DE102013204728A1

DE102013204728A1 - Mikroorganismenstamm und Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern

Info

Publication number: DE102013204728A1
Application number: DE102013204728.2A
Authority: DE
Inventors: Rupert Pfaller
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2013-03-18
Filing date: 2013-03-18
Publication date: 2014-09-18
Also published as: WO2014146881A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern (Pentosen). Der Mikroorganismenstamm der Gattung Raoultella, Klebesiella, Bacillus oder Paenibacillus enthaltend ein poxB Gen ist dadurch gekennzeichnet, dass das poxB Gen inaktiviert ist und es sich bei dem in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommenden Zucker um eine Pentose handelt welche aus Hemicellulose gewonnen wurde.

Description

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismenstamm und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Verbindungen aus C5-Zuckern (Pentosen) mit Hilfe dieses Stammes.
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine oder auch Plattformchemikalien genannt) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2-Baustein), Glycerin, 1,3-Propandiol, 1,2-Propandiol, Milchsäure, 3-Hydroxypropionsäure (C3-Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol, 1,4-Butandiol, Acetoin, Diacetyl oder auch 2,3-Butandiol (C4-Bausteine). Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Für die Wirtschaftlichkeit dieser fermentativen Verfahren ist dabei entscheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen die billigsten verfügbaren Rohstoffe effizient in das gewünschte Produkt umsetzen können.
Ein auf fermentativem Weg zugänglicher C4-Baustein (C4-Plattformchemikalie) ist 2,3-Butandiol. Der Stand der Technik zur fermentativen 2,3-Butandiol Herstellung ist zusammengefasst in Celinska und Grajek (Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 und in Ji et al., Biotechnol. Adv. (2011) 29: 351–364).
Aus dem mikrobiellen 2,3-Butandiol Biosyntheseweg (siehe Gleichungen (I) bis (III)) sind neben 2,3-Butandiol noch weitere Verbindungen mit vier C-Atomen fermentativ zugänglich, nämlich Acetoin und davon durch Oxidation abgeleitet auch Diacetyl.
2,3-Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C4-Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3-Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK). Außerdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2-Bausteine) wie Essigsäure ( US2012288908 AA ) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2,3-Butandiol sind auch C8-Verbindungen denkbar, die Verwendung z. B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthetische Weg zu 2,3-Butandiol ist bekannt (siehe z. B. Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725) und führt vom zentralen Stoffwechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2,3-Butandiol:
Reaktion der Acetolactatsynthase: Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von CO₂.
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase: Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Reaktion der Acetoinreduktase (2,3-Butandioldehydrogenase): NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2,3-Butandiol.
Der Stand der Technik offenbart Verfahren zur Herstellung von 2,3-Butandiol, die hauptsächlich auf der Verwendung von Glucose als Fermentationsrohstoff (C-Quelle) beruhen (siehe z. B. WO 12104234 A1 ). Um 2,3-Butandiol und auch andere C4- und C2-Plattformchemikalien wie Acetoin, Ethanol und Essigsäure wirtschaftlich, d. h. konkurrenzfähig zur Produktion aus petrochemischen Rohstoffen, herstellen zu können, ist Glucose nicht der bevorzugte Fermentationsrohstoff. Glucose ist eines der Basisprodukte in der Nahrungsmittelindustrie (vor allem hergestellt aus Stärke, Zuckerrohr oder Zuckerrübe) und wird mittlerweile auch verstärkt zur Bioethanol Herstellung eingesetzt. Bei der dadurch hervorgerufenen steigenden Nachfrage ist mit einer stetigen Verteuerung des Rohstoffs Glucose zu rechnen. Da der Fermentationsrohstoff einer der kostenbestimmenden Faktoren bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien ist, wird verstärkt nach Alternativen gesucht. Da grosstechnische, auf Glucose als Fermentationsrohstoff beruhende Fermentationsverfahren eine unerwünschte Konkurrenz zu dessen Verwendung als Nahrungsmittel darstellen, gibt es auch gewichtige sozialpolitisch motivierte Gründe für die Suche nach alternativen Fermentationsrohstoffen.
Unter den alternativen Fermentationsrohstoffen fällt lignozellulosehaltiger Biomasse eine zentrale Bedeutung zu. Sie fällt in der Land- oder Forstwirtschaft als Stroh, Bagasse oder als Abfall der Holzverarbeitung in großen Mengen ohne entsprechende Verwertungsmöglichkeiten an. Entsprechend gibt es große Anstrengungen, wertsteigernde Verwendungsmöglichkeiten für Bestandteile der Lignozellulose zu finden.
Lignozellulosehaltige Biomasse besteht aus den drei Hauptkomponenten Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Schwerpunkt bei der Verwertung von Lignozellulose ist die Gewinnung von Glucose aus Cellulose, v. a. zur fermentativen Gewinnung von Bioethanol. Die Gewinnung von Glucose aus Cellulose ist ein vergleichsweise aufwendiger und teurer Prozess, der gegenwärtig mit der konventionellen Herstellung aus Nahrungsmittelpflanzen nicht konkurrieren kann.
Hemicellulose ist nach der Cellulose das am häufigsten in der Natur vorkommende Polysaccharid (Saha, J. Ind Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279–291) und daher als Quelle zur Gewinnung von Zucker für die Fermentation von großem Interesse.
Vergleichsweise einfach zugänglich sind die in der Hemicellulose enthaltenen Zucker, darunter vor allem die am häufigsten vorkommende Xylose und auch Arabinose. Verschiedene Verfahren der Extraktion von Zuckern aus Hemicellulose sind dem Fachmann bekannt, darunter solche, die auf hydrothermal, thermisch bei saurem pH oder enzymatisch mit Xylanasen durchgeführter Hydrolyse der Hemicellulose beruhen (Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279–291).
Xylose (vor allem D-Xylose, CAS Nummer 58-86-6) als Hauptbestandteil der Hemicellulose ist eines der am häufigsten in der Natur vorkommenden Kohlenhydrate. Xylose ist an sich ein Abfallstoff, der nur begrenzt Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie findet (z. B. zur Herstellung des Süßstoffes Xylitol, Saha, J. Ind. Microbiol. Biotecanol. (2003) 30: 279–291) und wegen fehlender Verstoffwechslung der Xylose durch die industriell eingesetzten Fermentationshefen auch nicht zur Herstellung von Bioethanol im großtechnischen Maßstab geeignet ist.
Diese Faktoren, billiger und in großen Mengen verfügbarer Rohstoff, vergleichsweise einfache Isolierung und geringe Nachfrage nach alternativer Verwertung machen Xylose zu einem attraktiven Fermentationsrohstoff bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien, besonders bei der fermentativen Herstellung der C4-Produkte 2,3-Butandiol oder Acetoin und hier insbesondere bei der Verwendung des fermentativ hergestellten 2,3-Butandiols oder Acetoins zur Gewinnung von Essigsäure durch Gasphasenoxidation.
Verschiedene natürliche Produzenten von 2,3-Butandiol sind bekannt, z. B. aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus oder Lactococcus. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt (z. B. Bäckerhefe).
Die meisten bakteriellen Produzenten sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also großtechnisch nicht ohne aufwendige und kostenintensive technische Sicherheitsmaßnahmen eingesetzt werden (dazu und zu weiteren mikrobiellen 2,3-Butandiolproduzenten siehe Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725). Dies würde ebenso für bisher nicht beschriebene gentechnisch optimierte Produktionsstämme basierend auf diesen Stämmen gelten.
Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicherheitsstufe” und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z. B. in „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", S. 9ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U. S.) (Editor), Public Health Service (U. S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor), Herausgeber: U. S. Dept. of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN-10: 0160850428.
Für eine kosteneffiziente großtechnische Produktion von C4-Produkten, insbesondere 2,3-Butandiol, sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe S1 bevorzugt. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen Produktausbeuten beschrieben. Bekannte 2,3-Butandiol Produktionsstämme aus der biologischen Sicherheitsstufe S1 sind Stämme der Arten Raoultella terrigena, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Paenibacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis. In der Fachliteratur (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) wurden verschiedene, ursprünglich der Gattung Klebsiella zugeordnete Bakterienspezies genetisch analysiert. Aufgrund der gefundenen Heterogenität (siehe in Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) wurden Stämme der ursprünglich Klebsiella terrigena benannten Art taxonomisch neu eingeordnet und innerhalb der neu geschaffenen Gattung Raoultella in die Art Raoultella terrigena umbenannt. Bakterienstämme der Arten Klebsiella terrigena und Raoultella terrigena bezeichnen somit Stämme der gleichen Art, sind aber verschieden von anderen Stämmen der Gattung Klebsiella.
Nur für wenige der bekannten 2,3-Butandiol produzierenden Stämme ist eine fermentative Herstellung aus Xylose beschrieben. Für Klebsiella pneumoniae, einem Mikroorganismus der biologischen Sicherheitsstufe S2, wurde die fermentative Herstellung der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin aus den C-Quellen Xylose und Glucose verglichen (Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635). Die dabei erzielten C4-Ausbeuten betrugen 88 g/l für Xylose als C-Quelle und 112 g/l für Glucose als C-Quelle. Dabei war die Fermentationsdauer zur Erlangung der maximalen C4-Ausbeute mit 6–8 Tagen ungewöhnlich lange, entsprechend einer vor allem für Xylose vergleichsweise niedrigen Raum-Zeitausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin von ca. 0,6 gl^–1h^–1 (siehe 3 und 4 in Vu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635). Mit Xylose wurden also einerseits deutlich niedrigere 2,3-Butandiolausbeuten erzielt als mit Glucose als Fermentationsrohstoff und darüberhinaus war die für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens wichtige Raum-Zeitausbeute niedrig.
Aufgrund der Stöchiometrie der biochemischen Stoffwechselwege, Glykolyse im Falle von Glucose, Pentosphosphatweg im Falle von Xylose, beträgt die maximal erzielbare Ausbeute jeweils 0,5 g 2,3-Butandiol je g Glucose, bzw. Xylose (Jansen et al., Biotechnol. Bioeng. (1984) 26: 362–369). Offensichtlich führt die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentosephosphatweg nicht so effizient zu den C4-Produkten Acetoin und 2,3-Butandiol als die Verstoffwechslung von Glucose über die Glykolyse.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen verbesserten Mikroorganismenstamm zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten zur Verfügung zu stellen, der in der Lage ist als C-Quelle bei der Fermentation Zucker zu verwerten, die in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommen, darunter bevorzugt Xylose aus der darin enthaltenen Hemicellulose.
Gelöst wurde die Aufgabe durch einen Mikroorganismenstamm der Gattung Raoultella, Klebsiella, Bacillus, oder Paenibacillus enthaltend ein poxB Gen, dadurch gekennzeichnet, dass das poxB Gen inaktiviert ist und es sich bei dem in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommenden Zucker um eine Pentose handelt welche aus Hemicellulose gewonnen wurde.
Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, besonders bevorzugt um R. terrigena.
Bei den C4-Produkten handelt es sich vorzugsweise um 2,3-Butandiol oder Acetoin und besonders bevorzugt um 2,3-Butandiol.
Bei dem vorzugsweise aus Lignozellulose-haltiger Biomasse und der daraus isolierbaren Hemicellulose gewonnenen Zucker handelt es sich bevorzugt um Xylose.
Im erfindungsgemäßen Stamm ist das poxB Gen vorzugsweise derart inaktiviert, dass es nicht mehr für ein Protein mit einer Pyruvat:Ubichinon Oxidoreductase Enzymaktivität kodiert.
Das poxB Gen kodiert für das Enzym Pyruvat:Ubichinon Oxidoreductase (EC 1.2.5.1, ehemals EC 1.2.2.2), auch benannt Pyruvatoxidase oder Pyruvatdehydrogenase. Pyruvatoxidase oxidiert Pyruvat zu Acetat nach der Gleichung (IV): Pyruvat + Ubichinon(oxidiert) + H₂O -> Acetat + CO₂ + Ubichinon (reduziert) (IV)
Es handelt sich um jedes Gen, welches für ein Enzym kodiert, das entsprechend der Gleichung (IV) Pyruvat zu Acetat oxidiert, wobei Ubichinon reduziert und ein Molekül CO₂ freigesetzt wird.
In einer bevorzugten Ausführung stammt das poxB Gen aus einem Bakterium der Gattung Raoultella.
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das poxB Gen aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena.
Insbesondere bevorzugt ist das poxB Gen aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, wie in SEQ ID NO: 1 offenbart, kodierend für ein Pyruvatoxidase Protein, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 offenbart.
Der erfindungsgemäße Stamm ermöglicht eine verbesserte fermentative Verstoffwechslung von C5-Zuckern besonders bevorzugt Xylose, zu C4-Produkten, besonders bevorzugt zu 2,3-Butandiol.
Bakterielle Stämme mit inaktiviertem poxB Gen sind beschrieben, z. B. für E. coli (Chang and Cronan, J. Bacteriol. (1983) 154: 756–762). Es findet sich dort allerdings keine Hinweise auf eine Eignung zur Produktion von C4-Produkten wie Acetoin und 2,3-Butandiol oder die fermentative Verwertung von C5-Zuckern.
Ein aktives poxB Gen, kodierend für das Enzym Pyruvat:Ubichinon Oxidoreductase (EC 1.2.5.1, ehemals EC 1.2.2.2), wirkt sich nicht grundsätzlich negativ auf die Produktion der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin aus. Dies ist im 3. Beispiel (Tabelle 2) dokumentiert. Demnach wiesen poxB Mutanten von Raoultella terrigena in der Schüttelkolbenanzucht mit Glucose als C-Quelle ein vergleichbares Produktspektrum auf wie der Wildtypstamm. Aufgrund dieser Beobachtung war es für den Fachmann nicht zu erwarten, dass sich die Inaktivierung des poxB Gens vorteilhaft auf die Produktion von 2,3-Butandiol oder Acetoin auswirken könnte. Daher war es überraschend, dass bei Verwendung von Xylose als C-Quelle poxB Mutanten deutlich mehr 2,3-Butandiol und Acetoin bildeten als der Wildtypstamm, und zwar sowohl in Schüttelkolbenanzuchten (3. Beispiel, Tabelle 3) wie in der Fermentation (4. Beispiel, Tabelle 4).
Die Inaktivierung des poxB Gens bewirkt, dass kein Pyruvat mehr über die Pyruvatoxidase Reaktion zu Acetat abgebaut wird. Dies hat zur Folge, dass einerseits mehr Pyruvat für andere Stoffwechselwege (z. B. zur Bildung von Acetolactat, siehe Gleichung (I)) verfügbar ist. Andererseits stehen weniger Reduktionsequivalente aus der Oxidation des Pyruvats zur Verfügung, wie z. B. für die Reduktion von Acetoin zu 2,3-Butandiol (siehe Gleichung (III)). Auch von daher war nicht zu erwarten, dass die Inaktivierung des poxB Gens zu einer Verbesserung der 2,3-Butandiol Produktion führen sollte. Wie im 3. Beispiel gezeigt, war dies auch nicht der Fall, sofern Glucose als C-Quelle verwendet wurde. Bei Verwendung von Xylose als C-Quelle zeigte sich jedoch überraschend eine Verbesserung der C4-Produktion, insbesondere der 2,3-Butandiol Produktion, sowohl in Schüttelkolben wie in der Fermentation (siehe 3. bis 5. Beispiel).
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist die Inaktivierung des poxB Gens im erfindungsgemäßen Mikroorganismenstamm dazu geeignet, bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle der Fermentation oder der Anzucht im Schüttelkolben die Ausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin, und davon bevorzugt 2,3-Butandiol, um mehr als 20%, bevorzugt 40% und insbesondere bevorzugt um mehr als 60% zu steigern, wobei gleichzeitig der Anteil des Acetat Nebenprodukts um mindestens 10%, bevorzugt 25% und insbesondere bevorzugt um 50% reduziert wird.
Der erfindungsgemäße Mikroorganismenstamm, auch Produktionsstamm genannt, wird vorzugsweise aus einem Ausgangsstamm hergestellt. Beim Ausgangsstamm handelt es sich um einen zur 2,3-Butandiol Produktion befähigten Wildtypstamm der genannten Gattungen.
Zur Inaktivierung des poxB Gens sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt. Im einfachsten Fall wird der Ausgangsstamm in bekannter Weise einer Mutagenese (z. B. chemisch durch mutagen wirkende Chemikalien wie N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder physikalisch durch UV-Bestrahlung) unterzogen, wobei zufällig Mutationen in der genomischen DNS erzeugt werden und die gewünschte poxB Mutante dann aus der Vielzahl erzeugter Mutanten selektiert wird, z. B., jeweils nach Vereinzelung der Mutanten, durch Fehlen einer auf der Enzymaktivität basierenden Farbreaktion oder genetisch durch Nachweis eines fehlerhaften poxB Gens.
Im Gegensatz zur aufwendigen, zufälligen Mutagenese und Selektion der gesuchten poxB Mutante ist die gezielte Inaktivierung des poxB Gens durch den bekannten Mechanismus der homologen Rekombination bevorzugt. Kloniersysteme zur gezielten Geninaktivierung mittels homologer Rekombination sind kommerziell erhältlich, wie z. B. offenbart im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit”, basierend auf der Red^®/ET^®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012" und darin zitierter Literatur).
Dem Stand der Technik entsprechend wird das poxB Gen oder ein Teil des Gens isoliert und eine Fremd-DNS in das poxB Gen mittels homologer Rekombination kloniert, wodurch der das Protein definierende Leserahmen des poxB Gens unterbrochen wird. Ein für die gezielte Inaktivierung des poxB Gens geeignetes DNS-Konstrukt besteht also aus einem 5'-DNS-Abschnitt, der zum genomischen poxB Gen homolog ist, gefolgt von einem die Fremd-DNS umfassenden Genabschnitt und daran angeschlossen einem 3'-DNS-Abschnitt, der wiederum zum genomischen poxB Gen homolog ist.
Der für die homologe Rekombination in Frage kommende Bereich des poxB Gens umfasst dabei nicht nur den für die Pyruvatoxidase kodierenden Bereich. Der in Frage kommende Bereich umfasst auch das poxB Gen flankierende DNS-Sequenzen, nämlich im 5'-Bereich vor Beginn des kodierenden Bereichs (Promoter der Gentranskription) sowie im 3'-Bereich nach dem Ende des kodierenden Bereichs (Terminator der Gentranskription), deren Veränderung durch homologe Rekombination ebenso wie die Veränderung des kodierenden Bereichs zur Inaktivierung des poxB Gens führen kann.
Bei der Fremd-DNS handelt es sich bevorzugt um eine Selektionsmarker-Expressionskassette. Diese besteht aus einem Promoter der Gentranskription, der funktionell verbunden ist mit dem eigentlichen Selektionsmarkergen und gegebenenfalls gefolgt von einem Terminator der Gentranskription. Vorzugsweise enthält der Selektionsmarker 5'- und 3'-flankierende homologe Sequenzen des poxB Gens von jeweils mindestens 30 bp Länge, bevorzugt jeweils mindestens 50 bp Länge.
Das DNS-Konstrukt zur Inaktivierung des poxB Gens besteht also, beginnend vom 5'-Ende, aus einer zum poxB Gen homologen Sequenz von mindestens 30 bp Länge, bevorzugt mindestens 50 bp Länge, gefolgt von der Expressionskassette des Selektionsmarkers, ausgewählt aus der Klasse der Antibiotikaresistenzgene sowie gefolgt von einer weiteren, zum poxB Gen homologen Sequenz von mindestens 30 bp Länge, bevorzugt mindestens 50 bp Länge.
Bei den Selektionsmarkergenen handelt es sich im Allgemeinen um Gene, deren Genprodukt dem Ausgangsstamm das Wachstum unter selektiven Bedingungen ermöglicht, unter denen der ursprüngliche Ausgangsstamm nicht wachsen kann.
Bevorzugte Selektionsmarkergene sind ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotika-Resistenzgene wie z. B. das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen oder aber auch das Neomycin-Resistenzgen. Andere bevorzugte Selektionsmarkergene ermöglichen Ausgangsstämmen mit einem Stoffwechseldefekt (z. B. Aminosäureauxotrophien) das Wachstum unter selektiven Bedingungen, indem ihre Expression den Stoffwechseldefekt korrigiert. Schließlich sind auch Selektionsmarkergene möglich, deren Genprodukt eine an sich für den Ausgangsstamm toxische Verbindung chemisch verändert und somit inaktiviert (z. B. das Gen des Enzyms Acetamidase, welches die für viele Mikroorganismen toxische Verbindung Acetamid in die ungiftigen Produkte Acetat und Ammoniak spaltet).
Unter den Selektionsmarkergenen besonders bevorzugt sind das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen. Insbesondere bevorzugt sind das Tetracyclin-Resistenzgen und das Kanamycin-Resistenzgen.
Auf Basis der homologen Rekombination gibt es käuflich erwerbliche Systeme, die zusätzlich zur gezielten Geninaktivierung auch die Möglichkeit bieten, den Selektionsmarker wieder aus dem Genom zu entfernen, womit die Möglichkeit der Herstellung von Doppel- und Mehrfachmutanten gegeben ist. Ein solches System ist z. B. der käuflich erhältliche „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit”, basierend auf der Red^®/ET^®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012" und darin zitierte Literatur). Bevorzugt ist ein Verfahren zur gezielten Geninaktivierung des poxB Gens auf Basis der Red^®/ET^®-Technologie.
Bei dem Ausgangsstamm handelt es sich um einen 2,3-Butandiol produzierenden Stamm der Gattung Raoultella, Klebsiella, Bacillus, oder Paenibacillus. Diese Stämme sind alle käuflich erhältlich z. B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GbmH (Braunschweig), darunter ist ebenso bei der DSMZ GmbH käuflich erhältlich der in den Beispielen verwendete Stamm Raoultella terrigena DSM 2687.
Bevorzugt handelt es sich um einen Ausgangsstamm und einen Produktionsstamm eingestuft in der Sicherheitsstufe S1 und von diesen, wiederum bevorzugt, um Stämme der Art Raoultella terrigena.
Besonders bevorzugt ist ein Produktionsstamm, in dem das inaktivierte poxB Gen aus Raoultella terrigena stammt.
Der erfindungsgemäße Produktionsstamm kann darüber hinaus noch weiter optimiert werden, um die C4-Produktion noch zusätzlich zu verbessern.
Die Optimierung kann gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind z. B. 2,3-Butandiol Biosynthesegene wie Acetolactatsynthase ( DE 10 2011 003 394 ), Acetolactatdecarboxylase ( DE 10 2011 003 383 ) und Acetoinreduktase ( DE 10 2011 003 387 ). Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkonstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Raoultella terrigena alle drei Biosynthesegene des 2,3-Butandiols (sog. BUD-Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol. (1993) 175: 1392–1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Acetolactatsynthase und der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863–3875).
Der Produktionsstamm kann darüber hinaus dadurch optimiert werden, dass neben dem poxB Gen noch weitere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die C4-Produktion, darunter bevorzugt die 2,3-Butandiol Produktion, auswirken. Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenproduktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen z. B. die Lactatdehydrogenase (Milchsäurebildung) oder die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung).
Die Erfindung betrifft ferner ein fermentatives Verfahren zur Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die in einer Lignozellulose-haltigen Biomasse vorkommen mittels eines erfindungsgemäßen Mikrorganismenstammes.
Vorzugsweise ist der Zucker ein aus Hemicellulose gewonnenener Zucker, vorzugsweise eine Pentose, besonders bevorzugt eine Xylose.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden einerseits Biomasse des Produktionsstammes und andererseits die C4-Produkte, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, gebildet. Die Bildung von Biomasse und der C4-Produkte kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormassstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmassstab).
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmassstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmassstab ein Fermentationsvolumen grösser 10 l besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen grösser 300 l insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle), einer Stickstoffquelle (N-Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die C4-Produktbildung, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, optimiert werden.
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Pentosen wie z. B. Xylose, Arabinose oder Ribose sowie Pentosen enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse wie z. B. Zuckerrohrbagasse, Getreidestroh oder Abfällen der Mais- oder Holzverarbeitung, bzw. der darin enthaltenen Hemicellulose gewonnen werden können. Dabei kann die Hydrolyse der Lignozellulose-haltigen Biomasse dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren vorgeschaltet sein oder aber in situ während des erfindungsgemäßen Produktionsverfahrens erfolgen.
Besonders bevorzugte C-Quelle ist Xylose, entweder in isolierter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats.
Die im erfindungsgemäßen Produktionsverfahren eingesetzten C-Quellen umfassen somit sowohl die isolierten Reinsubstanzen als auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydrolysate durch thermischen, chemischen oder enzymatischen Aufschluss (bzw. einer beliebigen Kombination dieser Aufschlussverfahren) der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können.
Die Verwendung der bevorzugten und besonders bevorzugten C-Quellen schließt also nicht aus, dass die erfindungsgemäßen C-Quellen im Gemisch mit anderen, nicht erfindungsgemäßen C-Quellen im Anzuchtsmedium vorkommen. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker wie z. B. Glucose, Mannose oder Fructose. Die C-Quellen umfassen aber auch Disaccharide, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cellobiose. Weiter betroffen sind alle C-Quellen in Form höherer Saccharide, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Maltodextrin, Stärke, Cellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (thermisch, enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere.
Andere mögliche von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze), Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze). Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmonoxid denkbar.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehört Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N-Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO₃, NaNO₃, Ammoniumnitrat, Ca(NO₃)₂, Mg(NO₃)₂ sowie andere N-Quellen wie z. B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z. B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed), um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C-Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zu dosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die C4-Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Xylose oder Xylose enthaltende pflanzliche Hydrolysate, die aus Lignozellulose-haltigen Biomasseabfällen gewonnen werden können.
Besonders bevorzugte C-Quelle im Feed ist Xylose.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO₃, NaNO₃ und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form).
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die C4-Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung). Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Die Kultivierungsdauer zur C4-Produktion beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das C4-Produkt, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene C4-Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet werden oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des C4-Produkts, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zentrifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion (siehe z. B. DE 10 2011 004 915 ), Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebiger Form kombiniert werden, um das C4-Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades der C4-Produkte sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden.
Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide.
1 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 3,4 kb großen Vektor pKD13.
2 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 6,3 kb großen Vektor pKD46.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert:
1. Beispiel: Herstellung von poxB Knock out Mutanten in Raoultella terrigena
Als Ausgangsstamm für die Genisolierung sowie für die Stammentwicklung wurde Raoultella terrigena DSM 2687 verwendet (käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
Ziel der Geninaktivierung war das poxB Gen aus R. terrigena. Die DNS-Sequenz des poxB Gens aus R. terrigena ist offenbart in SEQ ID NO: 1, kodierend für ein Pyruvatoxidase Protein mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz.
Das R. terrigena poxB Gen wurde mit der aus der E. coli Molekularbiologie bekannten Red^®/ET^®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH inaktiviert (beschrieben im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit”, siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012 und darin zitierter Literatur, z. B. Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000): 6640–6645). Dazu wurden die Plasmide pKD13 (1), pKD46 (2), und pCP20 verwendet.
Das 3,4 kb große Plasmid pKD13 (1) ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048744.1.
Das 6,3 kb große Plasmid pKD46 (2) ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048746.1.
Das 9,4 kb große Plasmid pCP20 ist offenbart in Cherepanov and Wackernagel, Gene 158 (1995): 9–14.
Zur Geninaktivierung wurden die Primer pdh-2f (SEQ ID NO: 3) und pdh-3r (SEQ ID NO: 4) verwendet. Zum Nachweis des poxB Gens wurden die Primer pdh-1f (SEQ ID NO: 5) und pdh-4r (SEQ ID NO: 6) verwendet. Die Primer hatten folgende DNS-Sequenzen: SEQ ID NO: 3:
SEQ ID NO: 4:
SEQ ID NO: 5:
SEQ ID NO: 6:
Primer pdh-1f enthielt das 5'-Ende (bp 1–25 in SEQ ID NO: 1), Primer pdh-4r das 3'-Ende des poxB Gens (bp 1695–1719 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form). Primer pdh-2f enthielt 50 bp aus dem 5'-Bereich des poxB Gens (bp 111–160 in SEQ ID NO: 1) und daran angeschlossen 20 bp spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „priming site 1” in 1). Primer pdh-3r enthielt 50 bp aus dem 3'-Bereich des poxB Gens (bp 1551–1600 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form) und daran angeschlossen 20 bp spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „priming site 2” in 1).
Zur Inaktivierung des poxB Gens in R. terrigena durch homologe Rekombination mit dem Lambda Red System wurden, in an sich bekannter Weise (siehe z. B. „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012" der Fa. Gene Bridges GmbH), folgende Schritte durchgeführt:
R. terrigena wurde mit dem Plasmid pKD46 (sog. „Red Recombinase” Plasmid, 2) transformiert und ein Ampicillinresistenter Klon isoliert (bezeichnet als R.t.-pKD46). Die Transformation von R. terrigena erfolgte wie in DE 10 2011 003 394 beschrieben.
Ein poxB-spezifisches, zu dessen Inaktivierung geeignetes DNS-Fragment wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit DNS des Plasmids pKD13 (1) hergestellt. DNS des Plasmids pKD13 wurde verwendet, um mit den Primern pdh-2f (SEQ ID NO: 3) und pdh-3r (SEQ ID NO: 4) ein 1,3 kb PCR-Produkt herzustellen, das am 5'- und am 3'-Ende jeweils einen DNS-Abschnitt von 50 bp enthielt, der spezifisch für das poxB Gen aus R. terrigena war. Darüber hinaus enthielt das PCR-Produkt die Expressionskassette des in pKD13 enthaltenen Kanamycin Resistenzgens und, jeweils flankierend zum 5'- und 3'-Ende der Kanamycin Expressionskassette, sog. „FRT direct repeats” (bezeichnet als „natural FRT site” und „distal 35 nt of natural FRT site” in 1), kurze DNS-Abschnitte, die in einem späteren Arbeitsschritt zur Entfernung des Kanamycin Antibiotikamarkers als Erkennungssequenz für die „FLP Rekombinase” (enthalten auf dem Plasmid pCP20) dienten.
Das 1,3 kb große PCR-Produkt wurde isoliert und mit der, dem Fachmann geläufigen, nur methylierte DNS schneidenden Restrikitonsendonuclease Dpn I behandelt, um restliche pKD13 Plasmid DNS zu entfernen. Nicht-methylierte DNS aus der PCR-Reaktion wird dabei nicht abgebaut.
Das 1,3 kb große, für das poxB Gen spezifische und eine Expressionskassette für das Kanamycin Resistenzgen enthaltende PCR-Produkt wurde in bekannter Weise ( DE 10 2011 003 394 ) in R.t.-pKD46 transformiert und auf LBkan Platten bei 30°C Kanamycinresistente Klone isoliert. LBkan Platten enthielten LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl), 1,5% Agar und 15 mg/l Kanamycin.
Fünf der erhaltenen Kanamycin-resistenten Klone wurden auf LBkan Platten gereinigt und in einer PCR-Reaktion überprüft, ob die Kanamycin-Resistenz Kassette korrekt im poxB Gen integriert worden war.
Die für die PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von Kanamycin-resistenten Klonen von R. terrigena DSM 2687 in LBkan-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 15 mg/l Kanamycin) gewonnen worden. Dabei diente genomische DNS des R. terrigena Wildtyp Stammes DSM 2687 als Kontrolle. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren pdh-1f (SEQ ID NO: 5) und pdh-4r (SEQ ID NO: 6).
R. terrigena Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 1700 bp, wie für das intakte Gen erwartet. Die fünf Kanamycin-resistenten Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von 1600 bp. In einer weiteren PCR-Reaktion wurden die Klone in einer PCR-Reaktion mit den Primern pdh-1f und Kan2r (SEQ ID NO: 7) untersucht.
Primer Kan2r (SEQ ID NO: 7) war abgeleitet vom Kanamycin Resistenzgen des Plasmids pKD13 (in 1 bezeichnet als „Primer Kan2r”) und hatte folgende DNS-Sequenz: SEQ ID NO: 7:
Die kein Kanamycin Resistenzgen enthaltende R. terrigena Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion kein PCR-Produkt, wie erwartet. Die fünf Kanamycin-resistenten Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von 850 bp. Dieses Ergebnis zeigte, dass am Genort des poxB Gens erfolgreich das Kanamycin Resistenzgen integriert werden konnte und somit das poxB Gen inaktiviert worden war. Die fünf Klone mit inaktiviertem poxB Gen erhielten die Bezeichnung R.t.ΔpoxB::kan-1 bis R.t.ΔpoxB::kan-5.
Zur Eliminierung des Kanamycin Selektionsmarkers wurden die Mutanten R.t.ΔpoxB::kan-1 bis R.t.ΔpoxB::kan-5 mit dem Plasmid pCP20 transformiert und Transformanten bei 30°C selektiert. Der 9,4 kb Vektor pCP20 ist offenbart in Cherepanov und Wackernagel, Gene 158 (1995): 9–14. Auf dem Vektor pCP20 ist das Gen der FLP Recombinase enthalten. Die FLP Recombinase erkennt die FRT Sequenzen, welche die Expressionskassette des Kanamycin Resistenzgens flankieren und bewirkt die Entfernung der Kanamycin Expressionskassette. Dazu wurden die bei 30°C erhaltenen Klone bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurde zum einen die Expression der FLP Recombinase induziert und zum zweiten die Replikation des pCP20 Vektors unterbunden.
Das Resultat dieses Schrittes waren Klone, in denen zum einen das poxB Gen inaktiviert worden war und die zum anderen wieder sensitiv gegen Kanamycin waren (sog. „Curing” des Antibiotika Selektionsmarkers). Die Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom der ΔpoxB Mutanten ermöglicht die Einführung weiterer Mutationen, um Doppel- oder auch Mehrfachmutanten herzustellen. Von den fünf untersuchten Mutanten R.t.ΔpoxB::kan-1 bis R.t.ΔpoxB::kan-5 waren nach der Behandlung mit dem pCP20 Plasmid alle fünf Stämme Kanamycin-sensitiv, was durch plattieren auf LB- und LBkan-Platten nachgewiesen wurde. Während alle fünf Stämme auf LB-Platten wuchsen, konnte auf LBkan-Platten kein Wachstum mehr beobachtet werden, was auf die erfolgreiche Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom hindeutete.
Die Entfernung der Kanamycin-Kassette wurde zusätzlich in einer PCR-Reaktion verifiziert. Dazu wurde von den Kanamycinsensitiven Klonen genomische DNS isoliert (Qiagen DNS-Isolierungskit) und in einer PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit den Primern pdh-1f (SEQ ID NO: 5, umfasst das 5'-Ende des poxB Gens) und pdh-4r (SEQ ID NO: 6, umfasst das 3'-Ende des poxB Gens) eingesetzt. R. terrigena Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 1700 bp, wie für das intakte poxB Gen erwartet. Die fünf Kanamycin-sensitiven Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von 340 bp, was der erwarteten Größe der nach der homologen Rekombination verbliebenen 5'- und 3'-Fragmente des inaktivierten poxB Gens entsprach.
Die aus diesem Schritt isolierten Stämme erhielten die Bezeichnung R.t.ΔpoxB-1 bis R.t.ΔpoxB-5. Diese Stämme zeichnen sich dadurch aus, dass in ihnen das poxB Gen inaktiviert war und dass diese Stämme wieder sensitiv gegen das Antibiotikum Kanamycin waren.
2. Beispiel: Fermentation des Ausgangsstammes Raoultella terrigena DSM 2687 mit Glucose und Xylose als C-Quelle (nicht erfindungsgemäß; Vergleichsbeispiel)
Verwendet wurden „Labfors II” Fermenter der Fa. Infors. Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 l (3 l Fermentervolumen). Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des pO₂ und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlösung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fermentationsparameter Rührerdrehzahl (rpm), Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute), pO₂ (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100 kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt), pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenterhersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (73% Glucose, w/v oder 75% Xylose, w/v) wurde entsprechend dem Verbrauch an Glucose, bzw. Xylose über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20–25% v/v in Wasser verdünnt), verwendet.
Der in der Fermentation eingesetzte Stamm war Raoultella terrigena DSM 2687 (Kontrollstamm R.t.-WT). Batch-Fermentationsmedien waren FM2-G (C-Quelle Glucose) und FM2-X (C-Quelle Xylose).
FM2-G Medium enthielt Glucose 40 g/l; CSD (Corn Steep Liquor getrocknet) 10 g/l; Ammoniumsulfat 5 g/l; NaCl 0,5 g/l; FeSO₄ × 7H₂O 75 mg/l; Na₃Citrat × 2H₂O 1 g/l; CaCl₂ × 2H₂O 14,7 mg/l; MgSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l; KH₂PO₄ 1,5 g/l; Spurenelementemix 10 ml/l. Der pH des FM2-G Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt.
FM2-X Medium enthielt die gleiche Zusammensetzung wie FM2-G Medium. Jedoch wurde die Glucose durch Xylose (40 g/l) ersetzt.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H₃BO₃ 2,5 g/l; CoCl₂ × 6H₂O 0,7 g/l; CuSO₄ × 5H₂O 0,25 g/l; MnCl₂ × 4H₂O 1,6 g/l; ZnSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l und Na₂MoO₄ × 2H₂O 0,15 g/l.
Je 1,35 l FM2-G, bzw. FM2-X Medium wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt. Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,3.
In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD₆₀₀ als Maß der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec^TM 3000).
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert, das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Glucose-, bzw. Xylosegehalt von Fermenterproben wurde bestimmt mit dem Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose.
Die Bestimmung des Gehalts an C4-Produkten (2,3-Butandiol und Acetoin) sowie an C2-Produkten (Acetat und Ethanol) in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch ¹H-NMR (siehe z. B. DE 10 2011 003 394 ). Dazu wurde jeweils ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des Kulturüberstandes mit 0,6 ml TSP (3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d₄ Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/l) in D₂O gemischt. Die ¹H-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert:

TSP: 0,140–0,145 ppm (9H)

2,3-Butandiol: 1,155–1,110 ppm (6H)

Ethanol: 1,205–1,157 ppm (3H)

Essigsäure: 2,000–1,965 ppm (3H)

Acetoin: 2,238–2,200 ppm (3H)
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose, bzw. Xylose verbraucht waren, wurden jeweils über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) Feedlösungen von Glucose (73 w/v), bzw. Xylose (75 w/v) zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose-, bzw. Xylose Verbrauchsrate bestimmt.

Tabelle 1 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-WT mit Glucose und Xylose als C-Quelle der Fermentation. Tabelle 1: Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Glucose und Xylose als C-Quelle

		C-Quelle Glucose	C-Quelle Xylose
Zeit (h)	Produkt	(g/l)	(g/l)
24	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	72,5 2,6 1,5 6,3	44,6 13,1 9,1 2,2
48	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	109,7 6,3 3,5 5,3	61,8 16,0 19,9 1,7
72	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	117,1 6,9 3,7 5,4	62,1 17,7 23,0 1,6

Bei der Verwendung von Xylose als C-Quelle der Fermentation anstelle von Glucose wurde eine deutliche Verschiebung des Produktspektrums beobachtet. Mit Xylose als C-Quelle wurde deutlich weniger 2,3-Butandiol gebildet, während sich der Anteil des zweiten C4-Produkts Acetoin (das dritte mögliche C4-Produkt Diacetyl war nicht nachweisbar) erhöhte. Jedoch war mit Xylose als C-Quelle die Raum-Zeitausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin nach 72 h mit 1,1 gl^–1h^–1 deutlich höher als nach dem Stand der Technik bei Vu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635 (ca. 0,6 gl^–1h^–1, wie dort aus 3 und 4 entnommen).
Bei den C2-Produkten wurde eine starke Zunahme von Acetat beobachtet und eine Abnahme von Ethanol. Die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentose Phosphatweg führt offensichtlich zu einem deutlich anderen Produktspektrum als die von Glucose über die Glykolyse.
3. Beispiel: Vergleichende Schüttelkolbenanzucht der R.t.ΔpoxB Mutanten mit Glucose (Vergleichsbeispiel) und Xylose (erfindungsgemäß) als C-Quelle
Ausgangsstamm war Raoultella terrigena DSM 2687 (R.t.-WT, Kontrollstamm). Knock out Mutanten des poxB Gens wurden hergestellt wie im 1. Beispiel beschrieben. Die verwendeten Mutanten hatten die Bezeichnung R.t.ΔpoxB-1 bis R.t.ΔpoxB-3.
Die Stämme wurden durch Schüttelkolbenanzucht auf Produktion der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin sowie der C2-Produkte Acetat und Ethanol getestet. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2-G, bzw. FM2-X Medium beimpft und bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert.

Die Kultivierungsdauer betrug 96 h. Dabei wurden die Glucose- und Xylosekonzentration in Abständen von 24 h bestimmt (Analysator 7100MBS der Fa. YSI, siehe 2. Beispiel) und Glucose, bzw. Xylose bei Bedarf aus 40% (w/v) Stocklösungen nachgefüttert. In Abständen von 24 h wurden Proben auf ihren Gehalt an C4- und C2-Produkten untersucht (siehe 2. Beispiel). Die Produktionsverläufe für die C-Quelle Glucose sind in Tabelle 2, für die C-Quelle Xylose in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 2: Produktionsverlauf in rekombinanten Raoultella terrigena Stämmen mit Glucose als C-Quelle (Vergleichsbeispiele)

Zeit (h)	Produkt	R.t.-WT (g/l)	R.t.ΔpoxB-1 (g/l)	R.t.ΔpoxB-2 (g/l)	R.t.ΔpoxB-3 (g/l)
48	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	26,0 6,2 2,4 3,2	23,6 7,4 2,4 3,0	23,9 7,7 2,4 3,0	24,3 7,4 2,3 3,0
72	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	38,0 9,0 2,8 4,2	35,0 8,8 2,6 3,8	36,8 9,0 2,5 3,8	37,0 9,3 2,7 3,9
96	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	48,6 9,8 3,1 4,7	46,7 9,6 2,9 4,4	47,7 9,7 2,8 4,4	46,9 10,1 2,9 4,4

Tabelle 3: Produktionsverlauf in rekombinanten Raoultella terrigena Stämmen mit Xylose als C-Quelle; (R.t.-WT: Vergleichsbeispiel; R.t.Apox3-1, R.t.ΔpoxB-2, R.t.ΔpoxB-3 erfindungsgemäß)

Zeit (h)	Produkt	R.t.-WT (g/l)	R.t.ΔpoxB-1 (g/l)	R.t.ΔpoxB-2 (g/l)	R.t.ΔpoxB-3 (g/l)
48	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	24,8 4,1 3,5 3,3	24,2 5,6 2,9 3,1	22,6 4,9 2,9 3,0	24,4 5,1 3,0 3,0
72	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	23,1 5,3 5,6 3,0	36,6 6,2 3,9 3,4	34,9 5,6 3,9 3,6	35,7 6,0 3,9 3,5
96	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	21,8 6,3 6,0 2,6	35,3 7,7 4,5 3,0	35,2 7,4 4,6 3,1	34,9 7,5 4,5 3,0

Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, resultierte die Inaktivierung des poxB Gens in keiner signifikanten Änderung des Produktspektrums gegenüber dem R. terrigena Wildtyp Stamm R.t.-WT, sofern Glucose als C-Quelle verwendet wurde.
Wurde hingegen Xylose als C-Quelle eingesetzt, konnte in den poxB Mutanten eine signifikante Verbesserung vor allem der 2,3-Butandiol Ausbeute gegenüber dem R. terrigena Wildtyp Stamm R.t.-WT beobachtet werden (Tabelle 3). Die Steigerung der 2,3-Butandiol Ausbeute durch Inaktivierung des poxB Gens betrug 60% oder mehr. Weiterhin konnte auch eine leichte Steigerung der Acetoin Ausbeute um 17% beobachtet werden. Die Produktion von Acetat hingegen, wie aus der Acetat-bildenden Enzymreaktion des poxB Genprodukts erwartet, wurde um 23% reduziert. Die Bildung von Ethanol wurde geringfügig erhöht.
Die Inaktivierung des poxB Gens in R. terrigena führt also zu einer signifikanten Ausbeutesteigerung der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin, sofern Xylose als C-Quelle verwendet wird. Diese Beobachtung war unerwartet, da bei Verwendung von Glucose als C-Quelle keine Änderung des Produktspektrums, sowohl der C2- wie der C4-Produkte beobachtet werden konnte.
4. Beispiel:
Produktion von C4- und C2-Verbindungen mit R. terrigena poxB Knock out Stämmen durch Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle
Die Fermentation wurde durchgeführt, wie im 2. Beispiel beschrieben. In der Fermentation eingesetzte Stämme waren R.t.-WT (Kontrollstamm) und R.t.ΔpoxB-1. Batch-Fermentationsmedium war das im 2. Beispiel beschriebene FM2-X Medium.
1,35 l des FM2-X Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt (siehe 2. Beispiel).
Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 1000 rpm, Belüftung mit 1 vvm, pH 6,3.
Der Xylosegehalt und der Gehalt an C4- und C2-Produkten wurden bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Xylose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) eine 75% (w/v) Xylose Feedlösung zugefüttert.
Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Xylose Verbrauchsrate bestimmt.

Tabelle 4 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-WT und in dem poxB Knock out Stamm R.t.ΔpoxB-1. Tabelle 4: Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle (R.t.-WT: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔpoxB-1 erfindungsgemäß)

Zeit (h)	Produkt	R.t.-WT (g/l)	R.t.ΔpoxB-1 (g/l)
24	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	46,4 8,0 11,9 3,2	55,6 3,5 5,5 3,1
48	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	59,7 17,1 22,1 1,4	77,8 15,1 16,0 2,7
72	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	60,6 18,9 29,9 1,9	79,5 18,1 22,4 1,8

Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (3. Beispiel), führte bei Verwendung von Xylose als C-Quelle die Inaktivierung des poxB Gens im Stamm R.t.ApoxB-1 zu einer signifikanten Steigerung der Produktion von 2,3-Butandiol um mehr als 30%. Dagegen wurde die Acetatbildung stark reduziert, und zwar um 25%. Der Gehalt der beiden anderen Produkte, Acetoin und Ethanol, blieb nahezu unverändert.
5. Beispiel: Fermentation mit der C-Quelle Xylose im 330 l Maßstab
Fermentiert wurde die Raoultella terrigena Knock out Mutante R.t.ΔpoxB-1, in der das poxB Gen inaktiviert worden war.
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulum von R.t.ΔpoxB-1 in LB Medium (siehe 1. Beispiel) wurde hergestellt, indem 2 × 100 ml LB Medium, jeweils in einem 1 l Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LB Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20% v/v versetzt und bei –20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 0,5–2,5). 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 l Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 l Fermentermedium.
Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat^® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-G (siehe 2. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus.
2 × 8 l FM2-G wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck PO₂ wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450–1.000 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 30–40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet.
Hauptfermenter: Die Fermentation wurde in einem Biostat^® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 l, Kesselvolumen 500 l) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-X mit Xylose als C-Quelle (siehe 2. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus.
180 l FM2-X wurden mit 16 l Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm, bezogen auf das Anfangsvolumen. Der Sauerstoffpartialdruck pO2 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200–500 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Xyloseverbrauch durch off-line Xylose-Messung mit einem Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 2. Beispiel). Sobald die Xylosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/l betrug (8–10 h nach Inokulation), wurde die Zudosierung einer 75% w/v Xylose Feedlösung gestartet. Die Flußrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Xylosekonzentration von 10–20 g/l eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 295 l.

Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Produktion von 2,3-BDL durch Fed-Batch Fermentation im 330 l Maßstab

Zeit (h)	Produkt	R.t.ΔpoxB-1 (g/l)
24	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	55,4 8,4 7,3 3,0
48	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	64,2 15,0 11,3 2,4
72	2,3-BDL Acetoin Acetat Ethanol	76,3 20,7 23,2 1,6

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Claims

Mikroorganismenstamm zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten der in der Lage ist als C-Quelle bei einer Fermentation Zucker zu verwerten, die in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommen, der Gattung Raoultella, Klebesiella, Bacillus oder Paenibacillus enthaltend ein poxB Gen dadurch gekennzeichnet, dass das poxB Gen inaktiviert ist und es sich bei dem in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommenden Zucker um eine Pentose handelt welche aus Hemicellulose gewonnen wurde.
Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, besonders bevorzugt um R. terrigena handelt.
Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den C4-Produkten um 2,3-Butandiol oder Acetoin handelt.
Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Pentose um Xylose handelt
Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommen mittels eines Mikrorganismenstammes dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrorganimenstamm ein Mikroorganismenstamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass der Zucker eine aus Hemicellulose gewonnener Zucker, vorzugsweise eine Pentose, besonders bevorzugt eine Xylose ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6 dadurch gekennzeichnet, dass es in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und bei einer Temperatur von 20°C bis 40°C unter aeroben Bedingungen über einen Zeitraum von 10 bis 100 h durchgeführt wird.