DE102013216658A1

DE102013216658A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme

Info

Publication number: DE102013216658A1
Application number: DE201310216658
Authority: DE
Inventors: Rupert Pfaller
Original assignee: Wacker Chemie AG
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2013-08-22
Filing date: 2013-08-22
Publication date: 2015-02-26

Abstract

Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Lignozellulose-haltiger Biomasse mittels eines Mikrorganismenstammes dadurch gekennzeichnet, dass in der Fermentation als Produktionsstamm ein natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Mikroorganismenstamm mit einem cpdA Gen eingesetzt wird, bei dem das cpdA Gen inaktiviert ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten und dafür geeignete Mikroorganismenstämme.
Bedingt durch steigende Rohölpreise steigen auch die Herstellungskosten der daraus petrochemisch gewonnenen Grundstoffe für die chemische Industrie. Daraus resultiert ein wachsendes Interesse an alternativen Produktionsverfahren für chemische Grundstoffe, speziell auf Basis nachwachsender Rohstoffe.
Beispiele für chemische Grundstoffe (sog. chemische Synthesebausteine oder auch Plattformchemikalien genannt) aus nachwachsenden Rohstoffen sind Ethanol (C2-Baustein), Glycerin, 1,3-Propandiol, 1,2-Propandiol, Milchsäure, 3-Hydroxypropionsäure (C3-Bausteine) oder Bernsteinsäure, 1-Butanol, 2-Butanol, 1,4-Butandiol, Acetoin, Diacetyl oder auch 2,3-Butandiol (C4-Bausteine). Diese chemischen Bausteine sind die biogenen Ausgangsverbindungen, aus denen dann auf chemischem Wege weitere Grundchemikalien hergestellt werden können. Voraussetzung dafür ist die kostengünstige fermentative Herstellung der jeweiligen Synthesebausteine aus nachwachsenden Rohstoffen. Entscheidende Kostenfaktoren sind einerseits die Verfügbarkeit geeigneter billiger nachwachsender Rohstoffe sowie andererseits mikrobielle Fermentationsverfahren, welche diese Rohstoffe effizient in den gewünschten chemischen Grundstoff umwandeln. Für die Wirtschaftlichkeit dieser fermentativen Verfahren ist dabei entscheidend, dass die eingesetzten Mikroorganismen die billigsten verfügbaren Rohstoffe effizient in das gewünschte Produkt umsetzen können.
2,3-Butandiol ist mögliches Ausgangsprodukt für Produkte der Petrochemie mit vier C-Atomen (C4-Bausteine) wie Acetoin, Diacetyl, 1,3-Butadien, 2-Butanon (Methyl-Ethylketon, MEK). Außerdem sind Produkte mit zwei C-Atomen (C2-Bausteine) wie Essigsäure ( US 2012288908 AA ) und davon abgeleitet, Acetaldehyd, Ethanol und auch Ethylen zugänglich. Durch Dimerisierung von 2,3-Butandiol sind auch C8-Verbindungen denkbar, die Verwendung z. B. als Treibstoff im Luftfahrtbereich haben.
Der von verschiedenen Mikroorganismen beschrittene biosynthetische Weg zu 2,3-Butandiol ist bekannt (siehe z. B. Review von Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725) und führt vom zentralen Stoffwechselprodukt Pyruvat über die drei folgenden enzymatischen Schritte zum 2,3-Butandiol: Reaktion der Acetolactatsynthase: Bildung von Acetolactat aus zwei Molekülen Pyruvat unter Abspaltung von CO₂.
Reaktion der Acetolactatdecarboxylase: Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin.
Reaktion der Acetoinreduktase (2,3-Butandioldehydrogenase): NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu 2,3-Butandiol.
Die meisten bakteriellen Produzenten von 2,3-Butandiol sind Mikroorganismen der biologischen Sicherheitsstufe S2, können also großtechnisch nicht ohne aufwendige und kostenintensive technische Sicherheitsmaßnahmen eingesetzt werden.
Eine gängige Definition für den Begriff „biologische Sicherheitsstufe” und die Einteilung in verschiedene Sicherheitsstufen findet sich z. B. in „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", S. 9ff. (Tabelle 1), Centers for Disease Control and Prevention (U. S.) (Editor), Public Health Service (U. S.) (Editor), National Institutes of Health (Editor), Herausgeber: U. S. Dept. of Health and Human Services; 5, 5th edition, Revised December 2009 edition (March 15, 2010); ISBN-10: 0160850428.
Für eine kosteneffiziente großtechnische Produktion von C4-Produkten sind Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe S1 bevorzugt. Für diese wurden jedoch bisher keine ausreichend hohen Produktausbeuten beschrieben. Bekannte 2,3-Butandiol Produktionsstämme der biologischen Sicherheitsstufe S1 sind Stämme der Arten Raoultella terrigena, Stämme der Gattung Bacillus (bzw. Paenibacillus) wie Paenibacillus polymyxa oder Bacillus licheniformis. In der Fachliteratur (Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) wurden verschiedene, ursprünglich der Gattung Klebsiella zugeordnete Bakterienspezies genetisch analysiert. Aufgrund der gefundenen Heterogenität (siehe Abb. 1 in Drancourt et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. (2001), 51: 925–932) wurden Stämme der ursprünglich Klebsiella terrigena benannten Art taxonomisch neu eingeordnet und innerhalb der neu geschaffenen Gattung Raoultella in die Art Raoultella terrigena umbenannt. Bakterienstämme der Arten Klebsiella terrigena und Raoultella terrigena bezeichnen somit Stämme der gleichen Art, sind aber verschieden von anderen Stämmen der Gattung Klebsiella.
Der Stand der Technik offenbart Verfahren zur Herstellung von 2,3-Butandiol, die hauptsächlich auf der Verwendung von Glucose als Fermentationsrohstoff (C-Quelle) beruhen (siehe z. B. WO 12104234 A1 ). Glucose ist eines der Basisprodukte in der Nahrungsmittelindustrie und wird mittlerweile auch im großen Stil zur Bioethanol Herstellung eingesetzt.
Großtechnische, auf Glucose als Fermentationsrohstoff beruhende Fermentationsverfahren stellen eine unerwünschte Konkurrenz zu dessen Verwendung als Nahrungsmittel dar und führen aufgrund der steigenden Nachfrage zu einer stetigen Verteuerung des Rohstoffs Glucose. Da der Fermentationsrohstoff einer der kostenbestimmenden Faktoren bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien ist, wird verstärkt nach Alternativen gesucht. Neben den wirtschaftlichen gibt es jedoch auch gewichtige sozialpolitisch motivierte Gründe für die Suche nach alternativen Fermentationsrohstoffen. Die eigentlich für Nahrungsmittelzwecke bestimmte Glucose ist somit nicht der bevorzugte Fermentationsrohstoff, um 2,3-Butandiol und auch andere C4- und C2-Plattformchemikalien wie Acetoin, Ethanol und Essigsäure wirtschaftlich, d. h. konkurrenzfähig zur Produktion aus petrochemischen Rohstoffen, herzustellen.
Als alternativem Fermentationsrohstoff fällt lignozellulosehaltiger Biomasse eine zentrale Bedeutung zu. Sie fällt in der Land- oder Forstwirtschaft als Stroh, Bagasse oder als Abfall der Holzverarbeitung in großen Mengen ohne entsprechende Verwertungsmöglichkeiten an. Entsprechend gibt es große Anstrengungen, wertsteigernde Verwendungsmöglichkeiten für Bestandteile der Lignozellulose zu finden.
Lignozellulosehaltige Biomasse besteht aus den drei Hauptkomponenten Cellulose, Hemicellulose und Lignin. Für Fermentationszwecke werthaltige Bestandteile sind die in der Cellulose enthaltene Glucose sowie die Zuckerbestandteile der Hemicellulose, v. a. Pentosen wie Xylose und Arbinose.
Verschiedene Verfahren der Extraktion von Zuckern aus Lignozellulose sind dem Fachmann bekannt, darunter solche, die auf hydrothermal, thermisch bei saurem oder alkalischem pH oder enzymatisch mit Cellulasen und Xylanasen durchgeführter Hydrolyse der Lignozellulose beruhen (Blanch et al., Biotechnol. J. (2011) 6: 1086–1102; Saha, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279–291). Dabei ist auch die beliebige Kombination verschiedener der vorgenannten Verfahren bekannt, immer mit dem Ziel, fermentierbare Zucker mit höchster Ausbeute auf kostengünstigste Weise aus der Lignozellulose zu gewinnen.
Die in Lignozellulose enthaltenen Zucker, darunter bevorzugt Glucose und Xylose, stellen somit einen attraktiven Fermentationsrohstoff bei der Herstellung biogener Plattformchemikalien dar, besonders bei der fermentativen Herstellung der C4-Produkte 2,3-Butandiol oder Acetoin und hier insbesondere bei der Verwendung des fermentativ hergestellten 2,3-Butandiols oder Acetoins zur Gewinnung von Essigsäure durch Gasphasenoxidation. Es sind nur wenige Beispiele 2,3-Butandiol produzierender Mikroorganismen bekannt, bei denen neben Glucose auch Xylose als Fermentationsrohstoff untersucht wurde. Für ein wirtschaftliches Verfahren ist es jedoch erforderlich, dass beide aus Lignozellulose gewonnene Zucker effizient als Fermentationsrohstoff eingesetzt werden können.
Auf Basis der Stöchiometrie der biochemischen Stoffwechselwege, Glykolyse im Falle von Glucose, Pentosphosphatweg im Falle von Xylose, beträgt die maximal erzielbare Ausbeute jeweils 0,5 g 2,3-Butandiol je g Glucose, bzw. Xylose (Jansen et al., Biotechnol. Bioeng. (1984) 26: 362–369). Unabhängig vom Fermentationszucker sollte die 2,3-Butandiol Ausbeute somit vergleichbar sein. Dies scheint jedoch nicht der Fall zu sein. Für Klebsiella pneumoniae, einem Mikroorganismus der biologischen Sicherheitsstufe S2, wurde die fermentative Herstellung der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin aus den C-Quellen Xylose und Glucose verglichen (Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635). Die dabei erzielten C4-Produkt-Ausbeuten betrugen 88 g/l für Xylose als C-Quelle und 112 g/l für Glucose als C-Quelle. Dabei war die Fermentationsdauer zur Erlangung der maximalen C4-Produkt-Ausbeute mit 6–8 Tagen ungewöhnlich lange, entsprechend einer vor allem für Xylose vergleichsweise niedrigen Raum-Zeitausbeute der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin von ca. 0,6 gl^–1h^–1 (siehe 3 und 4 in Yu and Saddler, Appl. Environ. Microbiol. (1983) 46: 630–635). Auch für Raoultella terrigena wurden unter optimierten Bedingungen ( DE 10 2013 205 986 , DE 10 2013 204 728 ) mit Xylose niedrigere 2,3-Butandiol Ausbeuten erzielt als mit Glucose. Offensichtlich führt die Verstoffwechslung von Xylose über den Pentosephosphatweg nicht so effizient zu den C4-Produkten Acetoin und 2,3-Butandiol wie die Verstoffwechslung von Glucose über die Glykolyse.
Aufgabe der Erfindung ist es ein fermentatives Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches eine erhöhte Effizienz bei der Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnenen werden, aufweist.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass in der Fermentation als Produktionsstamm ein natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Mikroorganismenstamm mit einem cpdA Gen eingesetzt wird, bei dem das cpdA Gen inaktiviert ist.
Bei den Zuckern, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnenen werden handelt es sich bevorzugt um eine Hexose oder Pentose, bevorzugt Glucose aus der in der Biomasse enthaltenen Cellulose und Xylose aus der in der Biomasse enthaltenen Hemicellulose. Insbesondere bevorzugt ist Xylose aus der in der Biomasse enthaltenen Hemicellulose.
Bei den C4-Produkten handelt es sich vorzugsweise um 2,3-Butandiol oder Acetoin und besonders bevorzugt um 2,3-Butandiol.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine verbesserte fermentative Verstoffwechslung von C6- und C5-Zuckern, bevorzugt von Glucose und Xylose, zu C4-Produkten, darunter bevorzugt zu 2,3-Butandiol. Die Ausbeute an C4-Produkten beträgt im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mindestens 70 g/l, besonders bevorzugt mindestens 100 g/l.
Natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigte Mikroorganismenstämme sind bekannt, z. B. aus den Gattungen Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, Aerobacter, Aeromonas, Serratia, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus oder Lactococcus. Aber auch Hefen sind als Produzenten bekannt (z. B. Bäckerhefe). Eine Übersicht über natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigte Wildtypstämme ist z. B. offenbart in Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 (siehe Kapitel 4, „Microorganisms"). Diese Mikroorganismenstämme enthalten mindestens ein cpdA-Gen, kodierend für das Enzym cAMP-Phosphodiesterase (EC 3.1.4.17).
Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, Klebsiella, Serratia, Bacillus, oder Paenibacillus.
Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, insbesondere bevorzugt um R. terrigena.
Das cpdA Gen kodiert für das Enzym cAMP-Phosphodiesterase (EC 3.1.4.17). cAMP-Phosphodiesterase katalysiert die hydrolytische Spaltung von cAMP (cyclisches Adenosinmonophosphat) zu AMP (Adenosinmonophosphat) nach der Gleichung (IV): 3'-5'-cyclisches Adenosinmonophosphat + H₂O → Adenosinmonophosphat (IV)
Es handelt sich um jedes Gen, welches für ein Enzym kodiert, das entsprechend der Gleichung (IV) cAMP hydrolysiert, wobei AMP gebildet wird.
Im Mikroorganismenstamm der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird ist das cpdA Gen vorzugsweise derart inaktiviert, dass es nicht mehr für ein Protein mit einer cAMP-Phosphodiesterase Enzymaktivität kodiert.
In einer bevorzugten Ausführung stammt das cpdA Gen aus einem Bakterium der Gattung Raoultella.
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das cpdA Gen aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena.
Insbesondere bevorzugt ist das cpdA Gen aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, wie in SEQ ID NO: 1 offenbart, kodierend für ein Protein mit cAMP-Phosphodiesteraseaktivität, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 offenbart.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigten Mikroorganismenstammes mit einem cpdA Gen, bei dem das cpdA Gen inaktiviert ist, zur Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnen werden. Die bevorzugten Merkmale des im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mikroorganismenstammes gelten ebenso für die erfindungsgemäße Verwendung.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden einerseits Biomasse des Produktionsstammes und andererseits die C4-Produkte gebildet. Die Bildung von Biomasse und der C4-Produkte kann dabei zeitlich korrelieren oder aber zeitlich voneinander entkoppelt erfolgen. Die Anzucht erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise. Dazu kann die Anzucht in Schüttelkolben (Labormassstab) erfolgen oder aber auch durch Fermentation (Produktionsmassstab).
Bevorzugt ist ein Verfahren im Produktionsmassstab durch Fermentation, wobei als Produktionsmassstab ein Fermentationsvolumen grösser 10 l besonders bevorzugt und ein Fermentationsvolumen grösser 300 l insbesondere bevorzugt ist.
Anzuchtsmedien sind dem Fachmann aus der Praxis der mikrobiellen Kultivierung geläufig. Sie bestehen typischerweise aus einer Kohlenstoffquelle (C-Quelle), einer Stickstoffquelle (N-Quelle) sowie Zusätzen wie Vitaminen, Salzen und Spurenelementen, durch die das Zellwachstum und die C4-Produktbildung, darunter bevorzugt 2,3-Butandiol, optimiert werden.
C-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur 2,3-BDL Produktbildung genützt werden können. Dazu gehören alle Formen von Monosacchariden, umfassend C6-Zucker (Hexosen) wie z. B. Glucose, Mannose, Fructose oder Galactose sowie C5-Zucker (Pentosen) wie z. B. Xylose, Arabinose oder Ribose, aber auch C-Quellen in Form von Disacchariden, insbesondere Saccharose, Lactose, Maltose oder Cellobiose.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiterhin auch alle C-Quellen in Form höherer Saccharode, Glycoside oder Kohlehydrate mit mehr als zwei Zuckereinheiten wie z. B. Maltodextrin, Stärke, Cellulose, Hemicellulose, Pektin bzw. daraus durch Hydrolyse (enzymatisch oder chemisch) freigesetzte Monomere oder Oligomere. Dabei kann die Hydrolyse der höheren C-Quellen dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren vorgeschaltet sein oder aber in situ während des erfindungsgemäßen Produktionsverfahrens erfolgen.
Andere verwertbare, von Zuckern oder Kohlehydraten verschiedene C-Quellen sind Essigsäure (bzw. davon abgeleitete Acetatsalze), Ethanol, Glycerin, Zitronensäure (sowie deren Salze) oder Pyruvat (und dessen Salze). Es sind aber auch gasförmige C-Quellen wie Kohlendioxid oder Kohlenmonoxid denkbar.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten C-Quellen umfassen sowohl die isolierten Reinsubstanzen als auch, zur Erhöhung der Wirtschaftlichkeit, nicht weiter aufgereinigte Gemische der einzelnen C-Quellen, wie sie als Hydrolysate durch chemischen oder enzymatischen Aufschluss der pflanzlichen Rohstoffe gewonnen werden können. Dazu gehören z. B. Hydrolysate der Stärke (Monosaccharid Glucose), der Zuckerrübe (Monosaccharide Glucose, Fructose und Arabinose), des Zuckerrohrs (Disaccharid Saccharose), des Pektins (Monosaccharid Galacturonsäure) oder auch der Lignozellulose (Monosaccharid Glucose aus Cellulose, Monosaccharide Xylose, Arabinose, Mannose, Galactose aus Hemicellulose sowie das nicht zu den Kohlehydraten gehörende Lignin). Weiterhin können als C-Quellen auch Abfallprodukte aus dem Aufschluss pflanzlicher Rohstoffe dienen, so z. B. Melasse (Zuckerrübe) oder Bagasse (Zuckerrohr).
Bevorzugte C-Quellen zur Anzucht der Produktionsstämme sind Glucose, Fructose, Saccharose, Mannose, Xylose, Arabinose sowie pflanzliche Hydrolysate, die aus Stärke, Lignozellulose, Zuckerrohr oder Zuckerrübe gewonnen werden können.
Besonders bevorzugte C-Quellen sind Glucose und Xylose, entweder in isolierter Form oder als Bestandteil eines pflanzlichen Hydrolysats.
N-Quellen sind solche, die vom Produktionsstamm zur Biomassebildung genützt werden können. Dazu gehört Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH oder aber auch dessen Salze wie z. B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat oder Ammoniumnitrat. Des Weiteren sind als N-Quelle geeignet die bekannten Nitratsalze wie z. B. KNO₃, NaNO₃, Ammoniumnitrat, Ca(NO₃)₂, Mg(NO₃)₂ sowie andere N-Quellen wie z. B. Harnstoff. Zu den N-Quellen gehören auch komplexe Aminosäuregemische wie z. B. Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor, flüssig oder aber auch getrocknet als sog. CSD) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Die Anzucht kann erfolgen im sog. Batch Modus, wobei das Anzuchtsmedium mit einer Starterkultur des Produktionsstammes inokuliert wird und dann das Zellwachstum ohne weitere Fütterung von Nährstoffquellen erfolgt.
Die Anzucht kann auch erfolgen im sog. Fed-Batch Modus, wobei nach einer anfänglichen Phase des Wachstums im Batch Modus zusätzlich Nährstoffquellen zugefüttert werden (Feed), um deren Verbrauch auszugleichen. Der Feed kann bestehen aus der C-Quelle, der N-Quelle, einem oder mehreren für die Produktion wichtigen Vitaminen, bzw. Spurenelementen oder aus einer Kombination der vorgenannten. Dabei können die Feedkomponenten zusammen als Gemisch oder aber auch getrennt in einzelnen Feedstrecken zudosiert werden. Zusätzlich können auch andere Medienbestandteile sowie spezifisch die C4-Produktion steigernde Zusätze dem Feed zugesetzt sein. Der Feed kann dabei kontinuierlich oder in Portionen (diskontinuierlich) zugeführt werden oder aber auch in Kombination aus kontinuierlichem und diskontinuierlichem Feed. Bevorzugt ist die Anzucht nach dem Fed-Batch Modus.
Bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose, Xylose sowie Glucose oder Xylose enthaltende pflanzliche Hydrolysate sowie Mischungen der bevorzugten C-Quellen in beliebigem Mischungsverhältnis.
Besonders bevorzugte C-Quellen im Feed sind Glucose und Xylose.
Bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, gasförmig oder in wässriger Lösung als NH₄OH und dessen Salze Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat und Ammoniumchlorid, weiterhin Harnstoff, KNO₃, NaNO₃ und Ammoniumnitrat, Hefeextrakt, Proteose Pepton, Malzextrakt, Sojapepton, Casaminosäuren, Maisquellwasser (Corn Steep Liquor) sowie auch NZ-Amine und Yeast Nitrogen Base.
Besonders bevorzugte N-Quellen im Feed sind Ammoniak, bzw. Ammoniumsalze, Harnstoff, Hefeextrakt, Sojapepton, Malzextrakt oder Corn Steep liquor (flüssig oder in getrockneter Form).
Die Anzucht erfolgt unter pH- und Temperaturbedingungen, welche das Wachstum und die C4-Produktion des Produktionsstammes begünstigen. Der nützliche pH-Bereich reicht von pH 5 bis pH 8. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 5,5 bis pH 7,5. Besonders bevorzugt ist ein pH-Bereich von pH 6,0 bis pH 7.
Der bevorzugte Temperaturbereich für das Wachstum des Produktionsstammes beträgt 20°C bis 40°C. Besonders bevorzugt ist der Temperaturbereich von 25°C bis 35°C.
Das Wachstum des Produktionsstammes kann fakultativ ohne Sauerstoffzufuhr erfolgen (anaerobe Kultivierung) oder aber auch mit Sauerstoffzufuhr (aerobe Kultivierung). Bevorzugt ist die aerobe Kultivierung mit Sauerstoff, wobei die Sauerstoffversorgung durch Eintrag von Pressluft oder reinem Sauerstoff gewährleistet wird. Besonders bevorzugt ist die aerobe Kultivierung durch Eintrag von Pressluft.
Der nützliche Bereich der Pressluftzufuhr bei der aeroben Kultivierung beträgt 0,05 vvm bis 5 vvm (vvm: Eintrag von Pressluft in den Fermentationsansatz angegeben in Liter Pressluft je Liter Fermentationsvolumen pro Minute). Bevorzugt ist ein Presslufteintrag von 0,1 vvm bis 2,5 vvm, besonders bevorzugt von 0,2 bis 1,5 vvm und insbesondere bevorzugt von 0,3 bis 1 vvm.
Die Kultivierungsdauer zur C4-Produkt-Herstellung beträgt zwischen 10 h und 200 h. Bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 20 h bis 120 h. Besonders bevorzugt ist eine Kultivierungsdauer von 30 h bis 100 h.
Kultivierungsansätze, die durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen werden, enthalten das C4-Produkt vorzugsweise im Kulturüberstand. Das in den Kultivierungsansätzen enthaltene C4-Produkt kann entweder ohne weitere Aufarbeitung direkt weiterverwendet oder aber aus dem Kultivierungsansatz isoliert werden. Zur Isolierung des C4-Produkts stehen an sich bekannte Verfahrensschritte zur Verfügung, darunter Zentrifugation, Dekantierung, Filtration, Extraktion (siehe z. B. DE 10 2011 004 915 ), Destillation oder Kristallisation, bzw. Fällung. Diese Verfahrensschritte können dabei in jeder beliebigen Form kombiniert werden, um das C4-Produkt in der gewünschten Reinheit zu isolieren. Der dabei zu erzielende Reinheitsgrad ist abhängig von der weiteren Verwendung.
Verschiedene analytische Methoden zur Identifizierung, Quantifizierung und Bestimmung des Reinheitsgrades der C4-Produkte sind verfügbar, darunter NMR, Gaschromatographie, HPLC, Massenspektroskopie oder auch eine Kombination aus diesen Analysemethoden.
Die Erfindung betrifft ferner verbesserte Mikroorganismenstämme, die in der Lage sind bei der fermentativen Herstellung von C4-Produkten als C-Quelle bei der Fermentation Zucker zu verwerten, die in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommen.
Ein derartiger Stamm ist ein natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigten Mikroorganismenstamm, ausgenommen ein Stamm der Art Klebsiella pneumoniae und der Art Serratia marcescens, enthaltend ein cpdA Gen, dadurch gekennzeichnet, dass das cpdA Gen inaktiviert ist.
Natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigte Mikroorganismenstämme enthaltend ein cdpA Gen sind bekannt und z. B. offenbart in Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 (siehe Kapitel 4, „Microorganisms").
Bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, Klebsiella, Serratia, Bacillus, oder Paenibacillus.
Besonders bevorzugt handelt es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, insbesondere bevorzugt um R. terrigena.
Im erfindungsgemäßen Mikroorganismenstamm ist das cpdA Gen vorzugsweise derart inaktiviert, dass es nicht mehr für ein Protein mit einer cAMP-Phosphodiesterase Enzymaktivität kodiert.
In einer bevorzugten Ausführung stammt das cpdA Gen aus einem Bakterium der Gattung Raoultella.
In einer besonders bevorzugten Ausführung stammt das cpdA Gen aus einem Stamm der Art Raoultella terrigena.
Insbesondere bevorzugt ist das cpdA Gen aus dem Stamm Raoultella terrigena DSM 2687, wie in SEQ ID NO: 1 offenbart, kodierend für ein Protein mit cAMP-Phosphodiesteraseaktivität, gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 offenbart.
Bei den C4-Produkten handelt es sich vorzugsweise um 2,3-Butandiol oder Acetoin und besonders bevorzugt um 2,3-Butandiol.
Bei den aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnenen Zuckern handelt es sich bevorzugt um Glucose aus der in der Biomasse enthaltenen Cellulose und Xylose aus der in der Biomasse enthaltenen Hemicellulose.
cAMP ist bekannt als Signalmolekül, das über die Bindung an den Transkriptionsfaktor CRP (cAMP-Rezeptor Protein) die Expression einer Vielzahl von Genen beeinflusst, deren Genprodukte u. a. wichtige Funktionen in der Verwertung (Katabolismus) verschiedener C-Quellen haben. Der auf cAMP und CRP beruhende Regulationsmechanismus ist dem Fachmann bekannt als Katabolitrepression (siehe z. B. Görke and Stülke (2008), Nat. Rev. Microbiol 6: 613–624). cAMP als Signalmolekül wird durch das Enzym Adenylatcyclase aus ATP gebildet. Durch Bindung an das Crp-Protein wird der aktive cAMP-Crp Transkriptionsfaktor gebildet, der in der Folge die Expression einer Vielzahl von Genen entweder induziert oder reprimiert.
Dies wurde z. B. für E. coli durch Transkriptionsanalyse der Crp-abhängigen Genexpression analysiert (Gosset et al. (2004), J. Bacteriol. 186: 3516–3524, Zheng et al. (2004), Nucleic Acids Research 32: 5874–5893). In E. coli wird demnach die Expression von mehr als 100 Genen, bzw. Genclustern (sog. Operons, deren Gene von einem gemeinsamen Promoter transkribiert werden) durch cAMP-Crp reguliert. Dies bedeutet, dass der zelluläre cAMP-Spiegel direkten Einfluss auf die Expression einer Vielzahl von Genen hat. Der Einfluss auf die Genexpression kann dabei nicht generell vorhergesagt werden und kann sowohl positiv wie negativ sein. Beispiele dafür werden in Gosset et al. (2004), J. Bacteriol. 186: 3516–3524 und Zheng et al. (2004), Nucleic Acids Research 32: 5874–5893, offenbart.
Einen indirekten Einfluss auf die Genexpression hat demnach die durch das cpdA Gen kodierte cAMP-Phsophodiesterase, und zwar durch den Abbau von cAMP. Im Sinne der Erfindung verfügt E. coli nicht natürlicherweise über den in den Gleichungen (I) bis (III) beschriebenen 2,3-Butandiol Biosyntheseweg, so dass aus der Analyse von Gosset et al. (2004), J. Bacteriol. 186: 3516–3524 und Zheng et al. (2004), Nucleic Acids Research 32: 5874–5893, keine Vorhersage darüber gemacht werden kann, wie sich die Inaktivierung des cpdA Gens und in der Folge die Änderung des zellulären cAMP-Spiegels auf die Produktion von C4-Produkten wie Acetoin und 2,3-Butandiol auswirken könnte.
Ji et al (2011), Appl. Microbiol. Biotechnol. 89: 1119–1125 beschreiben die Expression einer cAM2-unabhängigen Crp-Mutante in Klebsiella oxytoca, was der Fachmann als künstlich erzeugte Erhöhung des cAMP-Spiegels interpretiert. Durch diesen Eingriff wurde jedoch keine Verbesserung der 2,3-Butandiol Produktion erzielt, sondern lediglich eine Veränderung der Katabolitrepression, wodurch die Zucker Glucose und Xylose gleichzeitig verstoffwechselt wurden (siehe Abb. 2 in Ji et al (2011), Appl. Microbiol. Biotechnol. 89: 1119–1125). Aus diesem Ergebnis lässt sich also nicht ableiten, dass eine Erhöhung des cAMP-Spiegels, z. B. durch Inaktivierung des cpdA-Gens, zur Verbesserung der C4-Produktion von Acetoin oder 2,3-Butandiol führen könnte.
Für den natürlicherweise zur 2,3-Butandiol Produktion befähigten S2-Stamm Klebsiella pneumoniae wurde ein Stamm mit inaktiviertem cpdA Gen beschrieben (Lin et al. (2013) PLoS ONE 8(2): e54430 doi: 10.1371/journal.pone.0054430). Die Inaktivierung des cpdA Gens bewirkte, dass cAMP nicht mehr über die cAMP-Phosphodiesterase Reaktion zu AMP abgebaut wurde. Dies hatte einen erhöhten intrazellulären cAMP-Spiegel zur Folge, wie in Abb. 2C von Lin et al. (2013), PLoS ONE 8(2): e54430 doi: 10.1371/journal.pone.0054430) für K. pneumoniae gezeigt. Über den erhöhten cAMP-Spiegel wurde eine Beeinflussung der Bildung der extrazellulären Polysaccharidbildung beobachtet. Ein Einfluss auf die 2,3-Butandiolbildung wurde jedoch nicht beschrieben. Die Lehre aus Ji et al (2011), Appl. Microbiol. Biotechnol. 89: 1119–1125 und Lin et al. (2013) PLoS ONE 8(2): e54430 doi: 10.1371/journal.pone.0054430 macht es für den Fachmann also nicht naheliegend, in einem 2,3-Butandiolproduzierenden Stamm das cpdA-Gen zu inaktivieren und dadurch eine Verbesserung der Produktbildung zu erzielen.
In Kalivoda et al. (2010) Res. Microbiol. 161: 158–167, wurde eine cpdA-Mutante für einen anderen, natürlicherweise zur 2,3-Butandiol Produktion befähigten Stamm, Serratia marcescens, beschrieben. Untersucht wurde die Pigmentbildung. Auch diese Untersuchungen, auch in Kombination mit dem vorgenannten Stand der Technik, lassen es für den Fachmann nicht als naheliegend erscheinen, eine cpdA-Mutante zu erzeugen, um die Produktion der C4-Produkte Acetoin und 2,3-Butandiol zu verbessern.
Wie in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung gezeigt, ist die Inaktivierung des cpdA Gens in einem natürlicherweise zur 2,3-Butandiol Bildung befähigten Mikroorganismenstamm dazu geeignet, in einem fermentativen Verfahren bei der Verwendung von Glucose wie auch von Xylose als C-Quelle der Fermentation die Ausbeute der C4-Produkte um mehr als 20%, bevorzugt mehr als 40% und insbesondere bevorzugt um mehr als 60% zu steigern.
Nach dem Stand der Technik und dem in Tabelle 1 des 2. Beispiels zusammengefassten Ergebnis war dies völlig unerwartet. Dort wiesen cpdA Mutanten von Raoultella terrigena in der Schüttelkolbenanzucht mit Glucose als C-Quelle ein vergleichbares Produktspektrum auf wie der Wildtypstamm. Dies bestätigt das Ergebnis von Ji et al (2011), Appl. Microbiol. Biotechnol. 89: 1119–1125, Abb. 2. Aufgrund dieser Beobachtung war es für den Fachmann nicht zu erwarten, dass sich die Inaktivierung des cpdA Gens vorteilhaft auf die Produktion von 2,3-Butandiol oder Acetoin auswirken könnte. Daher war es bereits überraschend, dass bei Verwendung von Xylose als C-Quelle der Anzucht im Schüttelkolben cpdA Mutanten deutlich mehr 2,3-Butandiol und Acetoin bildeten als der Wildtypstamm (2. Beispiel, Tabelle 2), und umso mehr, dass in der Fermentation sowohl Glucose (3. Beispiel, Tabelle 3) sowie Xylose (4. Beispiel, Tabelle 4) als C-Quelle zu signifikant höheren C4-Ausbeuten, insbesondere von 2,3-Butandiol führten.
Ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneter Mikroorganismenstamm, auch Produktionsstamm genannt, wird vorzugsweise aus einem Ausgangsstamm hergestellt. Beim Ausgangsstamm handelt es sich um einen natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigten Wildtypstamm. Solche natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigte Wildtypstämme sind z. B. offenbart in Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 (siehe Kapitel 4, „Microorganisms"). Diese verfügen ohne genetische Modifizierung über die Gene, deren Expression entsprechend der Gleichungen (I) bis (III) zur Biosynthese von 2,3-Butandiol aus Pyruvat führt.
Zur Inaktivierung des cpdA Gens sind dem Fachmann verschiedene Methoden bekannt. Bevorzugt wird das cpdA Gen durch den bekannten Mechanismus der homologen Rekombination gezielt Inaktiviert. Kloniersysteme zur gezielten Geninaktivierung mittels homologer Rekombination sind kommerziell erhältlich, wie z. B. offenbart im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit”, basierend auf der Red^®/ET^®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012” und darin zitierter Literatur).
Dem Stand der Technik entsprechend wird das cpdA Gen oder ein Teil des Gens isoliert und eine Fremd-DNS in das cpdA Gen mittels homologer Rekombination kloniert, wodurch der das Protein definierende Leserahmen des cpdA Gens unterbrochen wird. Ein für die gezielte Inaktivierung des cpdA Gens geeignetes DNS-Konstrukt besteht also aus einem 5'-DNS-Abschnitt, der zum genomischen cpdA Gen homolog ist, gefolgt von einem die Fremd-DNS umfassenden Genabschnitt und daran angeschlossen einem 3'-DNS-Abschnitt, der wiederum zum genomischen cpdA Gen homolog ist.
Der für die homologe Rekombination in Frage kommende Bereich des cpdA Gens umfasst dabei nicht nur den für die cAMP-Phosphodiesterase kodierenden Bereich. Der in Frage kommende Bereich umfasst auch das cpdA Gen flankierende DNS-Sequenzen, nämlich im 5'-Bereich vor Beginn des kodierenden Bereichs (Promotor der Gentranskription) sowie im 3'-Bereich nach dem Ende des kodierenden Bereichs (Terminator der Gentranskription), deren Veränderung durch homologe Rekombination ebenso wie die Veränderung des kodierenden Bereichs zur Inaktivierung des cpdA Gens führen kann.
Bei der Fremd-DNS handelt es sich bevorzugt um eine Selektionsmarker-Expressionskassette. Diese besteht aus einem Promotor der Gentranskription, der funktionell verbunden ist mit dem eigentlichen Selektionsmarkergen und gegebenenfalls gefolgt von einem Terminator der Gentranskription. Vorzugsweise enthält der Selektionsmarker 5'- und 3'-flankierende homologe Sequenzen des cpdA Gens von jeweils mindestens 30 bp Länge, bevorzugt jeweils mindestens 50 bp Länge.
Das DNS-Konstrukt zur Inaktivierung des cpdA Gens besteht also, beginnend vom 5'-Ende, aus einer zum cpdA Gen homologen Sequenz von mindestens 30 bp Länge, bevorzugt mindestens 50 bp Länge, gefolgt von der Expressionskassette des Selektionsmarkers sowie gefolgt von einer weiteren, zum cpdA Gen homologen Sequenz von mindestens 30 bp Länge, bevorzugt mindestens 50 bp Länge.
Bei den Selektionsmarkergenen handelt es sich im Allgemeinen um Gene, deren Genprodukt dem Ausgangsstamm das Wachstum unter selektiven Bedingungen ermöglicht, unter denen der ursprüngliche Ausgangsstamm nicht wachsen kann.
Bevorzugte Selektionsmarkergene sind ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotika-Resistenzgene wie z. B. das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen oder aber auch das Neomycin-Resistenzgen. Andere bevorzugte Selektionsmarkergene ermöglichen Ausgangsstämmen mit einem Stoffwechseldefekt (z. B. Aminosäureauxotrophien) das Wachstum unter selektiven Bedingungen, indem ihre Expression den Stoffwechseldefekt korrigiert. Schließlich sind auch Selektionsmarkergene möglich, deren Genprodukt eine an sich für den Ausgangsstamm toxische Verbindung chemisch verändert und somit inaktiviert (z. B. das Gen des Enzyms Acetamidase, welches die für viele Mikroorganismen toxische Verbindung Acetamid in die ungiftigen Produkte Acetat und Ammoniak spaltet).
Unter den Selektionsmarkergenen besonders bevorzugt sind das Ampicillin-Resistenzgen, das Tetracyclin-Resistenzgen, das Kanamycin-Resistenzgen, das Chloramphenicol-Resistenzgen. Insbesondere bevorzugt sind das Tetracyclin-Resistenzgen und das Kanamycin-Resistenzgen.
Auf Basis der homologen Rekombination gibt es käuflich erwerbliche Systeme, die zusätzlich zur gezielten Geninaktivierung auch die Möglichkeit bieten, den Selektionsmarker wieder aus dem Genom zu entfernen, womit die Möglichkeit der Herstellung von Doppel- und Mehrfachmutanten gegeben ist. Ein solches System ist z. B. der käuflich erhältliche „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit”, basierend auf der Red^®/ET^®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH (siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012” und darin zitierte Literatur). Bevorzugt ist ein Verfahren zur gezielten Geninaktivierung des cpdA Gens auf Basis der Red^®/ET^®-Technologie.
Bei dem Ausgangsstamm handelt es sich um jeden beliebigen, natürlicherweise zur Produktion der C4-Produkte Acetoin und 2,3-Butandiol befähigten Mikroorganismus. Einen Überblick über solche Stämme gibt Celinska und Grajek, Biotechnol. Advances (2009) 27: 715–725 (siehe Kapitel 4, „Microorganisms"). Unter diesen Stämmen bevorzugt sind Stämme der Gattung Raoultella, Bacillus, oder Paenibacillus. Diese Stämme sind alle käuflich erhältlich z. B. bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GbmH (Braunschweig), darunter ist ebenso bei der DSMZ GmbH käuflich erhältlich der in den Beispielen verwendete Stamm Raoultella terrigena DSM 2687.
Bevorzugt handelt es sich um einen Ausgangsstamm und einen Produktionsstamm eingestuft in der Sicherheitsstufe S1 und von diesen, wiederum bevorzugt, um Stämme der Art Raoultella terrigena.
Besonders bevorzugt ist ein Produktionsstamm, in dem das inaktivierte cpdA Gen aus Raoultella terrigena stammt.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Produktionsstamm kann darüberhinaus noch weiter optimiert werden, um die C4-Produkt Herstellung noch zusätzlich zu verbessern.
Die Optimierung kann gentechnisch erfolgen durch zusätzliche Expression eines oder mehrerer Gene, die zur Verbesserung der Produktionseigenschaften geeignet sind. Beispiele solcher Gene sind z. B. 2,3-Butandiol Biosynthesegene wie Acetolactatsynthase ( DE 10 2011 003 394 ), Acetolactatdecarboxylase ( DE 10 2011 003 383 ) und Acetoinreduktase ( DE 10 2011 003 387 ). Diese Gene können in an sich bekannter Weise als jeweils eigene Genkonstrukte oder aber auch kombiniert als eine Expressionseinheit (als sog. Operon) im Produktionsstamm exprimiert werden. So ist beispielsweise bekannt, dass in Raoultella terrigena alle drei Biosynthesegene des 2,3-Butandiols (sog. BUD-Operon, Blomqvist et al., J. Bacteriol. (1993) 175: 1392–1404), bzw. in Stämmen der Gattung Bacillus die Gene der Acetolactatsynthase und der Acetolactatdecarboxylase in einem Operon organisiert sind (Renna et al., J. Bacteriol (1993) 175: 3863–3875).
Der Produktionsstamm kann darüber hinaus dadurch optimiert werden, dass neben dem cpdA Gen noch weitere Gene inaktiviert werden, deren Genprodukte sich negativ auf die C4-Produkt Herstellung auswirken. Beispiele dafür sind Gene, deren Genprodukte für die Nebenproduktbildung verantwortlich sind. Dazu zählen z. B. die Lactatdehydrogenase (Milchsäurebildung) oder die Acetaldehyddehydrogenase (Ethanolbildung).
Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide.
1 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 3,4 kb großen Vektor pKD13.
2 zeigt den in Beispiel 1 verwendeten 6,3 kb großen Vektor pKD46.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert:
1. Beispiel: Herstellung von cpdA Knock out Mutanten in Raoultella terrigena
Als Ausgangsstamm für die Genisolierung sowie für die Stammentwicklung wurde Raoultella terrigena DSM 2687 verwendet (käuflich erhältlich bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
Ziel der Geninaktivierung war das cpdA Gen aus R. terrigena. Die DNS-Sequenz des cpdA Gens aus R. terrigena ist offenbart in SEQ ID NO: 1, kodierend für ein cAMP-Phosphodiesterase Protein mit der in SEQ ID NO: 2 offenbarten Aminosäuresequenz.
Das R. terrigena cpdA Gen wurde mit der aus der E. coli Molekularbiologie bekannten Red^®/ET^®-Technologie der Fa. Gene Bridges GmbH inaktiviert (beschrieben im Anwenderhandbuch des „Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit", siehe „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012 und darin zitierter Literatur, z. B. Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000): 6640–6645). Dazu wurden die Plasmide pKD13 (1), pKD46 (2), und pCP20 verwendet.
Das 3,4 kb große Plasmid pKD13 (1) ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048744.1.
Das 6,3 kb große Plasmid pKD46 (2) ist offenbart in der „GenBank” Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048746.1.
Das 9,4 kb große Plasmid pCP20 ist offenbart in Cherepanov and Wackernagel, Gene 158 (1995): 9–14.
Zur Geninaktivierung wurden die Primer cpd-2f (SEQ ID NO: 3) und cpd-3r (SEQ ID NO: 4) verwendet. Zum Nachweis des cpdA Gens wurden die Primer cpd-1f (SEQ ID NO: 5) und cpd-4r (SEQ ID NO: 6) verwendet. Die Primer hatten folgende DNS-Sequenzen:
SEQ ID NO: 3:

5'-TACCTGGGAA AGCTATCAGG CCGTGCTGGA AGCCATCCAC GCCTCGCAGC GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC-3'

SEQ ID NO: 4:

5'-AGTTGTCGCA GTGCGGCTTA AACTGCACGC AGGTTGACGG CGTGGCCATC CTGTCAAACA TGAGAATTAA-3'

SEQ ID NO: 5:

5'-TTGGAAAGCC TGTTAAACCT TCCTT-3'

SEQ ID NO: 6:

5'-TCAGTATCCT TCTGAAGCGA TATCC-3'

Primer cpd-1f enthielt das 5'-Ende (bp 1-25 in SEQ ID NO: 1), Primer cpd-4r das 3'-Ende des cpdA Gens (bp 828-804 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form). Primer cpd-2f enthielt 50 bp aus dem 5'-Bereich des cpdA Gens (bp 111-160 in SEQ ID NO: 1) und daran angeschlossen 20 bp spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „priming site 1” in 1). Primer cpd-3r enthielt 50 bp aus dem 3'-Bereich des cpdA Gens (bp 651-700 in SEQ ID NO: 1, in revers komplementärer Form) und daran angeschlossen 20 bp spezifisch für das Plasmid pKD13 (bezeichnet als „priming site 2” in 1).
Zur Inaktivierung des cpdA Gens in R. terrigena durch homologe Rekombination mit dem Lambda Red System wurden, in an sich bekannter Weise (siehe z. B. „Technical Protocol, Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit, by Red®/ET® Recombination, Cat. No. K006, Version 2.3, Juni 2012” der Fa. Gene Bridges GmbH), folgende Schritte durchgeführt:
R. terrigena wurde mit dem Plasmid pKD46 (sog. „Red Recombinase” Plasmid, 2) transformiert und ein Ampicillin-resistenter Klon isoliert (bezeichnet als R.t.-pKD46). Die Transformation von R. terrigena erfolgte wie in DE 10 2011 003 394 beschrieben.
Ein cpdA-spezifisches, zu dessen Inaktivierung geeignetes DNS-Fragment wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) mit DNS des Plasmids pKD13 (1) hergestellt. DNS des Plasmids pKD13 wurde verwendet, um mit den Primern cpd-2f (SEQ ID NO: 3) und cpd-3r (SEQ ID NO: 4) ein 1,3 kb PCR-Produkt herzustellen, das am 5'- und am 3'-Ende jeweils einen DNS-Abschnitt von 50 bp enthielt, der spezifisch für das cpdA Gen aus R. terrigena war. Darüber hinaus enthielt das PCR-Produkt die Expressionskassette des in pKD13 enthaltenen Kanamycin Resistenzgens und, jeweils flankierend zum 5'- und 3'-Ende der Kanamycin Expressionskassette, sog. „FRT direct repeats” (bezeichnet als „natural FRT site” und „distal 35 nt of natural FRT site” in 1), kurze DNS-Abschnitte, die in einem späteren Arbeitsschritt zur Entfernung des Kanamycin Antibiotikamarkers als Erkennungssequenz für die „FLP Rekombinase” (enthalten auf dem Plasmid pCP20) dienten.
Das 1,3 kb große PCR-Produkt wurde isoliert und mit der, dem Fachmann geläufigen, nur methylierte DNS schneidenden Restrikitonsendonuclease Dpn I behandelt, um restliche pKD13 Plasmid DNS zu entfernen. Nicht-methylierte DNS aus der PCR-Reaktion wird dabei nicht abgebaut.
Das 1,3 kb große, für das cpdA Gen spezifische und eine Expressionskassette für das Kanamycin Resistenzgen enthaltende PCR-Produkt wurde in bekannter Weise ( DE 10 2011 003 394 ) in R.t.-pKD46 transformiert und auf LBkan Platten bei 30°C Kanamycin-resistente Klone isoliert. LBkan Platten enthielten LB-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl), 1,5% Agar und 15 mg/l Kanamycin.
Sieben der erhaltenen Kanamycin-resistenten Klone wurden auf LBkan Platten gereinigt und in einer PCR-Reaktion überprüft, ob die Kanamycin-Resistenz Kassette korrekt im cpdA Gen integriert worden war.
Die für die PCR-Reaktion (Taq DNS Polymerase, Qiagen) verwendete genomische DNS war zuvor in an sich bekannter Weise mit einem DNS-Isolierungskit (Qiagen) aus Zellen der Anzucht von Kanamycin-resistenten Klonen von R. terrigena DSM 2687 in LBkan-Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 15 mg/l Kanamycin) gewonnen worden. Dabei diente genomische DNS des R. terrigena Wildtyp Stammes DSM 2687 als Kontrolle. Die für die PCR-Reaktion verwendeten Primer waren cpd-1f (SEQ ID NO: 5) und cpd-4r (SEQ ID NO: 6).
R. terrigena Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 830 bp, wie für das intakte Gen erwartet. Die sieben Kanamycin-resistenten Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 1600 bp, wie für den Fall erwartet, dass das 1,3 kb PCR-Produkt an den durch die Primer cpd-2f (SEQ ID NO: 3) und cpd-3r (SEQ ID NO: 4) definierten Stellen im cpdA-Gen integriert worden war. Dieses Ergebnis zeigte, dass am Genort des cpdA Gens erfolgreich das Kanamycin Resistenzgen integriert werden konnte und somit das cpdA Gen inaktiviert worden war. Die sieben Klone mit inaktiviertem cpdA Gen erhielten die Bezeichnung R.t.ΔcpdA::kan-1 bis R.t.ΔcpdA::kan-7.
Zur Eliminierung des Kanamycin Selektionsmarkers wurden die Mutanten R.t.ΔcpdA::kan-1 bis R.t.ΔcpdA::kan-4 mit dem Plasmid pCP20 transformiert und Transformanten bei 30°C selektiert. Der 9,4 kb Vektor pCP20 ist offenbart in Cherepanov und Wackernagel (1995), Gene 158: 9–14. Auf dem Vektor pCP20 ist das Gen der FLP Recombinase enthalten. Die FLP Recombinase erkennt die FRT Sequenzen, welche die Expressionskassette des Kanamycin Resistenzgens flankieren und bewirkt die Entfernung der Kanamycin Expressionskassette. Dazu wurden die bei 30°C erhaltenen Klone bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen wurde zum einen die Expression der FLP Recombinase induziert und zum zweiten die Replikation des pCP20 Vektors unterbunden.
Das Resultat dieses Schrittes waren Klone, in denen zum einen das cpdA Gen inaktiviert worden war und die zum anderen wieder sensitiv gegen Kanamycin waren (sog. „Curing” des Antibiotika Selektionsmarkers). Die Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom der ΔcpdA Mutanten ermöglicht die Einführung weiterer Mutationen, um Doppel- oder auch Mehrfachmutanten herzustellen. Von den vier untersuchten Mutanten R.t.ΔcpdA::kan-1 bis R.t.ΔcpdA::kan-4 waren nach der Behandlung mit dem pCP20 Plasmid alle vier Stämme Kanamycin-sensitiv, was durch plattieren auf LB- und LBkan-Platten nachgewiesen wurde. Während alle vier Stämme auf LB-Platten wuchsen, konnte auf LBkan-Platten kein Wachstum mehr beobachtet werden, was auf die erfolgreiche Entfernung der Kanamycin-Kassette aus dem Genom hindeutete.
Die Entfernung der Kanamycin-Kassette wurde zusätzlich in einer PCR-Reaktion verifiziert. Dazu wurde von den Kanamycin-sensitiven Klonen genomische DNS isoliert (Qiagen DNS-Isolierungskit) und in einer PCR-Reaktion (Tag DNS Polymerase, Qiagen) mit den Primern cpd-1f (SEQ ID NO: 5, umfasst das 5'-Ende des cpdA Gens) und cpd-4r (SEQ ID NO: 6, umfasst das 3'-Ende des cpdA Gens) eingesetzt. R. terrigena Wildtyp DNS ergab bei der PCR-Reaktion ein DNS Fragment von 830 bp, wie für das intakte cpdA Gen erwartet. Die vier Kanamycin-sensitiven Klone hingegen ergaben bei der PCR-Reaktion ein DNS-Fragment von ca. 370 bp, was der erwarteten Größe der nach der homologen Rekombination verbliebenen 5'- und 3'-Fragmente des inaktivierten cpdA Gens entsprach.
Die aus diesem Schritt isolierten Stämme erhielten die Bezeichnung R.t.ΔcpdA-1 bis R.t.ΔcpdA-4. Diese Stämme zeichnen sich dadurch aus, dass in ihnen das cpdA Gen inaktiviert war und dass diese Stämme wieder sensitiv gegen das Antibiotikum Kanamycin waren.
2. Beispiel: Vergleichende Schüttelkolbenanzucht der R.t.ΔcpdA Mutanten mit Glucose und Xylose als C-Quelle
Ausgangsstamm war Raoultella terrigena DSM 2687 (R.t.-WT, Kontrollstamm). Knock out Mutanten des cpdA Gens wurden hergestellt wie im 1. Beispiel beschrieben. Die verwendeten Mutanten hatten die Bezeichnung R.t.ΔcpdA-1 bis R.t.ΔcpdA-3.
Die Stämme wurden durch Schüttelkolbenanzucht auf Produktion der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin sowie der C2-Produkte Acetat und Ethanol getestet. Dazu wurden jeweils 50 ml FM2-G, bzw. FM2-X Medium beimpft und bei 30°C und 140 rpm (Infors Schüttler) inkubiert.
FM2-G Medium enthielt Glucose 40 g/l; CSD (Corn Steep Liquor getrocknet) 10 g/l; Ammoniumsulfat 5 g/l; NaCl 0,5 g/l; FeSO₄ × 7H₂O 75 mg/l; Na₃Citrat × 2H₂O 1 g/l; CaCl₂ × 2H₂O 14,7 mg/l; MgSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l; KH₂PO₄ 1,5 g/l; Spurenelementemix 10 ml/l. Der pH des FM2-G Mediums wurde vor Beginn der Anzucht auf 6,0 eingestellt.
FM2-X Medium enthielt die gleiche Zusammensetzung wie FM2-G Medium. Jedoch wurde die Glucose durch Xylose (40 g/l) ersetzt.
Der Spurenelementemix hatte die Zusammensetzung H₃BO₃ 2,5 g/l; CoCl₂ × 6H₂O 0,7 g/l; CuSO₄ × 5H₂O 0,25 g/l; MnCl₂ × 4H₂O 1,6 g/l; ZnSO₄ × 7H₂O 0,3 g/l und Na₂MoO₄ × 2H₂O 0,15 g/l.
Die Kultivierungsdauer betrug 96 h. Der Glucose-, bzw. Xylosegehalt von Proben der Anzucht wurde in Abständen von 24 h bestimmt mit dem Analysator 7100MBS der Fa. YSI, ausgerüstet mit Messstationen sowohl für Glucose wie für Xylose. Bei Bedarf wurden Glucose, bzw. Xylose aus 40% (w/v) Stocklösungen nachgefüttert.
In Abständen von 24 h wurden Proben auf ihren Gehalt an C4- und C2-Produkten untersucht. Die Bestimmung des Gehalts an C4-Produkten (2,3-Butandiol und Acetoin) sowie an C2-Produkten (Acetat und Ethanol) in Kulturüberständen erfolgte in an sich bekannter Weise durch ¹H-NMR (siehe z. B. DE 10 2011 003 394 ). Dazu wurde jeweils ein Aliquot der Anzucht zentrifugiert (10 min 5000 rpm, Eppendorf Labofuge) und 0,1 ml des Kulturüberstandes mit 0,6 ml TSP (3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d₄ Natriumsalz) Standardlösung definierten Gehalts (interner Standard, typischerweise 5 g/l) in D₂O gemischt. Die ¹H-NMR Analyse incl. Peak Integration erfolgte entsprechend dem Stand der Technik mit einem Avance 500 NMR-Gerät der Fa. Bruker. Zur quantitativen Analyse wurden die NMR-Signale der Analyten in folgenden Bereichen integriert:

TSP: 0,140–0,145 ppm (9H)

2,3-Butandiol: 1,155–1,110 ppm (6H)

Ethanol: 1,205–1,157 ppm (3H)

Essigsäure: 2,000–1,965 ppm (3H)

Acetoin: 2,238–2,200 ppm (3H)

Die Produktionsverläufe für die C-Quelle Glucose sind in Tabelle 1, für die C-Quelle Xylose in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 1: Produktionsverlauf in Raoultella terrigena Stämmen mit Glucose als C-Quelle (R.t.-WT: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔcpdA-1, R.t.ΔcpdA-2, R.t.ΔcpdA-3 erfindungsgemäß)

Zeit (h)	Produkt	R.t.-WT (g/l)	R.t.ΔcpdA-1 (g/l)	R.t.ΔcpdA-2 (g/l)	R.t.ΔcpdA-3 (g/l)
48	2,3-BDL	23,7	23,7	24,2	23,8
	Acetoin	6,7	7,3	7,4	7,2
	Acetat	2,1	2,4	2,4	2,4
	Ethanol	3,5	4,2	4,3	4,2
72	2,3-BDL	33,8	34,7	36,4	36,7
	Acetoin	9,0	8,8	8,8	8,4
	Acetat	2,6	3,0	2,9	3,0
	Ethanol	4,2	4,8	4,9	4,9
96	2,3-BDL	47,3	46,7	47,9	47,1
	Acetoin	8,4	9,4	9,3	9,5
	Acetat	2,7	2,7	2,8	2,7
	Ethanol	5,6	5,5	5,8	5,2

Tabelle 2: Produktionsverlauf in Raoultella terrigena Stämmen mit Xylose als C-Quelle; (R.t.-WT: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔcpdA-1, R.t.ΔcpdA-2, R.t.ΔopdA-3 erfindungsgemäß)

Zeit (h)	Produkt	R.t.-WT (g/l)	R.t.ΔcpdA-1 (g/l)	R.t.ΔcpdA-2 (g/l)	R.t.ΔcpdA-3 (g/l)
48	2,3-BDL	23,2	28,0	26,8	28,7
	Acetoin	4,4	5,6	5,2	4,4
	Acetat	3,9	2,3	2,0	1,8
	Ethanol	4,1	3,4	3,4	3,5
72	2,3-BDL	26,2	41,2	36,7	41,5
	Acetoin	4,4	6,9	6,9	6,3
	Acetat	5,7	2,8	3,0	2,6
	Ethanol	3,8	4,0	3,8	4,2
96	2,3-BDL	29,3	52,1	49,2	51,4
	Acetoin	5,1	7,4	7,0	7,7
	Acetat	6,0	3,4	3,9	3,3
	Ethanol	3,3	3,7	4,7	4,9

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, resultierte die Inaktivierung des cpdA Gens bei der Anzucht im Schüttelkolben in keiner signifikanten Änderung des Produktspektrums gegenüber dem R. terrigena Wildtyp Stamm R.t.-WT, sofern Glucose als C-Quelle verwendet wurde und die Anzucht im Schüttelkolben erfolgte.
Wurde hingegen Xylose als C-Quelle der Schüttelkolbenanzucht eingesetzt, konnte in den cpdA Mutanten eine signifikante Verbesserung vor allem der 2,3-Butandiol Ausbeute gegenüber dem R. terrigena Wildtyp Stamm R.t.-WT beobachtet werden (Tabelle 2). Die Steigerung der 2,3-Butandiol Ausbeute durch Inaktivierung des cpdA Gens betrug 65% oder mehr. Weiterhin konnte auch eine Steigerung der Acetoin Ausbeute um 35% und mehr beobachtet werden. Die Produktion von Acetat hingegen wurde reduziert. Die Bildung von Ethanol wurde erhöht.
Die Inaktivierung des cpdA Gens in R. terrigena führt also in der Schüttelkolbenanzucht zu einer signifikanten Ausbeutesteigerung der C4-Produkte 2,3-Butandiol und Acetoin, sofern Xylose als C-Quelle verwendet wird. Diese Beobachtung war unerwartet, da bei Verwendung von Glucose als C-Quelle der Anzucht in Schüttelkolben keine Änderung des Produktspektrums, sowohl der C2- wie der C4-Produkte beobachtet werden konnte.
3. Beispiel:
Produktion von C4- und C2-Verbindungen mit R. terrigena cpdA Knock out Stämmen durch Fed-Batch Fermentation mit Glucose als C-Quelle
In der Fermentation eingesetzte Stämme waren R.t.-WT (Kontrollstamm) und R.t.ΔcpdA-1 (siehe 2. Beispiel).
Verwendet wurden „Labfors II” Fermenter der Fa. Infors. Das Arbeitsvolumen betrug 1,5 l (3 l Fermentervolumen). Die Fermenter waren entsprechend dem Stand der Technik mit Elektroden zur Messung des pO₂ und des pH sowie mit einer Schaumsonde ausgerüstet, welche bei Bedarf die Zudosierung einer Antischaumlösung regulierte. Die Werte der Messsonden wurden über ein Computerprogramm aufgezeichnet und graphisch dargestellt. Die Fermentationsparameter Rührerdrehzahl (rpm), Belüftung (Versorgung mit Pressluft in vvm, Volumen Pressluft pro Volumen Fermentationsmedium pro Minute), pO₂ (Sauerstoffpartialdruck, auf einen Anfangswert von 100% kalibrierter relativer Sauerstoffgehalt), pH und Fermentationstemperatur wurden über ein vom Fermenterhersteller bereitgestelltes Computerprogramm gesteuert und aufgezeichnet. Feed Medium (73% Glucose, w/v) wurde entsprechend dem Verbrauch an Glucose über eine peristaltische Pumpe zudosiert. Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde ein alkoxylierter Fettsäureester auf vegetabilischer Basis, käuflich erhältlich unter der Bezeichnung Struktol J673 bei Schill & Seilacher (20–25% v/v in Wasser verdünnt), verwendet.
Batch-Fermentationsmedium war das im 2. Beispiel beschriebene FM2-G Medium. 1,35 l des FM2-G Medium wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt (siehe 2. Beispiel).
Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 600 rpm, Belüftung mit 0,4 vvm, pH 6,3.
In regelmäßigen Abständen wurden dem Fermenter Proben entnommen zur Analyse folgender Parameter:
Die Zelldichte OD₆₀₀ als Maß der gebildeten Biomasse wurde photometrisch bei 600 nm bestimmt (BioRad Photometer SmartSpec^TM 3000).
Zur Bestimmung der Trockenbiomasse wurden je Messpunkt in einer Dreifachbestimmung je 1 ml Fermentationsansatz zentrifugiert, das Zellpellet mit Wasser gewaschen und bei 80°C zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Der Glucosegehalt und der Gehalt an C4- und C2-Produkten wurden bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Glucose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa. Watson Marlow) eine 73% (w/v) Glucose Feedlösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Glucose Verbrauchsrate bestimmt.

Tabelle 3 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-WT und in dem cpdA Knock out Stamm R.t.ΔcpdA-1. Tabelle 4: Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Glucose als C-Quelle (R.t.-WT: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔcpdA-1 erfindungsgemäß)

Zeit (h)	Produkt	R.t.-WT (g/l)	R.t.ΔcpdA-1 (g/l)
24	2,3-BDL	55,1	80,8
	Acetoin	1,1	3,8
	Acetat	0,0	0,0
	Ethanol	7,5	9,2
48	2,3-BDL	67,4	116,9
	Acetoin	2,1	7,6
	Acetat	0,0	2,1
	Ethanol	7,3	8,5
72	2,3-BDL	99,2	137,5
	Acetoin	4,0	12,2
	Acetat	1,6	4,2
	Ethanol	6,6	8,7

Anders als in Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (2. Beispiel), führte in der Fermentation bei Verwendung von Glucose als C-Quelle die Inaktivierung des cpdA Gens im Stamm R.t.ΔcpdA-1 zu einer signifikanten Steigerung der Produktion von 2,3-Butandiol um mehr als 35%. Die C4-Produktion (Summe der Produktion von Acetoin und 2,3-Butandiol) wurde sogar um 45% gesteigert.
4. Beispiel:
Produktion von C4- und C2-Verbindungen mit R. terrigena cpdA Knock out Stämmen durch Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle
Die Fermentation wurde durchgeführt, wie im 3. Beispiel beschrieben. In der Fermentation eingesetzte Stämme waren R.t.-WT (Kontrollstamm) und R.t.ΔcpdA-1. Batch-Fermentationsmedium war das im 2. Beispiel beschriebene FM2-X Medium.
1,35 l des FM2-X Mediums wurden mit 150 ml Vorkultur beimpft. Die Vorkultur der zu fermentierenden Stämme wurde durch 24 h Schüttelkolbenanzucht in Glucose enthaltendem FM2-G Medium hergestellt (siehe 2. Beispiel).
Die Fermentationsbedingungen waren: Temperatur 30°C, Rührerdrehzahl 600 rpm, Belüftung mit 0,4 vvm, pH 6,3.
Der Xylosegehalt und der Gehalt an C4- und C2-Produkten wurden bestimmt wie im 2. Beispiel beschrieben.
Nachdem die im Batchmedium vorgelegte Xylose verbraucht war, wurde über eine Pumpe (peristaltische Pumpe 101 U/R der Fa.
Watson Marlow) eine 75% (w/v) Xylose Feedlösung zugefüttert. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde dabei von der aktuellen Xylose Verbrauchsrate bestimmt.

Tabelle 4 zeigt die zeitabhängige Bildung von C2- und C4-Produkten im R. terrigena Kontrollstamm R.t.-WT und in dem cpdA Knock out Stamm R.t.ΔcpdA-1. Tabelle 4: Produktionsverlauf in der Fed-Batch Fermentation mit Xylose als C-Quelle (R.t.-WT: Vergleichsbeispiel; R.t.ΔcpdA-1 erfindungsgemäß)

Zeit (h)	Produkt	R.t.-WT (g/l)	R.t.ΔcpdA-1 (g/l)
24	2,3-BDL	44,6	51,6
	Acetoin	13,1	6,3
	Acetat	4,2	2,2
	Ethanol	3,3	4,8
48	2,3-BDL	61,8	76,5
	Acetoin	16,0	13,0
	Acetat	11,5	6,8
	Ethanol	2,8	4,6
72	2,3-BDL	62,1	91,5
	Acetoin	17,7	12,4
	Acetat	18,1	12,0
	Ethanol	1,9	4,7

Wie bereits in den Schüttelkolbenexperimenten beobachtet (2. Beispiel), führte bei Verwendung von Xylose als C-Quelle die Inaktivierung des cpdA Gens im Stamm R.t.ΔcpdA-1 zu einer signifikanten Steigerung der Produktion von 2,3-Butandiol um mehr als 40%, der C4-Produkte Acetoin und 2,3-Butandiol um mehr als 30%. Dagegen wurde die Acetatbildung stark reduziert, und zwar um mehr als 30%.
5. Beispiel: Fermentation mit der C-Quelle Glucose im 330 l Maßstab
Fermentiert wurde die Raoultella terrigena Knock out Mutante R.t.ΔcpdA-1, in der das cpdA Gen inaktiviert worden war.
Herstellung eines Inokulums für den Vorfermenter: Ein Inokulum von R.t.ΔcpdA-1 in LB Medium (siehe 1. Beispiel) wurde hergestellt, indem 2 × 100 ml LB Medium, jeweils in einem 1 l Erlenmeyerkolben, mit jeweils 0,25 ml einer Glycerinkultur (Über-Nacht Kultur des Stammes in LB Medium, mit Glycerin in einer Endkonzentration von 20% v/v versetzt und bei –20°C aufbewahrt) beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte für 7 h bei 30°C und 120 rpm auf einem Infors Orbitalschüttler (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 0,5–2,5). 100 ml der Vorkultur wurden zum Beimpfen von 8 l Fermentermedium verwendet. Beimpft wurden zwei Vorfermenter mit je 8 l Fermentermedium.
Vorfermenter: Die Fermentation wurde in zwei Biostat^® C-DCU 3 Fermentern der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-G (siehe 2. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Batch Modus.
2 × 8 l FM2-G wurden mit je 100 ml Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 1 vvm. Der Sauerstoffpartialdruck pO₂ wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 450–1.000 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Nach 18 h Fermentationsdauer (Zelldichte OD₆₀₀/ml von 30–40) wurden die beiden Vorfermenter als Inokulum für den Hauptfermenter verwendet.
Hauptfermenter: Die Fermentation wurde in einem Biostat^® D 500 Fermenter (Arbeitsvolumen 330 l, Kesselvolumen 500 l) der Firma Sartorius BBI Systems GmbH durchgeführt. Fermentationsmedium war FM2-G mit Glucose als C-Quelle (siehe 2. Beispiel). Die Fermentation erfolgte im sog. Fed-Batch Modus.
180 l FM2-G wurden mit 16 l Inokulum beimpft. Fermentationstemperatur war 30°C. pH der Fermentation war 6,3 und wurde mit den Korrekturmitteln 25% NH₄OH, bzw. 6 N H₃PO₄ konstant gehalten. Die Belüftung erfolgte mit Pressluft bei einem konstanten Durchfluss von 0,4 vvm, bezogen auf das Anfangsvolumen. Der Sauerstoffpartialdruck pO2 wurde auf 50% Sättigung eingestellt. Die Regulierung des Sauerstoffpartialdruckes erfolgte über die Rührgeschwindigkeit (Rührerdrehzahl 200–500 rpm). Zur Kontrolle der Schaumbildung wurde Struktol J673 (20–25% v/v in Wasser) verwendet. Im Verlauf der Fermentation wurde der Glucoseverbrauch durch off-live Glucose-Messung mit einem Analysator der Fa. YSI bestimmt (siehe 2. Beispiel). Sobald die Glucosekonzentration der Fermentationsansätze ca. 20 g/l betrug (8–10 h nach Inokulation), wurde die Zudosierung einer 73% w/v Glucose Feedlösung gestartet. Die Flussrate des Feeds wurde so gewählt, dass während der Produktionsphase eine Glucosekonzentration von 10–20 g/l eingehalten werden konnte. Nach Beendigung der Fermentation betrug das Volumen im Fermenter 310 l.

Die Analyse der Fermentationsparameter erfolgte wie im 2. Beispiel beschrieben. Der Produktionsverlauf ist in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5 Produktion von 2,3-BDL durch Fed-Batch Fermentation im 330 l Maßstab

Zeit (h)	Produkt	R.t.ΔcpdA-1 (g/l)
24	2,3-BDL	79,8
	Acetoin	4,3
	Acetat	1,9
	Ethanol	6,3
48	2,3-BDL	117,5
	Acetoin	8,0
	Acetat	3,2
	Ethanol	5,5
72	2,3-BDL	141
	Acetoin	10,3
	Acetat	5,0
	Ethanol	5,4

SEQUENCE LISTING
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Lignozellulose-haltiger Biomasse mittels eines Mikrorganismenstammes dadurch gekennzeichnet, dass in der Fermentation als Produktionsstamm ein natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Mikroorganismenstamm mit einem cpdA Gen eingesetzt wird, bei dem das cpdA Gen inaktiviert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass aus Lignozellulose-haltiger Biomasse ein Zucker zu C4-Produkten umgewandelt wird, wobei es sich bei dem Zucker um eine Hexose oder Pentose, bevorzugt Glucose oder Xylose, insbesondere Xylose handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass es in einem pH-Bereich von pH 5 bis pH 8 und bei einer Temperatur von 20°C bis 40°C unter aeroben Bedingungen über einen Zeitraum von 10 bis 100 h durchgeführt wird.
Verwendung eines natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Mikroorganismenstammes mit einem cpdA Gen, bei dem das cpdA Gen inaktiviert ist zur fermentativen Herstellung von C4-Produkten aus Zuckern, die aus Lignozellulose-haltiger Biomasse gewonnen werden.
Natürlicherweise zur 2,3-Butandiolproduktion befähigter Mikroorganismenstamm, der in der Lage ist, bei der fermentativen Herstellung von C4-Produkten als C-Quelle bei der Fermentation Zucker zu verwerten die in Lignozellulose-haltiger Biomasse vorkommen, enthaltend ein cpdA Gen, ausgenommen Stämme der Art Klebsiella pneumoniae und der Art Serratia marcescens, dadurch gekennzeichnet, dass das cpdA Gen inaktiviert ist.
Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Stamm der Gattung Raoultella, besonders bevorzugt um R. terrigena handelt.
Mikroorganismenstamm gemäß Anspruch 5 oder 6 dadurch gekennzeichnet, dass das cpdA Gen welches inaktiviert ist, aus Raoultella terrigena stammt.