Färbung: grau-weiß.

3. Nähragar-Anstich.

(1) Wachstum auf der Oberfläche: reichlich;

(2) Wachstumsform: faserförmig.

4. Nährbrühe.

(1) Oberflächenwachstum: Ring;

(2) Nicht trübe;

(3) Sediment: flockig.

5. Kartoffcl-Schrägagar.

(1) Wachstum: reichlich:

(2) Färbung: grau-weiß;

(3) Färbung des Mediums: unverändert.

6. Glucose-Schrägagar: Wachstum reichlich, Protoplasma junger, leicht gebeizter Zellen nicht ausgesaugt.

7. Gelatine-Anstich: kraterförmig verflüssigt.

8. NaCl-Nährbrühe: Wachstum bis zu einer Konzentration von 7,0⁰ZoNaCl.

C. Physiologische Eigenschaften.

J. Optimale Wachstumstemperatur: 30bis37°C, kein Wachstum bei 65° C.

2. Aerob.

3. pH: Optimal zwischen 7,0 und 8,0. Gutes Wachstum zwischen 6.0 und 9,0.

4. Aus Nitraten keine Nitrile gebildet.

5. Citrate ausgenutzt.

6. pH-Wert der Glucosebrühe: 5,0-nach 7tägiger Kultivierung. "

7. Wachstum im glucosehaltigen Medium unter anaeroben Bedingungen: kärglich

(leicht positiv).

8. Aus Glucose unter anaeroben Bedingunueii kein Gas erzeugt.

9. Aus Nitrat unter alkalischen, anaeroben Bedingungen kein Gas erzeugt.

10. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ. '⁵

11. Kein Ji.dol erzeugt.'

12. Lithomasmilch-Medium: verfestigt und verflüssigt nach 3tägigem Brüten: vollständig verflüssigt, alkalisch nach 7tägigem Brüten.

13. Ammoniumsalze als Stickstoffquelle ausgenutzt.

111 des Genus Bacillus, weil sein Sporangium nicht gequollen ist.

Der vorliegende Stamm gehört nicht zur Gruppe Ι-Λ, wozu der Bacillus megaleriuni gehört, und zwar auf Grund der Tatsache, dall der Zellendurchmesser nicht größer als (),') Mikron ist und dall das Protoplasma junger Zellen, wenn sie leicht geheizt sind, nicht ausgesaugt wird.

Was die Gruppe 1-B betrifft, so gehört der Grundstamm nicht zur Gruppe 2, wozu Bacillus lirmus oder Bacillus lentus gehört, und zwar angesichts dor Talsache, dall man auf Glucoseschrägagar als Nährmittel reichliches Wachstum beobachtet und dall er die Fähigkeit besitzt, Ammoniumsalze und Zitronensäure auszunutzen. Er gleicht dem Bacillus subiilis oder Bacillus pumilus. weil ein Wachstum sogar bei einer Konzentralion von 7,0" η NaCl beobachtet wird. Jedoch entspricht er nicht dem Bacillus subtilis, dem Bacillus licheniformis oder Bacillus pumilus in den folgenden Eigenschaften:

14. Stärke hydrolysiert.

15. Cellulose nicht hydrolysiert.

16. Catalase: positiv.

17. Urease: negativ.

18. Säureproduktion aus Zucker:

(1) Arabinose ■'■

(2) Xylose

(3) Glucose

(4) Mannose

(5) Fructose

(6) Galactose

(7) Lactose

(8) Maltose

(9) Saccharose

(10) Trehalose

(11) Raffinosc

(12) Sorbit

(13) Inosit

(14) Mannit

(15) Glycerin

(16) Salicin

(17) Λ-Mcthylglucosid

(18) Inulin

(19) Dextrin

(20) Stärke

(21) Cellulose

Diese Eigenschaften im Vergleich zu denjenigen in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Ausgabe, führen zu dem Schluß, daß der obige Grundstamm einer neuen Art angehört. Der vorliegende Stamm gehört zum Genus Bacillus infolge der Tatsache, daß er eine grampositive, stabförmige Zelle ist, daß er Sporen bildet, daß er die Fähigkeit besitzt, Protein zu hydrolysieren, daß er Catalase enthält und daß er aerob ist.

Der Grundstamm gehört nicht zur Gruppe II oder Grr.ndstamm

Bacillus
suhtilis

Bacillus
pumilus

Bacillus
licheniforniis

²S Stärkehydrolyse ^: -t-

Rcduktion

von Nilrat . ..
VP-Reaktion ..

Wie aus den obenerwähnten Eigenschaften ersichtlich, existiert keine Gattung, welche mit dem Grundstamm genau identisch ist, soweit dies Genus Bacillus betrifft. Die Erfinder haben daraus den Schluß gezogen, daß dieser Stamm einer neuen Art angehört.

Der Adenosin erzeugende Mutant Bacillus ATCC 21 616 wurde aus dem Grundsiamm erhalten, indem man auf diesen die Behandlung mit Mutagen (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) gemäß der nachstehend beschriebenen Arbeitsweise anwendete. Ein Inosin erzeugender Mutant, welcher zum Wachstum Adenin, Threonin und Histidin benötigt, wurde zuerst isoliert, indem man die Mutationsbehandlung für einige Zeit auf den Grundstamm ATCC 21 615 anwandte. Einige Mutanten werden durch weitere An-Wendung der Mutationsbehandlung auf die Inosin erzeugenden Mutante erhalteni, und schließlich wurde ein Adenosin erzeugender Stamm, bezeichnet als Bacillus ATCC 21 616, unter den Xanthin benötigenden Mutanten gefunden.

Der vorstehende Stamm Bacillus ATCC 21 616 wird in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert. Das Medium enthält Zucker als Hauptbestandteil und ferner eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und Wachstumsfaktoren, entsprechend dem Erfordernis des angewandten Stammes.

Zu den Zuckern können beispielsweise zählen: Abfallmclassc, Stärkehydrolysat, Glucose, Saccharose, Fructose u. dgl. Es ist bevorzugt, diese Zucker dem Medium in hohen Konzentrationen zuzugeben, um soviel Adenosin wie möglich zu erhalten. Wenn andererseits die Zucker in so großen Mengen verwendet werden, daß diese die physiologische Grenze des angewandten Stammes überschreitet, so wird das Wachstum des Stammes gehindert und so das Fermentieren verzögert. So liegt die am meisten bevorzugte Zuckcrkonzcntration im Bereich von 5 bis 12" 0 (Gewicht/ Volumen). In dem Falle, wo Zucker in einer Konzentration zugesetzt wird, welche diesen Bereich über-

schreitet, sollte lt mil Unterbrechungen zugesetzt werden, während die im Kulturmedium verbleibende Zuckcrkon/entiatinn während des Fermeniieruugs- \crlaiitc^i in geeigneter Weise gesteuert wird.

Als StickstolTquelle kann man Ammoniak und versehiedene unorganische Ammoniumsalze verwenden. Hs ist geeignet, diese SiicksloiTqucllc, beispielsweise Ammoniutr.elilorid, in einer Menge im Bereich von 1,5 bis 2.5" η (Gewicht/Volumen) hinzuzusetzen.

Anorganische Salze, welche dem Medium zugesetzt werden können, sollten so ausgewählt werden, daß Ionen von Phosphat, Kalium, Magnesium. Eisen Mangan u. dgl. in geeigneten Mengen im Medium anwesend sein können.

Ferner müssen Wachstumsfaktoren dem Medium in geeigneter Weise zugesetzt werden. Der Adenosin erzeugende Stamm benötigt Guanin und Aminosäuren (Histidin und Threonin), und als Guanin liefernde Ouellen kann man Hefezellcn, deren Hydrolysat, 1 lefcextrakt, Ribonucleinsäure u. dgl. verwenden. Als Guaninquelle kann isoliertes Guanyl oder dessen Derivate ebenfalls verwendet werden. Als Zulieferungsquellen für Aminosäuren kann man die hierfür bekannten organischen Nährquellcn, wie z. B. entfettete Sojabonnen- oder ähnliche Arten von Protein- as Hydrolysatlösungen. benutzen. Die Menge dieser Zulieferungsquclle sollte, angemessen basierend auf der Menge des darin enthaltenen Guanins und der Aminosäuren, bestimmt werden. Das obenerwähnte Guanin verwendet man in einer Menge von 50 bis 200 v/cm^:i und jede Aminosäure in einer Menge von 50 bis 300 v/cm·¹.

Die Kultivierung soll zum Zwecke der wirksamen Ausnutzung des Zuckers unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden. Die am meisten bevorzugte BclüfUingsbedingung für den Stamm ist diejenige, welche man erhält, wenn man 20 bis 40 cm¹ Kulturmedium in einen Sakaguchi-Kolbcn von 500 cmⁿ Inhalt gießt und den Kolben mit einer Schüttelgcschwindigkeit von 130mal je Minute schüttelt.

Die Steuerung des pH-Wertes im Verlaufe der Kultivierung ist ebenfalls sehr wichtig. Der pH-Wert des Kulturmediums soll im Bereich von 5,0 bis 7,0 gehalten werden. Zu diesem Zweck verwendet man CaI-ciumcarbonat. Ammoniak. Natriumhydroxyd od. dgl. +5 Ammoniak ist am stärksten bevorzugt wegen seiner Funktion als StickstofTquclle.

Die Kultivierung des Stammes bewirkt man bei Temperaturen im Bereich von 30 bis 37° C.

Die Fermentierung ist nach Kultivieren während 5c 60 bis 90 Stunden vollendet. Als Ergebnis hat »ich eine große Menge an Adenosin im Kulturmedium angesammelt.

Die Isolierung von Adenosin wird durchgeführt, indem man auf die überstehende Flüssigkeit, welche durch Entleihen von Zellkörper!! aus der Fermeiitierunushiühe mittels Filtrieren oder Zentrifugieren erhalten wird, irgendeine der herkömmlichen Methoden oder deren Kombinationen anwendet. Beispielsweise kann man vorzugsweise die Adsorptionsmethode mit aktiver Holzkohle, die lonenausiausehhar/met'.iodr, die Konzentrationsmethode oder die Kühl-Krisudlisationsmethode od. dgl. anwenden.

Die Erfindung sei nunmehr an Hand der folgenden Ausführungsheispiele näher erläutert. Wenn nichts anderes \ ermerkt ist, heziehen sich die Prozentangaben auf »" 11 Gewicht'Vnlumen«.

Beispiel 1

Ein Adenosin erzeugender Stamm, Bacillus AT CC 21 fild wird unter aeroben Bedingungen 15 Stunden bei 32 C in einem Bouillon-Medium kultiviert, welches 0,5" 11 Hefeextrakt enihält. 2 cm^:l der so erhaltenen Brühe benutzt man zr π Animpfen von 30 cm^:1 eines Fermentierungsmediums (pH-Wert 7,5), welches 10".Ό Glucose, 0.2°/n primäres Kaliumphosphat. 2.0"Ό Ammoniumchlorid, 0,05 ⁰Zo Magnesiumsulfat, 0,001 "Ό Manganchlorid. 0,001 »0 Fcrrosulfat, 250;<'em^:i Guanosin und 0,8¹Vo entfettete Sojabohne enthält. Das Medium wurde in einem Sakaguchi-Kolben von 500 cm³ Fassungsvermögen bereitet und 15 Minuten bei 120 C sterilisiert. Dann setzt man Calciumcarbonat, welches getrennt sterilisiert worden ist. zu dem Medium in einer Konzentration von 5,0"/(I hinzu. Die Kultivierung führt man 80 Stunden lang bei 32° C unter Schütteln aus, wobei sich 10,5 g/l Adenosin im Medium ansammeln. Die Zellen werden durch Zentrifugieren aus der Brühe entfernt. Die daraus erhaltene überstehende Flüssigkeit (1 1) stellt man auf einen pH-Wert von 4,0 ein und läßt sie dann zur Adsorption von Adenosin durch eine Kolonne mit aktiver Holzkohle hindurchgehen. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen und der Eluierung mit einer Lösung von Melhanol-Isooctanol-Ammoniak-Wasser (50 : 1 : 2 : 47) unterworfen. Das Elusat wird konzentriert, und man läßt es durch eine Kolonne eines Anionenaustauschharzes (Dowex I [Cl-Typ]) hindurchgehen, wobei man eine adcnosinhaltigc Fraktion erhält. Diese Fraktion v/ird konzentriert und dann Äthanol hinzugesetzt, und man erhält 7.9 g kristallines Adenosin.

Beispiel 2

Das Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß man die iO°/o Glucose im Fermcntationsmediun-. durch die entsprechende Menge Rübcnmelasse ersetzt. Als Ergebnis sammeln sich 9,2 g'l Adenosin im. Medium an.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Adenosin durch aerobes Züchten eines Bacillus in einem Nährmedium bei pH-Werten von 5 bis 7 und Temperaturen von 30 bis 37 C, dadurch gekenn-/ e i c h net, daß man den Bacillus ATCC 21 616 in einem Nährmedium üblicher Zusammensetzung, das jedoch zusatzlich noch Guanin und Aminosäure enthält, einsetzt.