DE1028745B

DE1028745B - Herstellung und Gewinnung von Dihydrostreptomycin auf biologischem Wege

Info

Publication number: DE1028745B
Application number: DET13407A
Authority: DE
Inventors: Koiti Nakazawa; Motoo Shibata; Masahiko Imanishi; Kazuo Tanabe; Hiroichi Yamamoto; Sueo Tatsuoka; Tsunaharu Kusaka; Akira Miyake; Michitaka Inoue; Yutaka Shiraishi; Hidesuke Iwasaki
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1956-03-24
Filing date: 1957-03-25
Publication date: 1958-04-24

Description

Herstellung und Gewinnung von Dihydrostreptomycin auf biologischem Wege Die Erfindung betrifft die Herstellung und Gewinnung von Dihydrostreptomycin durch Fermentation.
Dihydrostreptomycin ist therapeutisch wertvoll, da es nicht nur das gleiche starke und weite antibakterielle Spektrum wie Streptomycin aufweist, sondern außerdem weniger toxisch und stabiler als letzteres ist. Außerdem hat Dihydrostreptomycin, dessen antibakterielleWirksamkeit der von Streptomvcin gleicht, den Vorteil einer viel geringeren Ncurotoxizität, Bisher wird Dihydrostreptomycin durch Hydrierung von Karbonylresten des Streptomycins hergestellt und als Sulfat oder Hydrochlorid auf den harkt gebracht. Diese Salze sind weiße oder farblose kristalline oder pulverartige Substanzen. Sie sind geruchlos oder annähernd geruchlos, haben einen leicht bitteren Geschmack, und ihre wäßrigen Lösungen sind linksdrehend. Die wäßrige Lösung des Sulfats zeigt eine Drehung von (a)1 = -88° (c = 1). Es ist bekannt, daß Dihydrostreptomycin ein weites antibakterielles Spektrum gegen grampositive, gramnegative und säurebeständige Bakterien zeigt.
Wie bereits erwähnt, wird Dihy drostreptomvcin bisher ausschließlich durch die Reduktion von Streptonnycin, beispielsweise aus Nährlösungen von Streptomyces grisius isoliert, hergestellt (USA.-Patentschrift 2498574). Dieses Verfahren erfordert jedoch außerordentlich rcines Streptornycin, da sonst ein beträchtlicher Verlust bei der Reduktion unvermeidlich ist.
Bisher sind keine Berichte über die direkte Herstellung von Dihydrostreptomycin durch Züchten von dihydrostreptomycinerzeugenden --Mikroorganismen bekannt. Durch ein solches Verfahren würde die Herstellung von Dihydrostreptomycin sehr erleichtert, die Ausbeute erhöht und die Kosten verringert.
Nach eingehendem Studium der aus verschiedenen Mikroorganismen hergestellten Antibiotika wurden folgende Ergebnisse gefunden: 1. DihS- drostr eptom@-cin wird in Nährlösungen bestimmter Mikroorganismen direkt gebildet.
2. Dieser -Mikroorganismus ist ein Stamm von Streptomvces.
3. Durch Züchten des Stammes unter geeigneten Bedingungen entsteht genügend Dihydrostreptomycin in der Nährlösung, um isoliert werden zu können.
4. Dieses Dihydrostreptomycin kann aus der Fermentationsflüssigkeit gewonnen werden.

Bei der erfindungsgemäß fermentativen Herstellung von Dihydrostreptomycin wird ein flüssiges Medium mit einem dihydrostreptomy cinerzeugenden Stamm von Streptomy ces geimpft und aerob fermentiert. Gemäß der Erfindung können alle Stämme aller Arten von Streptomyces verwendet werden, die Dihydrostreptomycin ergeben. Beispielsweise kann ein neuer und von den Erfiedern bei Institute for Fermentation, Osaka, Japan, unter der Nummer IFO-3520 hinterlegter Stamm hierzu verwendet werden. Die Eigenschaften dieses Stammes sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt (die mit Rdg bezeichneten Farbnamen beziehen sich auf Ridgways ##Color Standards and Nomenclature«).

I Stamm IFO-3520

Kultureigenschaften

Medium Lösliche Bemerkungen

Mycelwachstum Luftmycel -j- Sporen Pigmente

Czapek-Agar . . . . . . . . . . . . farblos weiß keine

Glykose-Asparagin-Agar . . farblos weiß bis rauchgrau (Rdg XLVI, keine reichlich durchsetzt mit

21""-d) oder Vinaceousbuff kleinen feuchten schwar-

(Rdg XL, 17"'-d) zen Pünktchen, die sich

langsam über die ganze

Oberfläche verteilen.

Rückseite Cream-buff

(Rdg XXX, 19"-d) oder

Cartridge-buff (Rdg XXX,

19"-f), das später zu cha-

mois wird (Rdg XXX,

19"-b)

Stärke-Agar ............ farblos weiß bis hellrauchgrau keine Rückseite Cream-buff

(Rdg XLVI, 21""-f) (Rdg XXX, 19"-b).

Geringe Hydrolyse

Calcium-Malat-Agar ..... farblos nahezu weiß keine

später buff-gelb

werdend

(Rdg IV, 19-d

Glycerin-Nitrat-Agar .... farblos nahezu weiß keine

Bouillon-Agar .......... farblos keine keine

Gelatine . . . . . . . . . . . . . . . farblos keine i keine _ geringe Verflüssigung

Dextrose-Nitrat-Agar .... farblos nahezu weiß keine

Kartoffelstückchen ...... farblos weiß bis rauchgrau keine feuchte schwarze Pünkt-

(Rdg XLVI, 21""-d) chen beobachtet

Karottenstückchen ...... farblos weiß bis rauchgrau keine

(Rdg XLVI, 21""-d)

Hefeextrakt-Agar ...... . farblos weiß bis Light drab keine teilweise feuchtend

(Rdg XLVI, 17""-b)

Ganzes Ei . . . . . . . . .. . . . . farblos weiß keine

i

Milch .................. farblos weiß keine Peptonisation langsam

Glycerin-Asparaginat-Agar farblos weiß bis rauchgrau keine

(Rdg XLVI, 21""-d)

Pepton-Nitratlösung ..... [ Nitrat-Reduktion

Das Luftmycel dieses Stammes zeigt Spiralen von Die Kohlenstoffverwertung ist, gemessen nach dem Ver-

0,8 bis 1,2 #t und ovale Conidien von 1 bis 1,5 p. # 1,5 bis 2fahren von Pridham, wie folgt:

d(+)-Xylose ++ Saccharose - d-Mannit +++ Na-acetat -

1(+)-Arabinose +++ Maltose +++ d-Sorbit - Na-citrat

1(+)-Rhamnose +++ Lactose ++ Dulcit - Na-succinat

d-Fructose -,' ++ d(+)-Raffinose - dl-Inosit - Kontrolle -

d-Galactose +++ Inulin - Salicin

- = kein Wachstum + = Wachstum zweifelhaft

-;- = langsames Wachstum -@--E- = mittleres Wachstum

-@--E--I,- = gutes Wachstum

Auf Grund der vorstehend aufgezählten Eigenschaften verdient der Stamm als neu entdeckter Stamm angesehen zu werden, der Streptomyces humidus nov. sp. Nakazawa et Shibata genannt wird. In der nachfolgenden Tabelle wird dieser Stamm mit Streptomyces hygroscopicus verglichen, der ähnliche Eigenschaften hat.

I. Vergleichstabelle von Streptomyces humidus und Streptomyces hygroscopicus

St. humidus St. hygroscopicus

Nähr-Agar . . . . . . . . . . . . . farblos während des Wachstums cream-colored, später

yellowish-gray mit yellowish-brown reverse

Glucose-Asparagin ...... Reverse cream-buff oder cartridge-buff während des Wachstums creamcolored bis

das später zu chamois wird. Luftmycel straw-yellow, später dull chrome-yellow bis

weiß bis smoke-gray oder vinaceous-buff brownish-orange. Luftmycel weiß bis pale

yellowish-gray

Kartoffelstückchen ...... Wachstum farblos. Belüftetes Mycel während des Wachstums cream-colored, später

weiß bis smoke-gray yello«-ish-gray bis dull brownish. Luftmycel

fehlt oder zeigt Spuren von weiß

Streptomyces hygroscopicus erzeugt gemäß der Veröffentlichung in >,J. Agr. Chem. Soc- (Japan), Bd. 28, S. 296 (1954), und in )Antibiotics and Chemotherapy", Bd. 3, S. 1268 (1953), Hygroscopin, Carbomycin gemäß "Antibiotics and Chemotherapy<,, Bd. 3, S. 899 (1953), Angstmycin gemäß J. #>Antibiotics,@ (Japan), Bd. 7, S. 113 (1954), und Hygromycin gemäß »Antibiotics and Chemotherapy, Bd. 3, S. 1268 (1953), während Streptomyces humidus Dihydrostreptomycin erzeugt.

Der vorstehend erwähnte Stamm von Streptomyces humidus ist hygroskopisch, aber nicht alle Stämme der gleichen Gattung haben diese Eigenschaft. Außerdem bilden einige Stämme kein Luftmycel, während andere Pigmente erzeugen. Der vorstehend erwähnte Stamm ist nur ein Beispiel für die gemäß der Erfindung verwendbaren Stämme. Stämme anderer Gattungen können für den gleichen Zweck verwendet werden, wenn sie Dihydrostreptomycin als Umwandlungsprodukt ergeben, auch wenn ihre Eigenschaften denen von Streptomyces humidus nov. sp. nicht sehr ähnlich sind.
Beobachtungen haben gezeigt, daß die Eigenschaften von Mikroorganismen, vor allem von Streptomyces in Kulturmedien sich leicht spontan verändern oder künstlich verändern lassen, weshalb die Identifizierung einer Species so erschwert wird, daß Beschreibungen über das Verhalten einer Species für ihre Identifizierung ohne konkreten Wert ist. Aus diesem Grunde bezieht sich die Erfindung neben dem obenerwähnten Stamm auch auf seine aus dem Boden isolierten Varianten, seine durch Alutationsmittel, wie Röntgenstrahlen, ultraviolette Strahlen und Chemikalien, erzeugten Mutanten sowie alle Stämme, die die erfindungsgemäße Reaktion ergeben.

In der folgenden Tabelle werden die systematischen Eigenschaften einiger aus Streptomyces humidus durch übliche Mutationsmittel, wie ultraviolette Bestrahlung und Abtrennung einzelner Sporen, gewonnenen mutierten Produkte aufgeführt:

Mutierte Produkte des Stammes Nr. IFO-3520

G I Y I W

Glucose-Asparagin-Agar teegrün hellorangegelb weiß

Stärke-Agar weiß hellorangegelb weiß

Dextrose-Nitrat-Agar weiß cremefarbig weiß

Kartoffelstücke teegrün capucine-buff, weiß

später orange bis gelb

Glycerin-Asparagin Agar weiß hellorange bis gelb weiß

Die meisten für den Zweck ausreichenden Stämme haben keine systematische Ähnlichkeit mit Streptomyces griseus und sind sowohl Dihydrostreptomycin als auch Streptomycin gegenüber beständig. Im Gegensatz zu den aus streptomycinerzeugenden Stämmen hergestellten Antibiotika reagieren die rohen, aus dihydr ostreptomycinerzeugenden Stämmen hergestellten Antibiotika der Maltolreaktion gegenüber meist negativ. Diese Eigenschaften werden vorteilhafterweise zum Abtrennen der gewünschten Stämme von anderen Stämmen verwendet. Beispielsweise dienen diese Eigenschaften als Kriterium, die gewünschten Stämme selektiv durch Verdünnung oder durch Züchten in einem dihydrostreptomycinhaltigen Medium abzutrennen.

Es wurde nun gefunden, daß Dihydrostreptomycin durch Züchten des erwähnten Stammes in flüssigem Medium unter aeroben Bedingungen während einer ausreichend langen Zeit hergestellt werden kann. Es ist eine beachtliche Tatsache, daß Dihydrostreptomycin als ein Umwandlungsprodukt durch Züchten eines Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen hergestellt werden kann. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können zahlreiche, als Nährquelle zur Züchtung von Mikroorganismen verwendete Substanzen angewendet werden. Als Kohlenstoffquelle können beispielsweise Stärke, Laktose, Saccharose, Dextrin, Glycerin und Maltose verwendet werden. Als Stickstoffquelle werden organische und anorganische stickstoffhaltige Substanzen, wie Soj abohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton, gepulverte Erdnüsse, Casein, Aminosäuren, Hefe, Kleie, Flüssigkeit aus gequollenem Mais, Baumwollsamenpulver, Nitrate, sowie Harnstoff und Ammoniumverbindungen verwendet. Außerdem können dem Medium geringe Mengen an anorganischen Salzen und wachstumsfördernden Substanzen zugegeben werden. Als weitere Nährsubstanzen können Mycele von Peniciliumstämmen oder deren Fermentationsmedien verwendet werden. Alle zur Züchtung von Streptomyces griseus brauchbaren Kulturmedien können ebenfalls verwendet werden. Gegebenenfalls kann ein geeignetes Vorbereitungsmittel verwendet werden.
Die Kulturlösung kann ein Feststoff oder flüssig sein, vorzugsweise wird bei industrieller Verwendung jedoch eine aerobe, unter die Oberfläche des Mediums untergetauchte Kultur verwendet. Bei Verwendung von Streptomyces humidus als dihydrostreptomycinerzeugenden Mikroorganismus und bei Durchführung unter aeroben Bedingungen in der Flüssigkeit erfolgt die Züchtung vorzugsweise bei Temperaturen zwischen 24 und 30° C während einer Zeit von 3 bis 8 Tagen, wobei Temperatur und Zeitdauer nach den anderen Bedingungen eingestellt werden müssen. Bei Verwendung anderer Mikroorganismen werden die jeweils für diesen Organismus geeignetsten besten Bedingungen verwendet.
Das so hergestellte Dihydrostreptomycin wird in der gewünschten Reinheit durch Verwendung verschiedener physikalischer oder chemischer Verfahren unter Ausnutzung der Eigenschaften des Dihydrostreptomycins gewonnen.
Die Isolierung von Dihydrostreptomycin aus dihydrostreptomycinhaltigen Fermentationsmedien oder aus seinen verarbeiteten Substanzen ist zum erstenmal durch das erfindungsgemäße Verfahren erreicht worden.
Unter »Gewinnung<, wird in dieser Beschreibung die Herstellung von Dihydrostreptomycin in einem gewünschten Reinheitsgrad verstanden, der höher als der des verwendeten Materials ist.
Die physikalischen und chemischen Verfahren zur Reinigung von Dihydrostreptomycin beruhen beispielsweise auf den Unterschieden zwischen Dihydrostreptomycin oder seinen Salzen und Verunreinigungen in bezug auf Adsorptionsfähigkeit, Löslichkeit und den Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Lösungsmitteln oder in der Stärke der ionischen Bindung.
Bei flüssigen Kulturen beträgt die Ansammlung von Dihydrostreptomycin einige 10 bis einige 1000 Mikrogramm/ccm, aber es wurde gefunden, daß Dihydrostreptomycin selbst aus einer Lösung von etwa 10 yt'ccm wirksam abgetrennt werden kann.
Die Substanz kann den vorstehend erwähnten Verfahren unterworfen werden, nach dem ein Teil oder die Masse der Verunreinigungen durch Verfahren wie Veränderung des pH-Wertes oder der Zusammensetzung, Salzbildung, Ausfällen, Entfernen von Feststoffen, Adsorption oder Lösungsmittelextraktion entfernt worden sind.

In solchen Kulturlösungen sind selbstverständlich zahlreiche Verunreinigungen enthalten, beispielsweise Kohlenhydrate, Proteine, Salze, tierische und pflanzliche Stoffe sowie Mycele von Mikroorganismen und deren Umwandlungsprodukte. Alle diese Verunreinigungen enthalten die folgenden Substanzen

Kohlenhydrate . . Stärke, Zucker, wasserlösliche Kohlen-

hydrate usw.

Proteine ....... Aminosäuren, Casein, Fleischextrakt,

Protein, Pepton usw.

Tierische und

pflanzliche

Substanzen ... Proteinhaltige Substanzen, Fette,

Fettsäuren, Lipoide, Cellulose usw.

Salze .......... Ammonium- und Aminsalze, Alkali-

metall-, Calcium-, Magnesium-, Eisen-,

Mangan-, Kupfer-, Zink-Salze usw.

Umwandlungs-

produkte von

Mikroorganis-

men ......... Enzyme, proteinhaltige Substanzen,

Zucker, Polyalkohole, Fettsäuren usw.

Außer diesen Substanzen können auch synthetische Verbindungen, wie Harnstoff, verwendet werden. Die Zusammensetzung der Verunreinigungen des Materials ist sehr kompliziert und schwankt bei dem vorbehandelten Material je nach Art und Ausmaß der Vorbehandlung in Qualität und Menge. Bei vorbehandeltem Material können jedoch auch andere Verunreinigungen vorliegen, beispielsweise Mittel zur Einstellung des pH-Wertes, Ausfällmittel, Adsorbentien usw.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Dihydrostreptomycin aus den Stoffen auf verschiedene Weise unter Ausnutzung des Unterschiedes an physikalischen und chemischen Eigenschaften zwischen dem Dihydrostreptomycin und den Verunreinigungen gewonnen.
Eines dieser Verfahren beruht auf dem Unterschied in der Löslichkeit von Dihydrostreptomycin und den Verunreinigungen. Bei flüssigen Kulturen erhält man eine Dihydrostreptomycinlösung durch Filtrieren der Flüssigkeit, da sich das Dihydrostreptomycin vorzugsweise in den flüssigen Teilen ansammelt. Eine geringe Menge der aktiven Verbindung findet sich jedoch auch im Feststoff und kann beispielsweise durch Extraktion mit heißem Wasser gewonnen werden. In diesem Fall können proteinartige Verunreinigungen durch Einstellen des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt des Proteins oder durch Zugabe von Ausfällmitteln für die Verunreinigungen gleichzeitig, vor oder nach der Entfernung des Mycels ausgeschieden werden. Bei einem hohen pH-Wert des Fermentationsmediums läßt sich das Protein durch Zusatz einer sauren Substanz leichter ausfällen. Bei einer günstigen Konzentration des Dehydrostreptomycins in der Lösung kann das Antibiotikum einfach durch Zusatz eines geeigneten Ausfällmittels ausgefällt werden.
Bei ungenügender Dihydrostreptomycinkonzentration wird ein Teil des Lösungsmittels abgedampft. Als Ausfällmittel können beispielsweise Phosphor-Wolframsäure, Helianthin, Alkyl- oder Aralkylsulfonsäuren, saure Azoverbindungen und Polyhalophenolverbindungen verwendet werden. Alle diese Stoffe bilden mit Dihydrostreptomycin Salze. Außerdem körnen andere Ausfällmittel verwendet werden, die meistens saure Verbindungen mit einem Carboxylrest sind. In einigen Fällen ist das so gebildete Dihydrostreptomycinsalz ein Doppel- oder Komplexsalz. Wie nachstehend beschrieben, können auch Ionenaustauscher als Ausfällmittel verwendet werden. Das Ausfällen der aktiven Verbindung oder der Verunreinigungen kann gegebenenfalls auch durch Aussahen beschleunigt werden.
Bei festen Kulturen wird der Feststoff mit Wasser, einem wäßrigen oder sonst geeigneten Lösungsmittel extrahiert, um eine Dihydrostreptomy cinlösung zu erlangen. Wenn das Fermentationsmedium vorher zu einem Feststoff verarbeitet wird, kann, wie vorher beschrieben, vorangegangen werden, wobei die Extraktion bei einem geeigneten p1i-Wert erfolgt.
Andere Verfahren zur Abtrennung von Dihydrostreptomycin beruhen auf der unterschiedlichen Ädsorptionsfähigkeit der aktiven Verbindungen und der Verunreinigungen. Beispielsweise wird Dihvdrostreptomycin in dem Filtrat der Brühe durch den Zusatz eines geeigneten Adsorptionsmittels adsorbiert. Gegebenenfalls kann auch Adsorptionschromatografie angewendet werden. Geeignete Adsorptionsmittel sind beispielsweise Aktivkohle, Aluminiumoxyd- und Silicagel. Bei Abtrennung des Adsorptionsmittels verbleibt der größere Teil der Verunreinigungen im flüssigen Teil. Anschließend wird das Adsorptionsmittel mit einem geeigneten Lösungsmittel eluiert, wobei die nicht eluierbaren Verunreinigungen im Adsorptionsmittel bleiben. Das Eluieren wird üblicherweise mit einem sauren Lösungsmittel durchgeführt. Mit Chromatografie wird eine bessere Trennung bewirkt, dieses Verfahren ist jedoch schwieriger durchzuführen. Unterschiede im Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Lösungsmitteln bei der aktiven Verbindung und den Verunreinigungen können ebenfalls zur Abtrennung verwendet werden. Wasser oder eine wäßrige Lösung und ein organisches, hiermit nicht mischbares Lösungsmittel werden verwendet. Bei stark sauren Lösungsmitteln neigt die aktive Verbindung dazu, sich in dem wäßrigen Lösungsmittel zu verteilen. Dagegen geht die aktive Verbindung in das organische Lösungsmittel über, wenn neutrale oder basische Lösungsmittel verwendet werden und außerdem höhere Fettsäuren, Picrinsäure oder andere vorliegen. Die aktive Verbindung im Material kann auf diese «'eise mit einem organischen Lösungsmittel aufgenommen und dann in Wasser oder ein wäßriges Lösungsmittel übergeführt werden. Als organische Lösungsmittel werden beispielsweise Butanol, Pentanol, Phenol, niedrigere Fettsäureester, Methyl-isobutyl-keton, Diäthyläther und Halogenkohlenwasserstoffe, wie Chloroform sowie Kohlenstofftetrachlorid, verwendet. Dieses Verfahren kann in Form einer Verteilungschromatografie oder durch Verteilung im Gegenstrom erfolgen.
Die Abtrennung kann auch unter Verwendung des Unterschiedes der Stärke der Ionenbindung zwischen der aktiven Verbindung und den Verunreinigungen erfolgen. Dies geschieht beispielsweise dadurch, daß eine Lösung der aktiven Verbindung in Berührung mit einem Ionenaustauscher gebracht wird. Hierbei adsorbiert der Anionenaustauscher die Anionenverunreinigungen, die aktive Verbindung verbleibt in der Lösung und ein Kationenaustauscher adsorbiert die aktive Verbindung. Hierbei werden auch Kationenverunreinigungen adsorbiert, was aber durch Verwendung eines geeigneten Ionenaustauschers auf ein Minimum beschränkt werden kann. Austauschharze vom Sulfosäuretyp adsorbieren derartige Verunreinigungen leicht, während Austauschharze des Karbonsäuretyps wenig dazu neigen. Der lonenaustauscher kann absatzweise zugegeben werden, jedoch ist die Verwendung einer Kolonne mit Austauscherharz in vielen Fällen geeignet. Dieses Verfahren kann auf eine verdünnte Lösung der aktiven Verbindung wie das Filtrat einer Kultur angewendet werden.
Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht können auch durch Dialyse entfernt werden, wozu aber schmierig durchführbare Verfahren benötigt werden.
Die vorstehend erwähnten Abtrennungsverfahren können je nach Art des Materials und nach dem Verwendungszweck des Produktes einzeln oder in Verbindung miteinander angewendet werden. Andere Verfahrensstufen können während, vor oder nach diesem Abtrennverfahren angewendet werden. `'Fenn das Material ein Fermentationsmedium ist, wird es nach der Züchtung filtriert, um die ausgefällten festen Stoffe zu entfernen. Die aktive Verbindung im Filtrat wird in einem Kationenaustauscher adsorbiert und anschließend mit einem sauren Lösungsmittel eluiert. Hierdurch wird eine konzentrierte Lösung der aktiven, eine geringe Menge an Verunreinigungen enthaltenen Verbindung erhalten. Gegebenenfalls wird die Lösung weiterkonzentriert und zur fast vollständigen Entfernung derVerunreinigungen einerAdsorptionschromatografie unterworfen. Die aktive Verbindung in der konzentrierten Lösung kann auch durch ein geeignetes Ausfällmittel ausgefällt werden. Der Niederschlag wird anschließend in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und eine Säure zugegeben, wonach das entsprechende Salz des Dihydrostreptomy cins erhalten wird. Bei Umkristallisieren des Produkts fällt das Salz in fast reinem Zustand an.
Bei all diesen Vorgängen kann das Filtrieren, Waschen, Erhitzen, Abkühlen, Vermischen, Destillieren, Verdampfen und Trocknen getrennt oder in Verbindung miteinander durchgeführt werden.
Um ein Zersetzen der aktiven Verbindung zu verhüten, werden alle Vorgänge unter nicht sehr sauren oder alkalischen Bedingungen durchgeführt. `'Wärme kann gegebenenfalls angewendet werden, aber vorzugsweise nicht zu lange. Im Gegensatz zu vielen anderen Antibiotikas ist DiliZ-drostreptomvcin in Fermentationsbrühen verhältnismäßig stabil, so daß alle Verfahrensstufen ohne Schwierigkeit durchgeführt werden können.
Das so hergestellte Dihydrostreptomycin wurde auf Grund folgender Tatsachen identifiziert A. Physikalische und chemische Eigenschaften 1. Das Infrarot-Absorptionsspektrum wurde an dem folgenden, aus dem erfindungsgemäßen und nachstehend als Antibiotikum IFO-3520 bezeichneten Produkt und handelsüblichen Dihydrostreptomycin beobachtet I Sulfat 1I Streptidin-Picrat III a-Methyl-penta-acetyl-diliydrostreptobiosaminid Wie aus den Fig. 1, 2 und 3 (entsprechend I, 1I und III) der Zeichnung hervorgeht, stimmen alle Spektren mit denen von authentischen Proben überein. In diesen Zeichnungen bezeichnet die nicht gestrichelte Kurve das Spektrum eines Antibiotikum-IFO-3520-Derivates und die gestrichelte Kurve die eines Derivates von Dihydrostreptomycin. Alle diese Spektren wurden in Nujol-Mull mit Natriumchloridprismen gemessen.
2. Die Ultraviolettspektren des Sulfats von Antibiotikum IFO-3520 und einer geprüften Vergleichsprobe von Dihydrostreptomycinsulfat stimmten überein, und es wurde keine besondere Adsorption beobachtet.
3. Der analytisch bestimmte Wert des Sulfats von Antibiotikum IFO-3520 stimmt mit dem theoretischen Wert von Dihydrostreptomycinsulfat überein.

Dihydrostreptomycinsulfat

((C21H41012Ni)2 - 3112S04):

Berechnet .... C 34,42, H 6,05, N 13,38, S 6,56;

gefunden ...... C 34,45, H 6,42,N 12,98, S 6,43,

C 34,11,H 6,54.

4. Das Sulfat von Antibiotikum IFO-3520 zeigt eine Drehung von (a) D -87,4° (c = 1, H20), während das Sulfat von Dihydrostreptomycin ein (a)117 - 86,0° aufweist.
Nach der Veröffentlichung von I. A. S o 1 o m o n s in >>Science.t, Bd. 109, S. 515 (1949), ist die spezifische Rotation von Dihydrostreptomycin (a) D -88°, nach F. J. Wolf und anderen in der Veröffentlichung »J. Am. Chem. Soc.(" Bd. 68, S. 2163 (1946), (a)D -88,5°.
5. Das Sulfat von Antibiotikum IFO-3520 schmilzt ebenso wie das Sulfat von Dihydrostreptomycin unter Zersetzung und Schwarzwerden bei 250 bis 255°.
6. Antibiotikum IFO-3520 und Dihydrostreptomycin reagieren beide negativ auf die Maltolreaktion, Streptomycin positiv.
7. Antibiotikum IFO-3520, Dihydrostreptomy ein und Streptomycin reagieren alle positiv auf die Sakaguchireaktion.

B. Lösungen von Antibiotikum IFO-3520, Dihydrostreptomycin und Streptomycin, jeweils als Sulfate, wurden in 0,1 n-Na 0 H in einer Konzentration von 5 mg/ccm 24 und 48 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und ihre antibakterielle Wirksamkeit gegen B. subtiles durch die Verdünnungsmethode bestimmt, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden.

Unmittelbar nach dem Lösen Nach 24 Stunden Nach 48 Stunden

Sulfat von Antibiotikum

IFO-3520 . . . . . . . . . . . . . . 10 000 Einheiten/ccm >10 000 Einheitenjccm 15 000 Einheiten/ccm

Dihydrostreptomycinsulfat . . 15 000 Einheiten/ccm > 10 000 Einheiten/ccm 15 000 Einheiten/ccm

Streptomycinsulfat . . . . . . . . . 10 000 Einheiten/ccm >100 Einheiten/ccm 75 Einheiten/ccm

Daraus geht hervor, daß das Sulfat von Antibiotikum IFO-3520 unter alkalischen Bedingungen ebenso stabil wie das Sulfat von Dihydrostreptomycin ist.

9. 30 mgiecm Semicarbazid wurden jeweils zu den wäßrigen Lösungen der Sulfate von Antibiotikum IFO-3520, Dihydrostreptomycin und Streptomycin zugegeben und die antibakterielle Wirksamkeit der drei Antibiotika nach 4 Stunden Stehen bei Raumtemperatur durch die Verdünnungsmethode bestimmt. Hierbei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Ohne Zusatz 4 Stunden nach Zusatz

von Semicarbazid von Semicarbazid

Sulfat von Antibiotikum IFO-3520 (10 mg/ccm) ....... 35 000 Einheiten/ccm 35 000 Einheiten/ccm

Dihydrostreptomycinsulfat (10 mg/ccm) . . . . . . . . . . . . . . 35 000 Einheiten/ccm 50 000 Einheiten/ccm

Streptomycinsulfat (10 mg/ccm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 000 Einheiten/ccm <5000 Einheitenlccm

30 mg/ccm Lösung des Semicarba.zids haben eine Wirksamkeit von 75 Einheiten/ccm.

10. 1 mgiccm Cvstein wird jeweils zu den wäßrigen Lösungen des Sulfats von Antibiotikum IFO-3520, Dihydrostreptomycin und Streptomycin zugegeben und die antibakterielle Wirksamkeit der drei Antibiotika gegen B-subtiles nach 4stündigem Stehen bei Raumtemperatur durch das Verdünnungsverfahren bestimmt. Hierbei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten

Ohne Zusatz von 4 Stunden nach Zusatz

Cystein von Cystein

Sulfat von Antibiotikum IFO-3520 (5 mg/ccm) . . . . . . . . 15 000 Einheiten/ccm 15 000 Einheiten/ccm

Dihydrostreptomy cinsulfat (5 mg " ccm) . . . . . . . . . . . . . . 15 000 Einheiten/ccm 15 000 Einheiten/ccm

Streptomycinsulfat (5 m.g(ccm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 000 Einheiten/ccm 7500 Einheiten/ccm

1 mg/ccm Cysteinlösung hat eine Wirksamkeit von 100 Einheiten/ccm.

Die Aktivität des Sulfats von Antibiotikum IFO-3520 geht durch den Zusatz von wenig Semicarbazid und Cystein wie bei dem Sulfat von Dihydrostreptomycin nicht verloren. 11. Der qualitative Nachweis von Carbonylresten ist negativ, wie aus nachstehender Tabelle hervorgeht.

Fehlingsche Lösung Phenol-Konz.-H=S04 1 Silberspiegelreaktion

Sulfat von Antibiotikum IFO-3520 . . . . . . . . negativ keine Färbung braun, klar

Dihydrostreptomycinsulfat . . . . . . . . . . . . . . . negativ keine Färbung braun, klar

Streptomycinsulfat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . brauner Niederschlag tiefbraun schwarzbrauner

Niederschlag

12. Streptidin-picrat wird aus Antibiotikum IFO-3520 nach dem Verfahren von F. H. Stodola und anderen (J. Am. Chem. Soc., Bd. 73, S. 2290 [1951]) auf folgende Weise gewonnen 2 g des Hydrochlorids von Antibiotikum IFO-3520 werden in 100 ccm wasserfreiem Methanol mit einem Gehalt von 10/, Chlorwasserstoff gelöst. Es vIrd 48 Stunden bei Umgebungstemperatur stehengelassen, 200 ccm Äther der Lösung unter Rühren zugegeben und das in Form weißer Kristalle anfallende Streptidinhydrochlorid durch Zentrifugieren abgetrennt, die Kristalle in 20 ccm Wasser gelöst und eine gesättigte Picrinsäurelösung zugegeben. Nach mehrstündigem Stehen werden die ausgefällten Kristalle abgetrennt und aus Wasser umkristallisiert, wobei 400 mg Streptidinpicrat in Form gelblicher Nadeln anfallen. Schmelzpunkt 271 bis 273°C.

Analyse für C,H"O,N, . 2 C,H,N30,:

Berechnet .... C 33,34, H 3,36, N 23,33;

gefunden ..... C 33,46, H 3,44, N 23,49.

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Picrats entspricht dem Picrat des Dihydrostreptomycins, wie vorstehend unter 1 beschrieben.

Das Filtrat des vorstehend erwähnten Streptidinhydro-Chlorids wird mit einer methanolischen Lösung von Natriumhydroxyd neutralisiert, das anfallende Natriumchlorid durch Zentrifugieren abgetrennt und das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert, wobei ein weißes Pulver zurückbleibt. Der Rückstand wird in 20 ccm Pyridin gelöst und 7 ccm Essigsäureanhydrid zu-' gegeben. Nach dem Stehen über Nacht wird Wasser zu der Reaktion dazugegeben und das Lösungsmittel abdestilliert. Nach Umkristallisieren des Rückstandes aus Methanol wird a-Methyl-petaacetyl-äihydrostreptobiosaminid als farblose Nadeln in einer Ausbeute von 700 mg erhalten, Schmelzpunkt 194,5, C.

Cis His N 0a (C H, C 0)s (0 C HJ

Berechnet .... C 51,15, H 6,62, N 2,49;

gefunden ..... C 51,09, H 6,73, N 2,40;

( 17 # -

a)D - 120,0- (c = 1 "A, Chloroform).

Das Infrarotabsorptionsspektrum des erhaltenen Produktes zeigt gute Übereinstimmung mit dem aus Dihydrostreptomycin erhaltenen a-Methyl-petaacetyl-dihydrostreptobiosaminid, wie unter 1 oben beschrieben.
ß - Methyl - petaacetyl - dihydrostreptobiosaminid wird aus Antibiotikum IFO-3520 nach dem Verfahren von N. G. Brink (J. Am. Chein. Soc., Bd. 68, S. 2557 [1946]) auf folgende Weise gewonnen: 10 g Hydrochlorid von Antibiotikum IFO-3520 werden in 500 ccm Methanol gelöst, das 10/, Chlorwasserstoff enthält. Nach Stehen über Nacht bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird in 750 ccm Methanol gelöst und 450 ccm Äther zugegeben. Die Lösung wird durch eine mit 210 g säuregewaschenem und mit einer Mischung von Methanol-Äther im Verhältnis 2 : 1 imprägniertem Aluminiumoxyd gefüllte Kolonne geleitet. Anschließend wird die Kolonne mit 1000 ccrn einer Methanol-Äther-Mischung (im Verhältnis 3:2) gewaschen. Das austretende Produkt wird unter verringertem Druck zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird acetvliert, indem man ihn über Nacht bei Umgebungstemperatur mit 10 ccm Essigsäureanhydrid und 10 ccm Pyridin stehenläßt. ?anschließend wird Wasser zugegeben und die Lösung im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst und die Chloroformlösung nacheinander mit Wasser, verdünnter Schwefelsäure und wieder Nasse?- gewaschen. Nach Abdestillieren des Chloroforms wird der bräunliche feste Rückstand etwa 2 Minuten mit 100 ccm Äther zum Sieden gebracht und die Ätherlösung abdekantiert. Das gleiche Verfahren wird wiederholt. Die in Äther unlösliche Fraktion wird aus Methanol umkristallisiert und a-Methylpentaacetyl-dihydrostreptobiosaminid mit einem Schmelzpunkt von 194,5°C erhalten. Die Ätherlösung wird auf etwa 50 ccm aufkonzentriert und Petroläther zugegeben, wobei weiße Kristalle erhalten werden.
Umkristallisation aus Methanol ergibt etwa 100 mg ß-Methyl-pentaacetyl-dihydrostreptobiosaminid,Schmelzpunkt 155 bis 156°C. Beim Mischen mit dem ß-Isomeren durch die angegebene Methode, gewonnen aus Dihydrostreptomycin, trat keine Schmelzpunktsdepression auf.

C, Hr s N 0, (C H3 C 0)s (0 C H3)

Berechnet .... C 51,15, H 6,62, N 2,49;

gefunden ..... C 50,71, H 6,62, N 2,65.

( 16 =

a) D - 36° (c = 10,. Chloroform).

Das Infrarotspektrum des erhaltenen Produktes zeigte gute Übereinstimmung mit dem aus Dihydrostreptomycin gewonnenen ß-Methyl-pentaacetyl-dihydrostreptobiosaminid.
Eine Lösung von 260 mg aus Antibiotikum IFO-3520 hergestelltem a-Methyl-pentaacetyl-dihydrostreptobiosaminirl in 10°/oiger Salzsäure wird 3 Stunden am Rückflußkühler gekocht. Nach dem Abkühlen wird die bräunliche Lösung mit Holzkohle entfärbt und im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird mit 1 ccm Essigsäureanhydrid und 3 ccm Pyridin bei Umgebungstemperatur acetyliert. Nach Zusatz von Wasser wird die Lösung zur Trockne verdampft. Der Rückstand wird in 50 ccm einer Benzol-Petroläther-Mischung (im Verhältnis von 7 : 3) gelöst. Die Lösung wird durch eine mit 4 g säuregewaschenem und mit Petroläther imprägniertem Aluminiumoxyd gefüllte Kolonne geleitet, wobei das acetylierte Produkt in dem säuregewaschenen Aluminiumoxyd adsorbiert wird. Die Kolonne wird mit 100 ccm einer Benzol-Chloroform-Mischung (7: 3) gewaschen, um die Substanz zu eluieren. Die austretende Flüssigkeit wird auf 10 ccm aufkonzentriert und 30 ccm Äther zur Kristallbildung zugegeben. Nach Umkristallisieren aus Chloroform- -Äther werden 25 mg Pentaacetyl-N-methyl-L-glukosamin in Form von Nadeln erhalten, Schmelzpunkt 158 bis 159°C.

C17 H25 N Oio

Berechnet . ... C 50,62, H 6,25, N 3,47;

gefunden ..... C 50,71, H 6,14, N 3,24.

(a)D" = - 102° (c = 0,70/" Chloroform).

Das Infrarotabsorptionsspektrum des erhaltenen Produktes zeigt vollständige Übereinstimmung mit dem aus Dihydrostreptomycin gewonnenen Pentaacetyl-N-methyl-L-glukosamin. Bei Mischung mit aus Dihydrostreptomycin gewonnenem Pentaacetyl-N-methyl-L-glukosamin wird keine Erniedrigung des Schmelzpunktes beobachtet.
13. Antibiotikum IFO-3520 wird mit Alkali unter ähnlichen Bedingungen wie die zur Hydrolyse von Hydroxystreptomycin verwendeten und von S. H. Stodola und anderen in J. Am. Chem. Soc., Bd. 73, S.2290 (1951), beschriebenen Bedingungen hydrolysiert, d. h., es wird eine Lösung von 2 g des Hydrochlorids von Antibiotikum IFO-3520 in 40 ccm 1 n-Na 0 H 3 Stunden auf 100°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wird mit Chlorwasserstoff angesäuert und aufgearbeitet. Es wurde jedoch keine Substanz erhalten, die der Maltolreaktion gegenüber positiv reagiert oder unter sauren Bedingungen extrahierbar ist, so daß also mit Antibiotikum IFO-3520 ein anderes Ergebnis als mit Streptomycin und mit Hydroxystreptomycin erhalten wird. Bei Durchführung des gleichen Experiments mit Dihydrostreptomycin wird ebenfalls das gleiche Ergebnis erhalten.
14. Zu 50 000 y/ccm einer wäßrigen Lösung von Antibiotikum IFO-3520 wird eine warme Methylorangelösung zugegeben, bis sich kein Niederschlag mehr bildet. Der Niederschlag wird filtriert und aus Methanol-Wasser (1 : 3) umkristallisiert, wobei das Helianthat in Form von Schuppen anfällt, Schmelzpunkt 222 bis 225°C, Wirksamkeit 340 Streptomycineinheiten /mg.

Dihydrostreptomycinhelianthat (C" H86 02r N18 S3)

Berechnet .... C 50,46, H 5,79, N 14,94, S 6,40;

gefunden ..... C 50,19, H 5,93, N 14,93, S 6,80.

C 50,84, H 5,95.

15. Durch Papierchromatografie wurden Streptomycin und Dihydrostreptomycin von F. H. S t o d o 1 a und anderen (J. Am. Chem. Soc., Bd.73, S.2290 [1951]) unter Verwendung eines Lösungsmittels aus wassergesättigtem Butanol mit einem Gehalt von 2 °/o p-Toluol-sulfonsäure und 2 11,1, Piperidin getrennt und beide Verbindungen durch ihre Bioautogramme unterschieden.
Nach dem gleichen Verfahren wurden die beiden vorstehend erwähnten Verbindungen und Antibiotikum IFO-3520 papierchromatografisch untersucht und ihre Bioautogramme unter Verwendung von B-subtilis als Testmikroorganismus untersucht. Hierbei zeigte Antibiotikum IFO-3520 eine Inhibitionszone an der gleichen Stelle wie das Dihydrostreptomycin.

16. Die kristallografisch--n Konstanten des Sulfats von Antibiotikum IFO-3520 wurden mit den von F. J. Wolf und anderen in "Science., Bd. 109, S. 519 (1949), berichteten Konstanten von Dihydrostreptomycirisnlfat verglichen und die Ergebnisse in nachfolgender Tabelle aufgeführt.

Sulfat von Antibiotikum Dilivdrostreptomycin-

IFO-3520 Sulfat

a 1,545 ± 0,002 1,552 ± 0,002

ß 1,556 ± 0,005 1,558 ± 0,004

y 1,564 ± 0,002 1,566 ± 0,002

B. Chemotherapeutische Wirkung Die wachstumsinhibierende Wirkung von Antibiotikum IFO-3520 auf den streptomycinempfindlichen Stamm H37Rv menschlicher Tuberkelbazillen liegt Fraktisch in der gleichen Höhe wie die von Dihydrostreptomvcin und beträgt 1 bis 2 y;ml in vitro. Es zeigte sich jedoch keine Hinderung des Wachstums des streptomycinresistenten Stammes von menschlichen Tuberkelbazillen. Die antibakterielle Wirksamkeit von Antibiotikum IFO-3520 auf Tuberkelbazillen in vitro ist verhältnismäßig hoch, und ihre chemotherapeutische Wirkung auf zu Versuchszwecken verursachte Tuberkulose von Mäusen und Meerschweinchen wurde deshalb, wie nachstehend beschrieben, weiteruntersucht 1. Chemotherapeutische Wirkung auf die zu Yersuchs7wecken hervorgerufene Tuberkulose von Mäusen (I) Mäuse werden intraperitoreal mit 0,1 mg (Maßgewicht) des in physiologischer Salzlösung (viable Einheit 8,106 suspendierten H 37 Rv-Stammes menschlicher Tuberkelbazillen infiziert. Am folgenden Tag wurde die Behandlung der infizierten Tiere mit 3,0 mg Sulfat des Antibiotikums IFO-3520 und 1,5 mg Dihydrostreptomycinsulfat pro Tag angefangen. Diese Drogen wurden einmal täglich für 18 Tage subkutan eingespritzt. 3 Wochen nach der Injektion waren alle Tiere tot. Eine bestimmte Menge feinzerteiltes Gewebe aus Lunge, Leber und Milz jedes dieser Tiere wurde zur Züchtung der Tuberkelbazillen in ein festes Ei eingeimpft. Die antituberkulose Wirksamkeit der Drogen wurde durch Zählen der in diesen Medien nach 4 Wochen entwickelten Tuberkelbazillenkulturen geschätzt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle enthalten.

Nicht behandelte Kontrollgruppe

Tier Nr.

7 . 8 1 9 10 11 G 12 13 14 1 15

Lunge .. 0 29I 0 1 0 I 10 13 16 . 30 57

Leber ... 0 1 26 5 ' 0 i 2 0

2 8 2

Milz .... 8 1>600 2 34 1228 70j 5 >600 247

Dihydrostreptomycinsulfat-(1,5 mg)-Gruppe

Tier \r.

3 I 4 5 6 7 8 [ 9 f 10

Lunge..... 0 0 0 0 0 0 0 0

Leber .... 0 0 1 0 0 0 0 0

Milz ...... 0 , 0 9 0 I 0 1 0 ( 2

Sulfat von Antibiotiliüm-IFO-3520-(3,0 mg)-Gruppe

Tier Nr.

2 3 4 5 6 7 8 : 9 10

I

Lunge ..... 0 0 0 0 0 0 0 I 0 0

Leber .... 0 ' 0 0 1 0 0 0 0 0

Milz ...... 5 6 1 3 9 1 4 21 18 0

.':us dieser Tabelle geht hervor, daß die subkutane Anwendung von 54mg Antibiotikum-IFO-3520-Sulfat eine beachtliche therapeutische Wirkung auf die zu Versuchszwecken hervorgerufene Tuberkulose von Mäusen hat und ebenso wirksam ist wie subkutan einaes:,@az«s Dihvdrostreptomycinsulfat in Mengen von 27 mg. 2. Chemotherapeutische ZVirkung auf die zu Versuchszwecken hervorgerufene Tuberkulose von Mäusen (1I) Mäuse werden intravenös mit 0,001 mg (Maßgewicht) des H 37 Rv-Stammes menschlichen, in 0,25 ccm physiologischer Salzlösung (viable Einheit 24 - 104) suspendierten Tuberkelbazillen infiziert. Die Behandlung der Tiere wurde am zweiten Tage nach der Infektion begonnen. Die Drogen wurden während eines Zeitraumes von 3 Wochen achtzehnmal wie folgt subkutan verabreicht. Alle Tiere waren 25 Tage nach der Infektion tot. Die chemotherapeutische Wirkung der Drogen wurde, wie vorstehend beschrieben, berechnet:

Dosierung der Medizin

Sulfat des Antibiotikums IFO-3520

1,5 mg/Tag 18mal subkutan

3,0 mg/Tag 18mal subkutan

Sulfat des Dihvdrostreptomvcins

1,5 mgiTag 18mal subkutan

Nicht behandelte Kontrollgruppe

Tier \r.

6 7 8 9 10 11 12 13 14

Lunge . . 198 1221 i> 600 88 113 310 li 72 166 338

Leber . . 2 141 25: 25 20 44 24 321 4

Milz ... 17 57 ' 549 110 372 103 83 > 60U 235

Dihydrostreptomycinsulfat-(1,5 mg)-Gruppe

Tier N r.

2 3 4 5 , 6 7 8 ' 9 j 10

Lunge . . 7 ! 61 I 5 58 10 I 0 44 10 I 0

Leber .. 3 I 1 0 0 ! 2 0 2 0 5

Milz ... 31 63 95 0 9 0 ' 43 68 ! 8

Sulfat von Antibiotiktlm-IFO-3520-(1,5 mg)-Gruppe

Tier \r.

2 3 4 5 I 6 7 I 8 ' 9 10

Lunge ....... 19 i 5 1 10 38 1 102 1 5

Leber ... ... 8 0 1 1 : 1 1 2 ! 4 0 0

Milz . . . . . . . . 155 29 7 14 75 29 48 116 176

Sulfat von Antibiotilz-um-IFO-3520-(3,0 mg)-Gruppe

"Tier Nr.

4 5 6 7 J 8 1 9 1 10

Lunge..... 0 1 43 9 0 ! 16 6

Leber ..... 0 ! 0 1 1 2 0 1 0

Milz ...... 10 ! 2 ; 12 11 11 7 0

Wie aus der vorstehenden Tabelle Hervorgeht, ist die therapeutische Wirkung von Antibiotikum IFO-3520 auf die zu Versuchszwecken hervorgerufene Tuberkulose von Mäusen ebenso beachtlich wie die von Dihydrostrc ptomvcin.

3. Chemotherapeutische Wirkung auf die zu Versuchszwecken hervorgerufene Tuberkulose von Meerschweinchen

Gesunde Meerschweinchen mit negativer Reaktion auf

den Tuberkulintest (0T., 1 : 40, 0,1 ccm intrakutan arge- ""

wendet, 48 Stunden) wurden subkutan mit 0,01 mg (Naßgewicht) des H 37 Rv-Stammes von menschlichen, in 0,5 ccm physiologischer Salzlösung (viable Einheit 35 # 105) suspendierten Tuberkelbazillen infiziert. Etwa 1 Monat nach der Infektion reagieren alle Tiere positiv auf das Tuberkulin. Zu diesem Zeitpunkt wurde an fünf willkürlich ausgewählten Tieren eine Autopsie durchgeführt und hierbei starke Tuberl"uloseschäden in den Organen der einzelnen Tiere festgestellt. Anschließend wurden die restlichen Tiere in vier Gruppen geteilt und, wie nachstehend beschrieben, behandelt. Nachdem die Drogen subkutan dreißig- und sechzigmal (etwa 10 bzw. 15 Wochen nach der Infektion) verabreicht worden waren, wurde an einigen Tieren jeder Gruppe eine Autopsie durchgeführt und die restlichen Tiere 6 Wochen nach Beendigung der Behandlung (21 Wochen nach der Infektion) getötet. Die Zahl der schweren tuberkulösen krankhaften Veränderungen an den Organen dieser Tiere wurde festgestellt und eine bestimmte Menge jeder der primär infizierten Lymphknoten in Lunge, Leber und Milz fein zermahlen und zur Züchtung von Tuberkelbazillen in Medien aus festem Ei eingeimpft. Die sich während der 6wöchigen Inkubationszeit entwickelnden Kulturen wurden gezählt, und auf Grund dieser Befunde die chemotherapeutische Wirkung der Droge auf die zu Versuchszwecken verursachte Tuberkulose von Meerschweinchen berechnet.

Dosierung der- Medizin:

1. Gruppe Sulfat von

Antibiotikum IFO-3520 ..... 10 mg/Tag subkutan

2. Gruppe Sulfat von

Antibiotikum IFO-3520 ..... 20 mg/Tag subkutan

3. Gruppe

Dihydrostreptomycinsulfat . . 10 mg/Tag subkutan

4. Gruppe

nicht behandelte Kontrollprobe

Die Zahl der durch Züchtung der Tuberkelbazillen erhaltenen Kulturen ist in den nachstehenden Tabellen aufgeführt.

Zahl der Tuberkelbazillenkulturen nach 6 Wochen Züchtung (10 mg feinzerteilte Lymphknoten, Lunge, Leber und Milz werden in Medien aus festem Ei eingeimpft) Nach der Autopsie kultiviert unmittelbar vor Beginn der Behandlung:

Tier Nr.

1 2 3 4 5

Lunge ......... 2 0 2 0 2

Leber .......... 8 2 8 13 1

Milz ........... 224 4 5 142 6

Lymphknoten .. >600 > 600 > 600 > 600 > 600

Nach der Autopsie kultiviert nach 30facher Verabreichung

(Gruppe 4)

Tier Nr.

11 1 12 13 1 14 1 15 1 16 1 17

Lunge ......... 0 0 I 0 97 18 83 0

Leber .......... 0 7 0 0 1 0 0

Milz ........... 0 2 19 91 56 8 10

Lymphknoten ... 0 141 518 315 209 352 188

(Gruppe 3)

Tier Nr.

5 1 6 7 8 1 9 1 10 11 12

I

Lunge ........ 7 1 0 93 0 0 0 0

Leber ......... 5 62 1 21 0 0 0 0

Milz .......... 23 17 7 0 0 0 1 0

Lymphknoten .. 62 32 22 !, 118 2 102I, 110 0

(Gruppe 1)

Tier N r.

2 3 4 5 @ 6 1 7 8 9

i

Lunge ......... 0 j 0 0 0 0 0 0 0

Leber .... ...... 0 0 0 0 0 0 0 0

Milz ........... 8 0 0 21 28 0 0 0

Lymphknoten ... 5 152 13 0 0 19 1134 40

(Gruppe 2)

Tier Nr.

4 1 5 1 6 7 1 8 1 9 10 11

Lunge ......... 0 0 0 0 0 0 0 0

Leber .......... 0 0 0 0 0 0 0 0

Milz ........... 0 0 0 0 3 0 0 0

Lymphknoten ... 3 3 3 0 0 36 0 35

Nach der Autopsie kultiviert nach 60facher Verab-

reichung

(Gruppe 4)

Tier Nr.

25 1 26 1 27 28 29

Lunge ......... 9 1 134 10 1

Leber .......... 7 0 0 0 2

Milz ........... 333 1 13 293 3

Lymphknoten ... 195 325 1 187 89 138

(Gruppe 3)

Tier Nr.

14 15 16 1 17 1 18 19 20

Lunge ........ 0 0 0 0 0 0 0

Leber .......... 1 0 0 0 0 0 0

Milz ........... 1 0 0 0 0 0 0

Lymphknoten ... 6 0 2 0 2 0 0

(Gruppe 1)

Tier Nr.

11 12 13 1 14 1 15 16 17

Lunge ........ 0 0 0 0 3 0 0

Leber .......... 0 0 0 0 0 0 0

Milz ........... 0 0 0 0 0 0 0

Lymphknoten ... 5 89 0 0 2 5 0

(Gruppe 2)

Tier Nr.

14 15 16 1 17 18 19 20

Lunge ........ 0 0 0 0 0 0 0

Leber .......... 0 0 1 0 0 0 0

Milz ........... 0 0 0 0 0 0 0

Lymphknoten ... 2 20 6 0 3 17 0

Nach der Autopsie kultiviert 6 Wochen nach dem Ende der Verabreichung.

(Gruppe 4*)

Tier Nr.

32 ! 33 J 34 1 35 J 36 1 37

Lunge ........ 84 4 > 600 11I 173I 0

Leber ......... 36 C**) 88 2 > 600 0

Milz . . . . . . . . . . 131 48 > 600 C**) @> 600 1

Lymphknoten .. > 600 8 l> 600 , 87 > 600 182

*) Vier von sechs Tieren starben während der letzten 3 Wochen

des Versuchs.

**) C bezeichnet Ansteckung.

(Gruppe 3)

Tier Nr.

23 24 1 25 26 ; 27

I

Lunge ......... 0 0 0 0 0

Leber .......... 0 4 0 0 0

Milz ........... 47 30 0 0 56

Lymphknoten ... 32 140 21 283 111

1 Sulfat von Antibiotikum IFO-3520 Dihydrostreptomycinsulfat

Intravenöse Injektion . . . . . . . . . . . 250 (219 bis 285) mg/kg 240 (215 bis 268) mg/kg

Subkutane Injektion ............ 2000 (1710 bis 2340) mg/kg 1800 (1450 bis 2250) mg/kg

Intraperitoneale Injektion ....... 1900 (1500 bis 2390) mg/kg 1700 (1430 bis 2020) mg/kg

C. Antibakterielles Spektrum Bei einem Vergleich der zur vollständigen Wachstumsinhibition von Testmikroorganismen erforderlichen Gewichtsmengen Antibiotikum IFO-3520-Sulfat und Dihydrostreptomycinsulfat wurden die folgenden Ergebnisse erhalten

Antibakterielles Spektrum

Sulfat von Dihydro-

Mikroorganismen Antibiotikum strepto-

IFO-3520 mycinsulfat

y/ml 7/-l

Staphylococcus aureus

Terajima ............... 1 1

Bacillus subtilis (PCI-219) .. 0,5 0,5

Salmonella typhosa ........ 64 64

Shigella dysenteriae ........ 1 1

Vibrio cholerae ............ 8 8

Proteus vulgaris ........... 8 8

Escherichia coli............ 4 4

Pseudomonas aeruginosa .... 32 32

Aspergillus niger .... ... > 100 > 100

Penicillium notatum........ > 100 > 100

Saccharomyces cerevisiae ... > 100 > 100

Candida albicans .......... > 100 > 100

Mycobacterium 607 ........ 2,0 2,0

Mvcobacterium avium ..... 1,0 1,0

Die vorstehend beschriebenen Verfahren werden in den Beispielen im einzelnen erläutert. In diesen Beispielen wird die Wirksamkeit von Antibiotica auf Grund des »zylinderplate" -Verfahrens unter Verwendung von Bazillus subtilis (PCI219) als Testorganismus geprüft, außer wenn das Prüfverfahren besonders aufgeführt wird.

(Gruppe 1)

Tier Nr.

19 1 20 1211221 23 1 24 f 251 26 1 27

Lunge . . . . . . . . 0 i 0 I 0 ; 0 0 0 0 0 0

Leber .. . . . .... 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Milz..........

000 0, 009212

Lymphknoten . . 48 34 4 1 1 98 190 7 60 116

(Gruppe 2)

Tier Nr.

21 I 22 23 ( 24 J 25 ' 26 f 27

Lunge ........ 0 0 0 0 0 0 0

Leber ......... 0 i 0 0 0 I 0 0 1

Milz .......... 3 0 0 0 i 0 0 87

Lymphknoten .. 1 30 2 I 10 118 2 35

4. Grad der Giftigkeit Die LDsö Werte von Sulfaten von Antibiotikum IFO-3520 und Dihydrostreptomycin in Mäusen (CF@ wurden nach dem Verfahren von Litchfield und Wilcoxon berechnet. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, weisen sie keinen wesentlichen Unterschied auf:

Beispiel 1

Grundmischung

Glucose............................... 2,00/0

Fleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,60/0

Pepton ............................... 1,0%

Kochsalz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,60/0

Calciumkarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,60/0

500 1 einer die obigen Bestandteile enthaltenden Brühe werden durch -- Erhitzen in einem geeigneten Gefäß sterilisiert. Ein Stamm von Streptomyces humidus wird eingeimpft und bei 27 bis 28' C etwa 96 Stunden unter aerobischen Bedingungen unter Bewegen wachsengelassen, wonach die Fermentationsbrühe die folgende antibakterielle Wirkung aufwies: 500 y/ml gegen B. subtiles.

Beispiel 2

Grundmischung

Flüssigkeit aus gequollenem Mais ....... 3 0/0

Stärke............................... 3 0/0

Pepton .............................. 0,5 0/ü

Kalium-di-hydrogenphosphat . . . . . . . . . . . 0,1 0/0

Magnesiumsulfat . . . . . . . . . . . . . . . . . . .... 0,05010

Calciumkarbonat...................... 0,3 0/0

50 ccm einer Kultur aus den vorstehenden Komponenten werden auf übliche Weise in einem Schüttelbecher sterilisiert. Ein Stamm von Streptomy ces humidus wird eingeimpft und 4 Tage unter Schütteln bei 27 -- 1 ° C gezüchtet, wonach die antibakterielle Wirkung der Fermentationsbrühe gegen B. subtiles 1200 y/ml beträgt. Beispiel 3 Ein Stamm H-120 von Streptomv ces humidus wird in verschiedenen ausgewählten Medien gezüchtet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle enthalten Die mit diesen Kulturen durchgeführten und in den Beispielen 3 bis 8 beschriebenen Versuche werden jeweils bei 26 bis 28° C unter Verwendung von 50 ccm des Mediums in einer 300-cm3-Flasche durchgeführt.

Maximale Wirksamkeit Zur Erzielung der

Medium des maximalen Wirksamkeit

Dihydrostreptomycins erforderliche Zeit in Stunden

Stärke-Bouillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 y/ml (mcg/ml) 120

Glucose-Bouillon . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225 y/ml (mcg/ml) 120

Stärke-Bouillon .................................. 211 y/ml (mcg/ml) 144

plus Ca C 03 3,00/ 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 y/ml (mcg/ml) 120

Glucose-Bouillon plus Ca C 03 3,011/0

(1) ............................................ 227 y/ml (mcg/ml) 120

(2) ............................................ 246 y/ml (mcg/ml) 96

(3) ............................................ 329 y/ml (mcg/ml) 120

(4) ............................................ 242 y/ml (mcg/ml) 120

(2) plus Hefeextrakt 0,5 °/° . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 315 y/ml (mcg/ml) 120

(1) Glucose........... 1,00/0 (2) Flüssigkeit am ge- (3) Glucose........... 2,00/0 (4) Stärke............ 0,50/0

Sojabohnenmehl .. 1,00j11 quollenen Mais.... 3,001, Fleischextrakt..... 0,60/0 Fleischextrakt..... 0,30/

/0

Pepton . . . . . . . . . . . 0,5010 Stärke . . . . . . . . . . . 3,00/0 Pepton . . . . . . . . . . . 1,00/. Hefeextrakt ....... 0,50

NaCl .. . . . . . . . . . . . 0,50 ; 0 Pepton . . . . . . . . . . . 0,5010 NaCl .. . . . . . . . . . . . 0,6()/, Pepton . . . . . . . . . . . 0,5 0%

CaCO........... 0,30/0 li2HP04......... 0,10/0 CaC03........... 0,60/0 Glucose........... 1,00/0

MgS04. 7 H20 .. 0,050/0 NaCl............. 0,30/0

Ca C03 . . . . . . . . . . . 0,30/0

Beispiel 4

Grundmischung

Stärke............................... 3,0 °/0

K,HP04 ............................ 0,1 °/°

MgS04 # 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05

CaCO3 .............................. 0,3 °/°

pH-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,0

Eine Flüssigkeit aus gequollenem Mais und Mehl aus Sojabohnen werden in verschiedenen Mengen der Grundmischung als Stickstoffquelle zugegeben und ein Stamm H-120 von Streptomyces humidus eingeimpft und gezüchtet, wobei die in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden

Stickstoffquelle Maximale Zur Erzielung

Wirkung des der maximalen

Flüssigkeit aus Bohnen- Dihydro- Wirksamkeit

gequollenem Mais mehl streptomycins erforderliche

0/0 0/0 y/ml (mcg/ml) Zeit in Stunden

3,0 1,0 468 120

- 3,0 288 144

3,0 2,0 499 144

Stickstoffquelle Maximale Wirksamkeit Zur Erzielung der

Flüssigkeit aus Sojabohnenmehl i von maximalen Wirksamkeit

gequollenem Mais (HCl-Hydrolysat) Andere Dihydrostreptomycin erforderliche Zeit

o% o110 0/0 7/ml (mcg/ml) Stunden

3,0 1,0 Mycel der Nr. IFO-3520

(naß) ................ 2,0 660 144

3,0 1,0 NH4N03............... 0,1 326 120

3,0 1,0 CO(NH2)............... 0,1 55 96

I CO(NH2)2..............0,1

3,0 1,0 { i 60 96

Schmieröl . . . . . . . . . . . . . . 1,0

3,0 1,0 ' (NH4)2HP04 .......... 0,1 411 120

3,0 1,0 KN0.................. 0,1 600 96

3,0 1,0 NH4C1 ................ 0,1 327 120

3,0 I 1,0 (NH4)2S04.............0,1 396 144

3,0 - Casein ................. 1,0 500 120

3,0 - Casein*)................ 1,0 1000 144

1,0 1,0 Reiskleie . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 30 168

*) Das Casein wird bei 100°C 1 Stunde mit etwa dem 10fachen ihres Volumens an 50/0igem HCl hydrolysiert. ..

Stickstoffquelle Maximale Zur Erzielung

Soja- Wirkung des der maximalen

Flüssigkeit aus ja- Dihydro- Wirksamkeit

gequollenem Mais bohnert- s.eptomycins erforderliche

0;o #/ o ehl y/ml (mcg/ml) Zeit in Stunden

1,5 1,0 417 120

3,0 0,5 372 144

3,0 1,0 * 968 144

*) Das Sojabohnenmehl wird durch Erhitzen bei 100°C während

einer Stunde mit dem 10fachen seines Volumens an 5%iger Salz-

säure hv_ drolv_ siert.

Beispiel 5

Grundmischung

Stärke............................... 3,0 0110

K,HP04 ............................ 0,1 °/°

Mg S 04 . 7 H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 °/°

Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3 °/°

pft-M'ert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,0

Ein Stamm H-120 von Streptomyces humidus wird in verschiedenen Medien gezüchtet, die außer den Grundbestandteilen eine Flüssigkeit aus gequollenem Mais und Sojabohnenmehl als hauptsächliche Stickstoffquellen sowie andere organische und anorganische Stickstoffquellen enthalten. In einigen Fällen wird kein Soj abohnenmehl verwendet. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt:

Beispiel 6

Grundmischung

Flüssigkeit aus gequollenem Mais ....... 3,0 0/0

Sojabohnenmehl (HCl-Hydrolysat) ..... 1,0 0/0

K2 H P O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 0/0

Mg S 04 - 7 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 0;'0

CaC 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3

px-Wert............................. 7,0

Ein Stamm Q-97 von Streptomyces liumidus wird in der Grundmischung gezüchtet, wobei die Kohlenstoffquelle variiert wird. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt

Maximale Zur Erzielung der

Kohlenstoffquelle Wirksamkeit des maximalen

Dihydro- Wirksamkeit

streptomycins erforderliche Zeit

0/a 7m1 (mcg/ml) in Stunden

Dextrin 3,0 1127 120

Stärke 1,0 600 120

Stärke 3,0 844 120

Glucose 1,0 592 120

Glucose 3,0 440 120

Maximale Zur Erzielung dei

Kohlenstoffquelle Wirksamkeit des maximalen

Dihydro- Wirksamkeit

streptomycins erforderliche Zei

7 ml (mcg ml) in Stunden

Glycerin 3,0 1 0 50 144

Lactose 3,0 90 96

Mannose 3,0 1368 144

Maltose 3,0 90 120

Galactose 3,0 1870 144

Fructose 3,0 1390 144

Saccharose 3,0 63 144

Beispiel 7

Grundmischung

Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0%

Flüssigkeit aus gequollenem Mais . . . . . . . . 3,0"/,

Sojabohnenmehl (HCl-Hydrolysat) ...... 1,0010

pH-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . ...... 7,0

Ein Stamm 0-97 von Streptomyces humidus wird in verschiedenen Medien gezüchtet, deren Stickstoffquelle Sojabohnenmehl und eine Flüssigkeit aus gequollenem Mais und deren Kohlenstoffquelle Dextrin ist, deren Zusammensetzung an anorganischen Salzen jedoch variiert wird. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.

Anorganische Salze Maximale Wirksamkeit Zur Erzielung der

Andere des maximalen Wirksam

KZHP04 MgsO,,# 7H20 CaC03 Dihydrostreptomycins keit erforderliche

o/0 % 0/a 0 ylml (mcg/ml) Zeit in Stunden

- 0,05 0,3 - 717 120

0,1 1 - 0,3 - 675 120

0,1 0,05 0,6 - 1230 144

0,1 0,05 0,3 *) 700 144

0,1 i 0,05 1,0 - 1260 120

0,1 0,05 0,3 ZnS0" 7 1120 ....... 0,001 639 144

0,1 0,05 0,3 MnS04 7 1120 ....... 0,002 555 144

0,1 0,05 0,3 FeS04 7 H20 ....... 0,002 1165 120

0,1 ! 0,05 0,3 Na2S04 ............. 0,1 1099 144

(wasserfrei)

0,1 0,05 0,3 CUS04. 5 H20 ....... 0,002 1038 120

*) Neutralisation des Hydrolysats aus Sojabohnenmehl und Einstellung des pH-Wertes erfolgt mit Kaliumhydroxyd.

Beispiel 8

Grundmischung

Dextrin ............................. 3,0 0/0

Flüssigkeit aus gequollenem Mais ....... 3,0 0/0

HCl-Hydrolysat von Sojabohnenmehl ... 1,0 0/0

KZ H P 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 0/a

Mg S 04 - 7 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 0('0

Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,37 0/0

p11-Wert . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,0

In dieser Grundmischung werden Mutanten gezüchtet, die man durch die Behandlung von Streptomyces humidus erhalten hat. Die Ergebnisse si :d in der nachstehenden Tabelle aufgeführt

Maximale Zur Erzielung

Wirksamkeit der maximalen

Stämme des Dihydro- Wirksamkeit

streptomycins -erforderliche Zeit

7/m1 (mcg(ml) in Stunden

IFO-3520

(ursprünglicher Stamm) 660 144

B-9 ................. 460 144

A-113 ............... 846 120

C-46 ................ 792 120

E-96 ................ 433 144

H-106 ............... 1220 144

K-34 ................ 1248 144

UD-1 ................ 1308 144

Q-97 ................ 1296 144

VD.................. 886 144

Maximale Zur Erzielung

Wirksamkeit der maximalen

Stämme des Dihydro- Wirksamkeit

streptomycins erforderliche Zeit

g; ml (mcg-ml) in Stunden

N ................... 931 144

Tu ..... . ...... - - - - - - 574 120

Vp .................. 976 120

Vu .................. 1235 144

L ................... 840 120

Y ................... 966 120

G ................... 374 120

0 ................... 1085 120

Beispiel 9

Grundmischung

Glucose............................... 2,0°;0

Fleischextrakt ........................ 0,6%

Pepton ............................... 1,00/0

Nacl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,601/0

CaC 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,6010

pH-Wert . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . .. . .. . . . . 7,0

Ein Stamm der Streptomyces humidus wird in einem Tank 96 Stunden aerob gezüchtet. Zu 700 1 der filtrierten Kultur (pH-Wert 8,5; Wirksamkeit: 35 Verdünnungseinheiten/Ccm gegen E. coli) werden 7 kg (10;'0) Aktivkohle zugegeben und die Mischung 30 Minuten gerührt, um die aktive Verbindung zu adsorbieren. Die Aktivkohle wird 30 Minuten bei einem pH-Wert von 2,0 mit dem 10fachen ihres Volumens an methanolischer Salzsäure eluiert, wobei 1401 Eluat (Wirksamkeit: 100 Verdünnungseinheiten; ccm) erhalten werden.

Der Eluiervorgang wird wiederholt und etwa 701 Eluat mit einer Wirksamkeit von 35 Verdünnungseinheiten iccm erhalten. Die vereinigten Eluate werden mit n-Na 0 H auf einen pH-Wert von 6,5 neutralisiert und im Vakuum bei niedriger Temperatur auf etwa 300 ccm konzentriert. Während des Vorgangs wird das abgetrennte Natriumchlorid hin und wieder entfernt. Zu der Konzentratlösung werden 31 wasserfreies Aceton zugegeben und die ausgefällte aktive Verbindung im Vakuum zu weißem Pulver getrocknet. Die Ausbeute beträgt 147 g (600/0), Wirksamkeit: 100 Verdünnungseinheiten/ccm. Das Produkt reagiert der Maltolreaktion gegenüber negativ, der Sakaguchireaktion gegenüber positiv. Beispiel 10 Reinigung durch Ionenaustauscher a) 500 1 der wie im Beispiel 9 hergestellten filtrierten Kultur (p11-Wert 7,7; Wirksamkeit: 350 Verdünnungseinheiten/ccm gegen E. coli) werden mit einer Geschwindigkeit von 1,8 1'niin durch einen Turm geleitet, der mit 30 1 eines kationenaustauschenden Kunstharzes (Carbonsäurety-p) gefüllt ist. Die Wirksamkeit der ausfließenden Flüssigkeit beträgt weniger als 10 Verdünnungseinheiten; ccm gegen E. coli. Das Harz wird mit Wasser gewaschen und mit 0,5 n-H Cl eluiert, wobei 36 1 an gefärbtem Eluat mit einer Wirksamkeit von 3500 Verdünnungseinheiten/ ccm gegen E. coli erhalten «erden. Das Eluat wird mit n-NaOH auf einen p11-Wert von 6,5 eingestellt und auf 1 1 mit einer Wirksamkeit von 160000 Verdünnungseinheiten/ccm (91,5 0/0) bei niedrigen Temperaturen unter verringertem Druck aufkonzentriert, wobei das abgeschiedene Natriumchlorid gelegentlich entfernt wird.
b) Zu 748 1 der nach dem Verfahren des Beispiels 9 erhaltenen filtrierten Kultur mit einem Dihydrostreptomycingehalt von etwa 2200 y,'ml werden 4,1 kg Oxalsäure zugegeben und der erhaltene Niederschlag durch einen Abscheiden des De-Laval-Typs entfernt. Der pg-Wert wird mit Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von etwa 7,0 eingestellt und der erhaltene Niederschlag entfernt. Anschließend wird die Lösung mit einer Geschwindigkeit von 40 1/Std. durch eine Säure geleitet, die mit 6,3 1 eines Kunstharzes des obigen Typs (Na-Typ) gefüllt ist, wonach die austretende Flüssigkeit nur noch eine Wirksamkeit von 12 bis 6 yiml aufweist. Das Harz wird mit Wasser gewaschen und die aktive Verbindung durch Durchleiten von 40/ 0iger Salzsäure durch den Turm mit einer Geschwindigkeit von 31/Std. eluiert.
20 1 des erhaltenen Ehiats werden durch Zugabe eines Kunstharzes (OH-Typ) neutralisiert und bei niedriger Temperatur unter verringertem Druck auf 2,51 mit einer Wirksamkeit von 368000 y/ml konzentriert.
Beispiel 11 Extraktion mit organischen Lösungsmitteln Zu 1 1 des nach dem Verfahren des Beispiels 10, b) hergestellten Kulturfiltrats mit einer Wirksamkeit von 1,001 y/ml gegen B. subtilis werden 400 ccm n-Butanol (oder Isoamylalkohol) mit einem Gehalt von 3 % Laurylsäure zugegeben, die wäßrige Schicht auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und die Mischung 20 Minuten geschüttelt. Nach Abtrennung der Butanol- oder Isoamylalkoholschicht wird die gleiche Extraktion nochmals wiederholt. Der Turm wird mit destilliertem Wasser behandelt, das mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt ist. Die vereinigten Butanol- (oder Isoamylalkohol-) Lösungen werden mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser derart geschüttelt, daß die erhaltene wäßrige Schicht 120 ccm beträgt und einen pH-Wert von 2,0 hat. Nach Wiederholung der gleichen Extraktion werden die vereinigten Extrakte mit Äther geschüttelt, die darin enthaltene Laurylsäure zu entfernen. Die Wirksamkeit der erhaltenen Lösung (250 ccm) beträgt 2891 y/ml gegen B. substilis, oder 72,50 :'0 der Ausbeute.
Beispiel 12 Über Aktivkohle cliromatografiert 1 1 einer nach dem Verfahren des Beispiels 10, a) hergestellten Lösung mit einer Wirksamkeit von 160000 Verdünnungseinheiten 'iccm gegen E. coli wird mit n-HCl auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt und durch eine 50 cm hohe Säule mit einem Durchmesser von 8 cm geleitet, die mit 500 g mit Wasser eines pH-Wertes von 3,5 imprägnierter Aktivkohle gefüllt ist. Die austretende Flüssigkeit wird in Teile von 300 ccm aufgeteilt. Die Fraktionen 1 bis 11 enthalten Natriumchlorid und Verunreinigungen, die anderen Fraktionen die aktive Verbindung wie nachstehend aufgeführt

Wirksamkeit gegen

Fraktion Sakaguchireaktion E. coli (Verdünnungs-

einheiten/ccm)

12 +-- 15000

13 bis 21 i +-- 30000

22 +++ 5000

23 bis 27 +++ 3000

28 bis 29 4- -@ 3000

Die Fraktionen 13 bis 21 werden vereinigt, durch Zusatz eines anionenaustauschenden Kunstharzes des tertiären Amintyps auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und bei niedriger Temperatur unter verringertem Druck konzentriert. Zu dieser konzentrierten Lösung wird das 10fache ihres Volumens an wasserfreiem Aceton zugegeben und der erhaltene Niederschlag durch Dekantierten abgetrennt und getrocknet, wobei 101 g des Hydrochlorids als farblose amorphe Substanz (783,3 yiml in Form von Dihydrostreptomycin) anfallen. Zu einer Lösung von 10 g dieses Produktes in 5 ccm Wasser wird eine Lösung von 6 g Mg SO, - 7 H20 in 7 ccm Wasser zugegeben. Die Mischung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und filtriert und Methanol tropfenweise unter Rühren so lange zugesetzt, bis eine Trübung eintritt, wobei die Temperatur der Mischung auf 50 bis 55° C gehalten wird. Es werden einige Kristalle von Dihydrostreptomycin-Sulfat zu der trüben Lösung zugegeben und diese bei 50 bis 55° C stehengelassen, wobei die Lösung die Kristalle nach etwa 5 Minuten abscheidet und dabei gleichzeitig klar wird. Weiteres Methanol wird zugegeben, bis die Lösung wieder etwas trübe wird und die Mischung dann stehengelassen. Dieser Vorgang wird so lange wiederholt, bis insgesamt 100 ccm Methanol zugegeben sind und die Mischung klar ist. Danach wird die Temperatur der Mischung auf Umgebungstemperatur verringert, die Kristalle abfiltriert und in 50°/Qigem Methanol 5 Minuten gerührt. Die Kristalle werden wieder abfiltriert, mit Methanol gewaschen und unter verringertem Druck bei 50° C getrocknet. Die Ausbeute beträgt 8,9 g (738 y/ml als Dihydrostreptomycin). Durch mehrfaches Umkristallisieren wird die Wirksamkeit auf etwa 780 -g/ml Dihydrostreptomycin erhöht. Es wurde gefunden, daß bei dem vorstehend beschriebenen Vorgang das Mg S04 histaminartige Substanz in dem Material zerstört.
Beispiel 13 5 ccm des nach dem Verfahren des Beispiels 10, b) erhaltenen Konzentrats an aktiver Verbindung mit einer Wirksamkeit von 368000 y,iml werden mit Wasser auf 50 ccm verdünnt und eine warme gesättigte Lösung von Methylorange zugegeben, bis kein Niederschlag mehr ausfällt. Nach dem Abkühlen wird der Niederschlag filtriert und wiederholt aus wäßrigem Methanol umkristallisiert, wobei 2,1 g des Helianthats der aktiven Verbindung erhalten werden. Eine Suspension des Helianthats in einer geringen Menge Wasser wird mit verdünnter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt, wobei die aktive Verbindung gelöst und ihr Sulfat gebildet wird. Die Lösung wird filtriert, um das ausgefällte Methylorange zu entfernen, und mit einer geringen Menge Aktivkohle behandelt. Zu der erhaltener. farblosen Lösung wird das 10fache ihres Volumens an wasserfreiem Aceton zugegeben, wonach 0,6 g des Sulfats der aktiven Verbindung ausgefällt werden.

Claims

PATENTANSPRUCH: Die Verwendung von Streptomy ces humidus nov. sp. Nakazawa et Shibata (IFO-3520, hinterlegt bei Institute for Fermentation, Osaka, Japan) oder seiner dihydrostreptomycinerzeugenden natürlichen oder induzierten Mutanten oder Varianten, zur Herstellung des Antibiotikums Dihydrostreptomycin auf biologischem Wege unter den üblichen Bedingungen, vorzugsweise im submersen Verfahren und Gewinnung des Antibiotikums durch bekannte Verfahren wie Extraktion oder Adsorption aus der Nährflüssigkeit sowie gegebenenfalls Überführung in seine Salze.