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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB), dass in Form eines 2,4-Dihydroxybutyrat-Salzes oder in Form der Säure 2,4-Dihydroxybuttersäure vorliegen kann, oder L-Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges.
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Es besteht ein zentrales bioökonomisches und ökologisches Interesse daran, die Abhängigkeit von fossilen Rohstoffen durch das Ermöglichen einer biologisch nachhaltigen Produktion von Kraftstoffen und Chemikalien auf biologischer Basis zu verringern. In diesem Zusammenhang ist auch ein enormer Anstieg der Bemühungen der Industrie an der Biosynthese von (L)-2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) aufgrund seiner Bedeutung als Ausgangsstoff für die Synthese von Methioninanaloga für Tiernahrung zu verzeichnen.
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Die Aminosäure Methionin sowie das Methionin-Analogon (D/L)-2-Hydroxy-4-(Methylthio)butyrat (HMTB) werden vorwiegend als Futtermittelzusatzstoff in der Hühnerzucht eingesetzt und erzeugen auf dem Markt einen Umsatz von jährlich zirka 3 Milliarden Euro. Methionin wird gegenwärtig ausschließlich aus den fossilen Rohstoffen Erdöl und Erdgas hergestellt. Die Aminosäure Threonin wird als Futtermittelzusatzstoff in der Schweinemast eingesetzt. Hersteller von Methionin haben ein starkes Interesse daran, ihre chemischen Methionin-Herstellungsprozesse auf nachhaltige mikrobielle Produktionsprozesse umzustellen, da mit der ansteigenden Bepreisung von CO2-Emissionen aus chemischen Prozessen eine starke Verteuerung dieser Prozesse zu erwarten ist.
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Die Aminosäure L-Threonin wird im industriellen Maßstab gegenwärtig durch mikrobielle Produktionsprozesse aus den Zuckern Glukose beziehungsweise Saccharose hergestellt. Die Aminosäure D/L-Methionin und das gleichwertig einsetzbare Analogon D/L-2-Hydroxy-4-(Methylthio)butyrat (HMTB) werden gegenwärtig im industriellen Maßstab ausschließlich aus Erdöl und Erdgas hergestellt.
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Die chemische Synthese von Methionin aus Erdöl und Erdgas ist nicht nachhaltig und muss durch Prozesse, die nachwachsende Rohstoffe nutzen, ersetzt werden. Die mikrobielle Synthese von Threonin und Methionin aus Zuckern ist deutlich nachhaltiger. Allerdings konkurrieren diese Prozesse mit der Herstellung von Nahrungsmitteln.
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In der Druckschrift FRAZÃO, Claudio J. R. [u. a.]: Rational engineering of a malate dehydrogenase for microbial production of 2,4-dihydroxybutyric acid via homoserine pathway. In: Biochemical Journal, Bd. 475, 2018, H.23, S 3887-3901. - ISSN 1470-8728 (E); 0264-6021 (P). DOI: 10.1042/BCJ20180765, sind vier bekannte Synthesewege für die Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat ausgehend von Glucose oder Xylose aufgeführt.
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Aus der Druckschrift Walther, T.; Topham, C. M.; Irague, R.; Auriol, C.; Baylac, A.; Cordier, H.; Dressaire, C.; Lozano-Huguet, L.; Tarrat, N.; Martineau, N.; Stodel, M.; Malbert, Y.; Maestracci, M.; Huet, R.; Andre, I.; Remaud-Simeon, M.; François, J. M.: Construction of a synthetic metabolic pathway for biosynthesis of the non-natural methionine precursor 2,4-dihydroxybutyric acid. In: Nature Communications, 2017, 8, Article number: 15828, S. 1-12, ist eine Methode zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat aus Malat bekannt, dessen Synthese sich am natürlichen Homoserin-Stoffwechselweg orientiert.
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In der
WO 2019/ 013 573 A2 ist die Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat oder Hydroxy-gamma-butyrolaceton mittels eines Mikroorganismus ausgehend von Glukose als Kohlenstoffquelle beschrieben.
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Die
WO 2016/ 162 712 A1 beschreibt einen genetisch modifizierten Mikroorganismus für die Produktion von 2, 4-Dihydroxybutyrat über die Umwandlung von Xylose in 1,2,4-Butantriol und die anschließende Oxidation zu 2,4-Dihydroxybutanal.
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Eine weitere Methode zur Herstellung von 2, 4-Dihydroxybutyrat ist aus der
WO 2014/ 009 435 A1 bekannt, wobei ausgehend von Homoserin die primäre Aminogruppe in eine Carbonylgruppe umgewandelt und anschließend das 2-Oxo-4-Hydroxybutyrat zu 2, 4-Dihydroxybutyrat reduziert wird.
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In der
WO 2013/ 160 762 A2 ist eine Methode für die Herstellung von 2, 4-Dihydroxybutyrat beschrieben, wobei als Ausgangsstoffe neben Malat Succinyl-CoA und/oder Glyoxylat verwendet werden können.
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Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, welches den Weg für eine nachhaltige Methode zur Herstellung der Aminosäuren Methionin und Threonin eröffnet.
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Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
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Die Lösung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat oder von L-Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges, der zumindest folgende Schritte umfasst:
- ➢ einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Glykolaldehyd zu Threose unter Nutzung einer Threose-Aldolase,
- ➢ einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threose zu Threono-1,4-Lacton unter Anwendung einer Threose-Dehydrogenase,
- ➢ einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threono-1,4-Lacton in Threonat unter Nutzung einer Threono-1,4-Lactonase und
- ➢ einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von Threonat in 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) unter Nutzung einer Threonat-Dehydratase,
wobei der Stoffwechselweg ferner einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von OHB zu 2,4-Dihydroxybutyrat unter Nutzung einer OHB-Reduktase oder einen Schritt der enzymatischen Umwandlung von OHB in L-Homoserin unter Nutzung einer L-Homoserin-Transaminase, gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von L-Homoserin in O-Phospho-L-Homoserin unter Nutzung einer Homoserin-Kinase unter ATP-Verbauch und einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-Homoserin zu L-Threonin unter Nutzung einer L-Threonin-Synthase, umfasst, und wobei der Stoffwechselweg in einem mikrobiellen Produktionsstamm exprimiert wird, der zuvor gegenüber seiner natürlichen Form (Wildtyp) modifiziert wird, indem mindestens eines der für die Expression der genannten Enzyme notwendigen Gene in den Produktionsstamm auf geeignete Weise eingebracht wird. Gemäß der Konzeption der Erfindung verläuft der Stoffwechselweg über Glykolaldehyd, welches über verschiedene Wege erhältlich ist. So kann Glykolaldehyd durch einen synthetischen Stoffwechselweg aus Xylose bereitgestellt werden, wie bei Cam et al./2016/ACS Synth Biol/5/607-618, beschrieben ist. Darüber hinaus ist Glykolaldehyd aber auch aus Ethylenglycol darstellbar. Dieses kann wiederum leicht aus Synthesegas gewonnen werden, was ebenso Stand der Technik ist wie die Gewinnung von Synthesegas aus CO2-Emissionen. Zudem ist Ethylenglycol auch über die chemische Hydrogenolyse von Zuckern erhältlich, wie durch Zheng et al./2017/ACS Catal/7/1939-1954, beschrieben wurde. Die Hydrogenolyse von Zuckern zu Ethylenglycol ist eine innovative Methode zum chemischen Aufschluss von pflanzlichen Abfällen, die potenziell effizienter sein kann als herkömmliche Säure- oder Enzym-basierte Aufschlussmethoden. Nicht zuletzt ist Ethylenglycol ein Hauptbestandteil des Kunststoffs Polyethylenterephthalat (PET), so dass das erfindungsgemäße Verfahren auch einen Weg zur stofflichen Verwertung von Plastikabfällen eröffnet.
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Gemäß der Konzeption der Erfindung wurde ein Stoffwechselweg entwickelt, der die Kohlenstoff-konservierende Umwandlung von Glykolaldehyd, welches wiederum leicht aus Ethylenglycol erhältlich ist, zu L-Threonin oder HMTB ermöglicht.
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Ein weiterer wesentlicher Vorteil besteht darin, dass nur wenig Nebenprodukte bei der Ethylenglycol-basierten Herstellung entstehen. Dies ist aufgrund der besseren Trennung des zur Herstellung genutzten Stoffwechselweges vom natürlichen Metabolismus zu erwarten. Durch das Vorkommen von wenigen Nebenprodukten bei Ethylenglycol-basierten Prozessen kann sich die Aufreinigung der resultierenden Wertstoffe Threonin und DHB relativ einfach gestalten.
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In der Erfindung kann ein Stoffwechselweg realisiert werden, den es in dieser Form in der Natur nicht gibt. Dieser Stoffwechselweg basiert zum Teil auf enzymatischen Aktivitäten, die bisher nicht bekannt waren. Überraschenderweise konnten diese zwei unbekannten Enzymaktivitäten durch Screenings gefunden werden. Darüber hinaus konnten die neu gefundenen Enzymaktivitäten zusammen mit bereits bekannten Aktivitäten aus verschiedenen anderen Mikroorganismen gemeinsam in einem einzigen Produktionsstamm exprimiert werden. Mithin wurde eine bisher unbekannte Reaktionsabfolge beziehungsweise ein bisher unbekannter Stoffwechselweg konstruiert. Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist der Produktionsstamm in seiner natürlichen Form bereits ein oder mehrere für den Stoffwechselweg erforderliche Enzyme auf. Als Produktionsstamm kann vorteilhaft ein Stamm der Art Escherichia coli verwendet werden, bevorzugt E. coli ΔyqhD ΔaldA. Dieser Stamm eignet sich in vorteilhafter Weise als Produktionsstamm, weil er eine Inaktivierung der Enzyme Aldehyd-Dehydrogenase (AldA) und Glykolaldehydreduktase (YqhD) aufweist, welche mit der Umwandlung von Glykolaldehyd zu D-Threose konkurrieren. Des Weiteren eignet sich auch ein Stamm der Art Pseudomonas putida, zumal Stämme dieser Art eine sehr geeignete Ethylenglycol-Dehydrogenase besitzen.
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In einer Ausführungsform der Erfindung wird Glykolaldehyd unter Nutzung einer D-Threose-Aldolase zu D-Threose umgewandelt. Entsprechend wird dann D-Threose unter Anwendung einer D-Threose-Dehydrogenase zu D-Threono-1,4-Lacton enzymatisch umgewandelt. Es folgt ein Schritt der enzymatischen Umwandlung von D-Threono-1,4-Lacton in D-Threonat unter Nutzung einer D-Threono-1,4-Lactonase. In nächsten Schritt erfolgt in dieser Ausführungsform die enzymatische Umwandlung von D-Threonat in 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) unter Nutzung einer D-Threonat-Dehydratase.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für die Expression der D-Threose-Dehydrogenase im Produktionsstamm die das Enzym D-Threo-Aldose-1-Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH) und/oder aus Xanthomonas campestris (Xc.Fdh) in das Genom des Produktionsstamms eingebracht. Ebenso kann für die Bereitstellung der D-Threose-Dehydrogenase im Produktionsstamm auch eine das Enzym D-Arabinose-Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Saccharomyces cerevisiae (Sc.Ara1) oder aus Acidovorax avenae (Aa.TadH) oder eine das Enzym L-Fucose-Dehydrogenase exprimierende genetische Information aus Burkholderia Multivorans (Bm.Fdh) in das Genom des Produktionsstammes eingebracht werden. So kann die D-Threose-Dehydrogenase durch eine der Aminosäuresequenzen SEQ-ID-Nr. 89, SEQ-ID-Nr. 93, SEQ-ID-Nr. 99, SEQ-ID-Nr. 101 und SEQ-ID-Nr. 107 dargestellt werden.
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Die Expression der D-Threonat-Dehydratase im Produktionsstamm kann vorteilhafterweise dadurch realisiert werden, dass die das Enzym D-Arabinonat-Dehydratase exprimierende genetische Information aus Acidovorax avenae (Aa.AraD) und/oder Herbaspirillum huttiense (Hh.AraD) und/oder Paraburkholderia mimosarum (Pm.AraD) und/oder die der optimierten Mutante Hh.AraD C434S in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird.
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Folgende Aminosäuresequenzen können die D-Threonat-Dehydratase somit repräsentieren: SEQ-ID-Nr. 127, SEQ-ID-Nr. 129, SEQ-ID-Nr. 131 und SEQ-ID-Nr. 135.
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Für die Expression der D-Threose-Aldolase im Produktionsstamm wird vorzugsweise die das Enzym D-Fruktose-6-Phosphat-Aldolase exprimierende genetische Information aus Escherichia coli (Ec.FsaA), und/oder die genetische Information der mutierten Variante Ec.FsaA L107Y:A129G (Ec.FsaATA) in das Genom des Produktionsstamms eingebracht. Somit kann die D-Threose-Aldolase durch eine der Aminosäuresequenzen SEQ-ID-Nr. 85 oder SEQ-ID-Nr. 87 dargestellt werden.
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Für die Expression der Threono-1,4-Lactonase im Produktionsstamm kann die das Enzym Gluconolactonase exprimierende genetische Information aus Thermogutta terrifontis (Tt.Lac11) und/oder, besonders bevorzugt, die genetische Information einer verkürzten Variante dieses Enzyms (Tt.Lac11v1), die zu einer erheblichen Verbesserung der Expression führt, in das Genom des Produktionsstamms eingebracht werden. Daher kann die Threono-1,4-Lactonase durch eine der Aminosäuresequenzen SEQ-ID-Nr. 109 und SEQ-ID-Nr. 111 dargestellt werden.
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Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich zu den Enzymen des jeweiligen Stoffwechselweges ein Threonat-importierendes Enzym im Produktionsstamm exprimiert. Dies kann zum Beispiel dadurch realisiert werden, dass die D-Threonat-importierende Permease exprimierende genetische Information aus Cupriavidus necator (Re.kdgT) in das Genom des Produktionsstamms eingebracht wird. Daher kann das Threonat-importierende Enzym beispielsweise durch die Aminosäuresequenz SEQ-ID-Nr. 141 repräsentiert werden.
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Alternativ kann auch, ausgehend vom Glykolaldehyd, eine Umwandlung des Glykolaldehyds statt zu D-Threose zu L-Threose erfolgen. Dafür können Aktivitäten von Aldolasen genutzt werden, die ausgewählt sind aus Enzymen der bekannten Enzymklassen D-Threonin-Aldolase (Enzymklasse 4.1.2.42), L-Allo-Threonin-Aldolase (4.1.2.49), L-Threonin-Aldolase (4.1.2.5), 4-Hydroxy-2-Oxoglutarat-Aldolase (4.1.3.16) und 2-Dehydro-3-Deoxy-D-Pentonat-Aldolase (4.1.2.28). Alle weiteren Etappen des oben beschriebenen Stoffwechselweges bis zum 2-Keto-4-Hydroxybutyrat sind analog mit der L-Form möglich. So konnte bereits bei Kim, Suk Min, Hyun Seung Lim, and Sun Bok Lee. „Discovery of a RuBisCO-like Protein that Functions as an Oxygenase in the Novel D-Hamamelose Pathway." Biotechnology and bioprocess engineering 23.5 (2018): 490-499, mit Hamamelose-Dehydrogenase aus Ochrobactrum anthropi (Oa.HamH) L-Threose-Dehydrogenase-Aktivität demonstriert werden. Ein Lactonase-Enzyme mit Aktivität auf L-Threono-1,4-Lacton ist beispielsweise bei Westlake, A. „Thermostable Enzymes Important For Industrial Biotechnology." (2019), beschrieben. Dort zeigte Gluconolactonase aus Thermogutta terrifontis (Tt.Ara11) eine entsprechende Aktivität. Dehydratase-Enzyme mit Aktivität auf L-Threonat sind bekannt, zum Beispiel Dihydroxysäure-Dehydratase aus Sulfolobus solfataricus, wie in der Druckschrift Kim, S.; Lee, S. B. Catalytic Promiscuity in Dihydroxy-Acid Dehydratase from the Thermoacidophilic Archaeon Sulfolobus Solfataricus. J. Biochem. 2006, 139 (3), 591-596, beschrieben.
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Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung umfassen die oben genannten Verfahren mindestens einen weiteren, vorgelagerten Schritt zur mikrobiellen Herstellung von Glykolaldehyd, beispielsweise aus Ethylenglycol, Methanol oder Xylose. Glykolaldehyd kann dabei aus Ethylenglycol über einen Stoffwechselweg abgeleitet werden, welcher für die Umwandlung von Ethylenglycol entweder die Enzymaktivitäten der Pyrrolochinolinchinon (PQQ)-abhängigen Ethylenglycol-Dehydrogenase (Membran-gebunden), berichtet von Mückschel, B.; Simon, O.; Klebensberger, J.; Graf, N.; Rosche, B.; Altenbuchner, J.; Pfannstiel, J.; Huber, A.; Hauer, B. Ethylene Glycol Metabolism by Pseudomonas Putida. Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78 (24), 8531-8539, oder der NAD(P)-abhängigen Ethylenglycol-Dehydrogenase (zytosolisch), bekannt aus Lu, Z.; Cabiscol, E.; Obradors, N.; Tamarit, J.; Ros, J.; Aguilar, J.; Lin, E. C. Evolution of an Escherichia Coli Protein with Increased Resistance to Oxidative Stress. J. Biol. Chem. 1998, 273 (14), 8308-8316, und Zhang, X.; Zhang, B.; Lin, J.; Wei, D. Oxidation of Ethylene Glycol to Glycolaldehyde Using a Highly Selectivealcohol Dehydrogenase from Gluconobacter Oxydans. J. Mol. Catalysis B 2015, 112, 69-75, nutzt. Glykolaldehyd kann auch aus Methanol über einen Stoffwechselweg abgeleitet abgeleitet werden, welcher nacheinander die Enzymaktivitäten der Methanoldehydrogenase für die Umwandlung von Methanol in Formaldehyd und der Glykolaldehyd-Synthase für die Umwandlung von Formaldehyd in Glykolaldehyd nutzt, wie in der Druckschrift Lu, X.; Liu, Y.; Yang, Y.; Wang, S.; Wang, Q.; Wang, X.; Yan, Z.; Cheng, J.; Liu, C.; Yang, X.; et al. Constructing a Synthetic Pathway for Acetyl-Coenzyme A from One-Carbon through Enzyme Design. Nat Commun 2019, 10 (1), 1378, beschrieben.
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Glykolaldehyd kann auch über einen mehrstufigen Stoffwechselweg aus Xylose abgeleitet werden, welcher nacheinander die Enzymaktivitäten der Xylose-Isomerase für die Umwandlung von D-Xylose in D-Xylulose, der Xylulose-1-Kinase für die Umwandlung von D-Xylulose in D-Xylulose-1 P und der Xylulose-1P-Aldolase für die Umwandlung von Xylose-1 P-Aldolase in Glykolaldehyd nutzt, bekannt aus Cam et al./2016/ACS Synth Biol/5/607-61.
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Ein Vorteil der Verwendung von Methanol besteht darin, dass es, ebenso wie Ethylenglycol, leicht aus Synthesegas abgeleitet werden kann. Die Biosynthese von Threonin oder HMTB über DHB aus Ethylenglycol kann daher mit Recht als besonders nachhaltige Herstellungsweise bezeichnet werden.
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Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile von Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Figuren und der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen. Es zeigen die
- 1: eine schematische Darstellung Entwurf eines fünfstufigen Stoffwechselweges zur Umwandlung von Glykolaldehyd zu DHB,
- 2: ein Säulendiagramm mit den Ergebnissen des Screenings von Kandidaten-Enzymen für NAD(P)-abhängige D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität,
- 3: ein Säulendiagramm mit den Ergebnissen des Screenings von Kandidaten-Enzymen für D-Threonat-Dehydratase-Aktivität und
- 4: ein Diagramm zur Darstellung des Wachstumsverlaufs von E. coli-Stämmen, die verschiedene Ethylenglycol-Dehydrogenasen exprimieren.
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In der 1 sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) oder L-Threonin aus Glykolaldehyd unter Nutzung von mikrobiellen Stoffwechselwegen schematisch dargestellt, wobei all diesen mikrobiellen Stoffwechselwegen die vier nacheinander ablaufenden und durch Threose-Aldolase, Threose-Dehydrogenase, Threono-1,4-Lactonase und Threonat-Dehydratase katalysierten Reaktionsstufen gemeinsam sind.
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Der Stoffwechselweg wird in einem mikrobiellen Produktionsstamm, vorzugsweise der Art E. coli, exprimiert, der zuvor gegenüber seiner natürlichen Form (Wildtyp) modifiziert wird, indem mindestens eines der für die Expression der genannten Enzyme notwendigen Gene in den Produktionsstamm eingebracht wird.
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Im Falle der Herstellung von L-2,4-Dihydroxybutyrat können zwei Moleküle von Glykolaldehyd durch die oben genannten vier nacheinander ablaufenden Reaktionsstufen zu 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) und durch eine anschließende fünfte Reaktionsstufe schließlich ohne Kohlenstoffverlust in L-2,4-Dihydroxybutyrat (DHB) umgewandelt werden.
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Im Falle der Herstellung von L-Threonin wird Glykolaldehyd durch diese vier nacheinander ablaufenden Reaktionsstufen zunächst zu 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) umgewandelt, gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von 2-Keto-4-Hydroxybutyrat in L-Homoserin, von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von L-Homoserin in O-Phospho-L-Homoserin (O-P-L-Homoserin) und einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-L-Homoserin zu L-Threonin.
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Beide Stoffwechselwege sind mit der Nutzung von Ethylenglycol, Methanol oder D-Xylose als Ausgangsstoffe vereinbar. Glykolaldehyd-produzierende Reaktionen sind in 1 als gestrichelte Pfeile gezeigt. Die unterschiedlichen Enzyme beziehungsweise Enzymaktivitäten der Stoffwechselwege sind in 1 durch römische Ziffern gekennzeichnet.
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Glykolaldehyd kann über einen mehrstufigen Stoffwechselweg aus Xylose abgeleitet werden, welcher nacheinander die Enzymaktivitäten der Xylose-Isomerase (I) für die Umwandlung von D-Xylose in D-Xylulose, der Xylulose-1-Kinase (II) für die Umwandlung von D-Xylulose in D-Xylulose-1 P und der Xylulose-1 P-Aldolase (III) für die Umwandlung von D-Xylulose-1 P in Glykolaldehyd nutzt.
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Glykolaldehyd kann aus Ethylenglycol über einen Stoffwechselweg abgeleitet werden, welcher für die Umwandlung von Ethylenglycol entweder die Enzymaktivitäten der PQQ-abhängigen Ethylenglycol-Dehydrogenase (Membran-gebunden) (IV) oder der NAD(P)-abhängigen Ethylenglycol-Dehydrogenase (zytosolisch) (V) nutzt.
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Glykolaldehyd kann aus Methanol über einen Stoffwechselweg abgeleitet werden, welcher nacheinander die Enzymaktivitäten der Methanoldehydrogenase (VI) für die Umwandlung von Methanol in Formaldehyd und der Glykolaldehyd-Synthase (VII) für die Umwandlung von Formaldehyd in Glykolaldehyd nutzt.
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Die Herstellung des Stoffwechselproduktes DHB aus Glykolaldehyd in Escherchia coli war möglich durch den Entwurf eines Stoffwechselweges mit fünf aufeinanderfolgenden Reaktionsstufen, die durch die Enzymaktivitäten von D-Threose-Aldolase (VIII), D-Threose-Dehydrogenase (IX), D-Threono-1,4-Lactonase (X), D-Threonat-Dehydratase (XI) und OHB-Reduktase (XV) katalysiert werden. In der ersten Stufe werden zwei Moleküle von Glykolaldehyd (GA) zu einem Molekül D-Threose verbunden. Der resultierende Vier-Kohlenstoff-Zucker wird dann durch eine D-Threose-Dehydrogenase (IX) zu D-Threono-1,4-Lacton oxidiert, welches in einer durch eine D-Threono-1,4-Lactonase (X) katalysierten Reaktion zur entsprechenden Zuckersäure beziehungsweise D-Threonat umgewandelt wird. In den letzten zwei enzymatischen Schritten wird D-Threonat durch eine D-Threonat-Dehydratase (XI) zu OHB dehydriert, welches letztlich in einer durch OHB-Reduktase (XV) katalysierten Reaktion zu DHB reduziert wird.
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Bei der Herstellung von L-Threonin wird Glykolaldehyd durch die genannten vier nacheinander ablaufenden Reaktionsstufen zunächst zu 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB) umgewandelt, gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von 2-Keto-4-Hydroxybutyrat in L-Homoserin unter Nutzung einer L-Homoserin-Transaminase (XII), gefolgt von einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von L-Homoserin in O-Phospho-L-Homoserin unter ATP-Verbrauch und unter Nutzung einer L-Homoserin-Kinase (XIII) und einem Schritt der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-Homoserin zu L-Threonin unter Nutzung einer L-Threonin-Synthase (XIV).
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Von den genannten enzymatischen Aktivitäten waren bereits die meisten bereits bekannt und es konnten die notwendigen Gene, sofern sie nicht im Produktionsstamm bereits enthalten waren, in den Produktionsstamm auf geeignete Weise eingebracht werden, andere mussten jedoch durch Screening identifiziert werden.
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Sowohl D-Threose-Aldolase- als auch OHB-Reduktase-Aktivitäten wurden bereits in der Literatur beschrieben. Insbesondere konnte gemäß der Druckschrift Szekrenyi, A.; Soler, A.; Garrabou, X.; Guerard-Helaine, C.; Parella, T.; Joglar, J.; Lemaire, M.; Bujons, J.; Clapes, P. Engineering the Donor Selectivity of D-Fructose-6-Phosphate Aldolase for Biocatalytic Asymmetrie Cross-Aldol Additions of Glycolaldehyde. Chemistry 2014, 20 (39), 12572-12583, im Falle der D-Fruktose-6-Phosphat-Aldolase aus Escherichia coli (Ec.FsaA) bereits die in vitro Katalyse der reversiblen enzymatischen Homo-Aldoladdition von Glykolaldehyd zu D-Threose gezeigt werden. Darüber hinaus war bekannt, dass die mutierte Variante Ec.FsaA L107Y:A129G (Ec.FsaATA) eine im Vergleich zum Wildtyp um drei Größenordnungen erhöhte Aktivität für die Erzeugung von D-Threose besitzt. Daher konnte dieses mutierte Enzym vorteilhafterweise in dem oben genannten Stoffwechselweg angewendet werden. Darüber hinaus wurde auch die mutierte Malat-Dehydrogenase Ec.Mdh5Q, erhalten durch die Einführung von 5 Punktmutationen in dem L-Malat-Dehydrogenaseenzym von E. coli (Ec.Mdh I12V:R81A:M85Q:D86S:G179D), in der Druckschrift Frazäo, C. J. R.; Topham, C. M.; Malbert, Y.; François, J. M.; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4-Dihydroxybutyric Acid via Homoserine Pathway. Biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901, als hochaktiv beschrieben. Daher konnte dieses Enzym als OHB-Reduktase ausgewählt werden, um den letzten Umwandlungsschritt des DHB-Syntheseweges zu katalysieren.
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Es konnte mittels Hinweisen aus der Literatur auch ein Enzym ermittelt werden, welches unter anderem auch D-Threono-1,4-Lactonaseaktivität aufwies. Westlake, A. Thermostable Enzymes Important For Industrial Biotechnology. Datum: 10 June 2019, berichtete, dass die Gluconolactonase aus Thermogutta terrifontis, hier abgekürzt als Tt. Lac11, auf einer großen Vielzahl von Laktonen aktiv ist. Die Enzyme wurden auch als aktiv auf D-Threono-1,4-Lacton beschrieben, wenngleich nur von einer niedrigen Reaktionsgeschwindigkeit berichtet wurde. Die kinetischen Eigenschaften wurden durch die Erfinder neu analysiert und es wurden dabei überraschenderweise vergleichbare katalytische Aktivitäten sowohl für das natürliche Substrat L-Fucono-1,4-Lacton als auch für D-Threono-1,4-Lacton ermittelt. Da das Enzym eine hohe Affinität zum D-Threono-1,4-Lacton (Km = 2,92 mM) aufweist, ist es für den erfindungsgemäß angewendeten Stoffwechselweg geeignet.
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Es sind mehrere Enzyme bekannt, die eine NAD-abhängige Oxidation von Ethylenglycol zu Glykolaldehyd katalysieren. Dazu gehören die 1,2-Propandioldehydrogenase aus E. coli (Ec.FucO), siehe Boronat, A.; Caballero, E.; Aguilar, J. Experimental Evolution of a Metabolie Pathway for Ethylene Glycol Utilization by Escherichia Coli. J. Bacteriol. 1983, 153 (1), 134-139, sowie die Alcoholdehydrogenase GOX0313 aus Gluconobacter oxidans (Go.Adh), siehe Zhang, X.; Zhang, B.; Lin, J.; Wei, D. Oxidation of Ethylene Glycol to Glycolaldehyde Using a Highly Selectivealcohol Dehydrogenase from Gluconobacter Oxydans. J. Mol. Catalysis B 2015, 112, 69-75. Weiterhin ist bekannt, dass durch die Mutation der Ec.FucO in den Positionen IIe6Leu und Leu7Val eine höhere Sauerstoffresistenz des resultierenden Enzyms (Ec.FucO I6L:L7V) erreicht werden kann, sieheLu, Z.; Cabiscol, E.; Obradors, N.; Tamarit, J.; Ros, J.; Aguilar, J.; Lin, E. C. Evolution of an Escherichia Coli Protein with Increased Resistance to Oxidative Stress. J. Biol. Chem. 1998, 273 (14), 8308-8316. Das resultierende Enzym ist auch unter der Bezeichnung Ec.FucOOR bekannt, wobei OR die Abkürzung für sauerstoffresistent (engl. „oxygen resistant“) ist.
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Als Enzyme mit L-Homoserin-Transaminase-Aktivität für den Schritt (XII) der enzymatischen Umwandlung von 2-Keto-4-Hydroxybutyrat in L-Homoserin sind Aspartat-Aminotransferase aus E. coli (Ec.AspC) und Glutamat-Pyruvat-Aminotransferase der mutierten Variante Ec.AlaC A142P:Y275D, siehe Bouzon, M.; Perret, A.; Loreau, O.; Delmas, V.; Perchat, N.; Weissenbach, J.; Taran, F.; Marliere, P. A Synthetic Alternative to Canonical One-Carbon Metabolism. ACS Synth Biol 2017, 6 (8), 1520-1533, bekannt. Enzyme mit L-Homoserin-Kinase-Aktivität für den Schritt (XIII) der Umwandlung von L-Homoserin in O-Phospho-L-Homoserin sind ebenfalls bekannt, insbesondere Homoserin-Kinase aus E. coli (EcThrB). Threonin-Synthase aus E. coli (Ec.ThrC) weist L-Threonin-Synthase-Aktivität für den Schritt (XIV) der enzymatischen Umwandlung von O-Phospho-L-Homoserin zu L-Threonin auf.
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Von den oben genannten und in 1 dargestellten Enzymaktivitäten des schematisch dargestellten Stoffwechselweges waren solche mit D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität (IX) und D-Threonat-Dehydratase-Aktivität (XI) bisher noch nicht beschrieben worden. Durch Screening einer Auswahl an Kandidaten-Enzymen konnten aber derartige Aktivitäten identifiziert werden.
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Zu den verwendeten Materialien und Methoden ist Folgendes zu bemerken: Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden von der Firma Sigma-Aldrich erworben, soweit keine anderen Firmen genannt sind. Die Restriktionsendonukleasen und die DNA-modifizierenden Enzyme wurden von der Firma New England Biolabs (NEB) erworben und entsprechend der Herstelleranweisungen angewendet. Die DNA-Plasmid-Isolation wurde mittels Monarch®-Plasmid-Miniprep-Kit der Firma NEB durchgeführt. Die DNA-Extraktion aus dem Agarose-Gel und die Reinigung des Produkts der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einer Methode, um Erbsubstanz (DNA) in vitro zu vervielfältigen, erfolgte mittels Monarch®-DNA-Gel-Extraktions-Kit der Firma NEB. Eine DNA-Sequenzierung wurde durch die Firma Eurofins SAS (Ebersberg, Deutschland) durchgeführt.
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Alle Plasmide und Wirtsstämme, die konstruiert wurden und für die Untersuchungen eingesetzt wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Primer sind in Tabelle 2 aufgelistet. Tabelle 1: Verwendete Stämme und Plasmide
Name | Beschreibung | Herkunft |
des Stammes | Genotyp | |
DH5α | E. coli fhuA2 A(argF-lacZ)Ul69 phoA glnV44 ϕ80 Δ(IacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17 | NEB |
BL21 (DE3) | E. coli fhuA2 [Ion] ompT gal (λ DE3) [dcm] ΔhsdS λ DE3 = λ sBamHlo ΔEcoRI-B int::(lacl::PlaeUV5::T7 gene1) i21 Δnin5) | NEB |
MG1655 | E. coli F - λ - ilvG- rfb-50 rph-1 | ATCC® 47076™ |
TW63 | MG1655 ΔyqhD | JMF |
TW64 | MG1655 ΔyqhD ΔaIdA | JMF |
TW145 | TW64 / pEXT20-Ec.fsaATA | konstruiert |
TW146 | TW64 / pEXT20-Ec.fsaATA-Pc.tadH | konstruiert |
TW253 | TW64 / pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH | konstruiert |
TW334 | TW64 / pEXT22 / pEXT21 | konstruiert |
TW336 | TW64 / pEXT22 / pEXT21-Re.kdgT | konstruiert |
TW335 | TW64/pEXT22-Ec.mdh5Q / pEXT21-Re.kdgT | konstruiert |
TW338 | TW64/pEXT22-Ec.mdh5Q-Aa.araD/ pEXT21-Re.kdgT | konstruiert |
TW339 | TW64/pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD/ pEXT21-Re.kdgT | konstruiert |
TW337 | TW64/pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD/ pEXT21 | konstruiert |
TW288 | TW253 / pEXT22 | konstruiert |
TW290 | TW253 / pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | konstruiert |
TW293 | TW64 | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH- Tt.lac11 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | |
TW304 | TW64 | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH- Tt.lac11 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
TW354 | TW64 | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
TW363 | TW64 | konstruiert |
| pACT3-Go.adh-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
TW444 | TW64 + | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Aa.tadH-Tt.lac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
TW445 | TW64 + | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Xc.Fdh-Tt.lac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
TW446 | TW64 + | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Ppi.TadH-Tt.iac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
TW452 | TW64 + | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Ppi.TadH-Tt.lac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araDC434S | |
TW453 | TW64 + | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Ppi.TadH-Tt.lac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Ca.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
TW454 | TW64 + | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Ppi.TadH-Tt.lac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Pm.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
TW559 | TW64 + | konstruiert |
| pACT3-Ec.fsaATA-Tt.lac11v1 | |
| pEXT22-Ec.mdh5Q-Pm.araD | |
| pEXT21-Re.kdgT | |
des Plasmids | relevante Eigenschaft | |
pET28a(+) | KanR, f1 ori ; IPTG-induzierbarer Promoter T7 | Novagen™ |
pEXT22 | KanR, R100 ori; IPTG-induzierbarer tac-Promoter | (Dykxhoorn et al, 1996) |
pACT3 | ChmR; p15Aori; IPTG-induzierbarer tac-Promoter | (Dykxhoorn et al, 1996) |
pEXT20 | AmpR; colE1 ori; IPTG-induzierbarer tac-Promoter | (Dykxhoorn et al, 1996) |
pEXT20-Ec.fsaA | pEXT20-Derivat, welches Ec.fsaA trägt | konstruiert |
pEXT20-Ec.fsaATA | pEXT20-Derivat, welches Ec.fsaA L107Y:A129G trägt | konstruiert |
pEXT20-Ec.fsaATA-Pc.tadH | pEXT20-Derivat, welches Ec.fsaA L107Y:A129G , Pc.tadH (codonoptimiert) trägt | konstruiert |
pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH | pACT3-Derivat, welches Ec.fsaA L107Y:A129G , Pc.tadH (codonoptimiert)) trägt | konstruiert |
pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11 | pACT3-Derivat, welches Ec.fsaA L107YA129G , Pc.tadH (codonoptimiert); Tt-lac11 (codonoptimiert) trägt | konstruiert |
pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11v1 | pACT3-Derivat, welches Ec.fsa4 L107Y:A129G , Pc.tadH (codonoptimiert); Tt-lac11 (codonoptimiert; Δ1-38 aa) trägt | konstruiert |
pACT3-Go.adh-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac1v1 | pACT3-Derivat, welches Ec.fsaA L107Y:A129G , Pc.tadH (codonoptimiert); Tt-lac11 (codonoptimiert; Δ1-38 aa) trägt | konstruiert |
pEXT22-Ec.mdh5Q | pEXT22-Derivat, welches Ec.mdh 5Q (=Ec.mdh l12V:R81A:M85Q:D86S:G179D ) trägt | konstruiert |
pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD | pEXT22-Derivat, welches Ec.mdh 5Q , Hh.araD (= Hh.e2k99_19880) trägt | konstruiert |
pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araDC434S | pEXT22-Derivat, welches Ec.mdh 5Q und die Cys434Ser Mutante der Hh.araD (= Hh.e2k99_19880) trägt | konstruiert |
pEXT22-Ec.mdh5Q-Ca.araD | pEXT22-Derivat, welches Ec.mdh 5Q , Ca.araD trägt | konstruiert |
pEXT22-Ec.mdh5Q-Pm.araD | pEXT22-Derivat, welches Ec.mdh 5Q , Pm.araD trägt | konstruiert |
pEXT22-Ec.mdh5Q-Aa.araD | pEXT22-Derivat, welches Ec.mdh 5Q , Aa.araD (= Aa.acav1654) trägt | konstruiert |
Tabelle 2: Sequenzen der verwendeten Primer
Primer | Sequenz (5'-3') |
222 (fw_xhoi_Ecfuco*) | taagcactcgag gtttaactttaagaaggagatatacc ATGGCTAACAGAA TGCTGGTGA |
| (SEQ-ID-Nr. 1) |
223 (rv_Ecfuco_xbai) | tgcttaTCTAGA TTACCAGGCGGTATGGTAAAGC |
| (SEQ-ID-Nr. 2) |
224 (fw_xhoi_Ecfuco) | taagcactcgag gfffaacfffaagaaggagafafacc atgGCTAACAGAAT GATTCTGA |
| (SEQ-ID-Nr. 3) |
226 (rv_ gox0313 _ xbai) | tgcttaTCTAGA TTAGGACCGGAAGTCGA |
| (SEQ-ID-Nr. 4) |
315 (fw_xhoi_rbs+gox0313) | taagcactcgag gfffaacfffaagaaggagatatacc ATGGCTGATACAA TGCTC |
| (SEQ-ID-Nr. 5) |
209 (fw_xbai_pzs13) | taagcactcgagtgtgtgaaattgttatccg |
| (SEQ-ID-Nr. 6) |
284 (pext20_MCSpos1_fw) | TTCGAGCTCGGTACCC |
| (SEQ-ID-Nr. 7) |
326 (bamhi_fsaATA_fw) | taagcaGGATCC Gtttaactttaagaaggagatatacc ATGGAACTGTA TCTGGATAC TTCAG |
| (SEQ-ID-Nr. 8) |
327 (Rv_Ecfsa_xbai) | tgcttATCTAGA TTAAATCGACGTTCTGCCAAAC |
| (SEQ-ID-Nr. 9) |
328 (fsaATA_swai_rv) | tgcttaATTTAAAT TTAAATCGACGTTCTGCCAAAC |
| (SEQ-ID-Nr. 10) |
303 (Swai_tadH_fw) | taagcaATTTAAAT Gtttaactttaagaaggagatatacc ATGTCTACCG ATAGTTTACAACAG |
| (SEQ-ID-Nr. 11) |
304 (Tadh_xbal_rv) | tgcttaTCTAGA TTATGCCGGAACCGGTG (SEQ-ID-Nr. 12) |
313 (Kpnl_gox0313_f) | taagcaGGTACCgtttaactttaagaaggagatataccATGGCTGATAC AATGCTC |
| (SEQ-ID-Nr. 13) |
314 (BamHI_gox0313_r) | tgcttaGGATCCTTAGGACCGGAAGTCGAG |
| (SEQ-ID-Nr. 14) |
438(xbai_Tt-thte1497opt_fw) | taagcaGGTACC gfffaacfffaagaaggagafafacc ATGCGCAAACT GCTTGGCAG |
| (SEQ-ID-Nr. 15) |
439 (Tt-thte1497opt_sali_rv) | tgcttagtcgaC TTAGAACCCCAGTCCTTTGGTTTTCG |
| (SEQ-ID-Nr. 16) |
305 (Sacl_ecmdh5q_fw) | taagcaGAGCTC Gtttaaetttaagaaggagatatacc ATGAAAGTCG |
| (SEQ-ID-Nr. 17) |
258 (Rv_ecmdh5q_bamhi) | tgcttaGGATCC TTACTTATTAACGAACTCTTCGC |
| (SEQ-ID-Nr. 18) |
551 (bamhi_acav1654_fw) | taagcaGGATCC Gtttaactttaagaaggagatatacc ATGTCGACTGA TGCACTGGC |
| (SEQ-ID-Nr. 19) |
552 (Rv_acav1654_xbai) | tgcttaTctagaTCACATCACCGCGCCGAG |
| (SEQ-ID-Nr. 20) |
553 (bamhi_hh-e2k99_fw) | taagcaGGATCC Gtttaactttaagaaggagatatacc ATGAAAGCCAACTCTCCCG |
| (SEQ-ID-Nr. 21) |
554 (Rv_hh-e2k99_xbai) | tgctta Tctaga TCAGGTGTAGACGCCGATG |
| (SEQ-ID-Nr. 22) |
454 (bamhi_kdgt_fw) | taagcaggatcc gtttaaetttaagaaggagatatacc ATGCAGATTTCTATCAAACGCGCCA |
| (SEQ-ID-Nr. 23) |
455 (hindiii_kdgt_rv) | tgcttaAagctt TCATGCGGCGGTCCTCA |
| (SEQ-ID-Nr. 24) |
667 (Swai_aa-tadH_fw) | taagcaATTTAAATGtttaactttaagaaggagatataccATGAAGGTCA CAGAAACACGCC |
| (SEQ-ID-Nr. 25) |
668 (Aa-Tadh_xbal_rv) | tgcttaTCTAGA TCATGGCGCGGCTCCG |
| (SEQ-ID-Nr. 26) |
671 (Swai_Xc-fdH_fw) | taagcaATTTAAATGtttaactttaagaaggagatataccATGAATACAC GTCGCCAATTCCTGTCTG |
| (SEQ-ID-Nr. 27) |
672 (Xc-fdh_xbal_rv) | tgcttaTCTAGA TCATCCAGCCGCCGGCAC |
| (SEQ-ID-Nr. 28) |
716 (Swai_ppi.tadh_fw) | taagcaATTTAAATGtttaactttaagaaggagatataccATGAATCGGC GCACAGG |
| (SEQ-ID-Nr. 29) |
717 (Ppi.tadh_xbal_rv) | tgcttaTCTAGA CTAAACGGGCTCGTGTGT |
| (SEQ-ID-Nr. 30) |
718 (Sdm-hh.e2k99-C434S _fw) | GGTTCTGCCTATGGCAGCGCACCGGCACCGTCG |
| (SEQ-ID-Nr. 31) |
719 (Sdm-hh.e2k99-C434S_rv) | CGACGGTGCCGGTGCGCTGCCATAGGCAGAACC |
| (SEQ-ID-Nr. 32) |
724 (bamhi_Ca.araD_fw) | taagcaGGATCC Gtttaactttaagaaggagatatacc ATGAAAAATGT TATAAAGATAAATGAAAAAGATAATG |
| (SEQ-ID-Nr. 33) |
725 (Rv_Ca.araD _xbai) | tgcttaTctaga TTATAGTGTTACACCGTTTTTAAATATAGATATT |
| TC (SEQ-ID-Nr. 34) |
732 (bamhi_pm.araD_fw) | taagcaGGATCC Gtttaactttaagaaggagatatacc ATGAAGACCTC AACAGCAGAC |
| (SEQ-ID-Nr. 35) |
733 (Rv_ pm.araD _xbai) | tgcttaTctaga TCAGGTGATCGCGCCGATC (SEQ-ID-Nr. 36) |
-
In Tabelle 2 sind in den Primersequenzen die Restriktionsstellen unterstrichen, die Codierungsstart-/stopsequenzen sind fett und die RBS-Sequenzen kursiv gekennzeichnet. Die Plasmide pEXT20-Ec.fucO, pEXT20-Ec.fucO/6L:L7V und pEXT20-Go.adh wurden durch PCR-Amplifizierung des Ec.fucO Wildtyps, Ec.fucOI6L:L7V und des codonoptimierten Go.adh Gens jeweils unter Anwendung der Primerpaare 224/223, 222/223 beziehungsweise 315/226 konstruiert. Genomische DNA von Escherichia coli MG1655 und synthetische Gene dienten jeweils als Template-DNA für von Ec.fucO abgeleitete Gene und Go.gox0313. Alle Primer brachten bestimmte Restriktionsstellen ein, die die jeweiligen Gene flankierten. Zusätzlich brachten die Primer eine Ribosom-Bindungssequenz (RBS) unmittelbar vor der Codierungssequenz ein.
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Das High-Copy-Plasmid pEXT20 wurde unter Anwendung des Primerpaars 209/284 amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden mit Xhol/Xbal-Restriktionsenzymen verdaut und unter Anwendung von T4-DNA-Ligase (Firma NEB) in das Vektorrückgrat ligiert.
-
Die Plasmide pEXT20-Ec.fsaA und pEXT20-Ec.fsaATA wurden durch Amplifizierung des Ec.fsaA-Wildtyps und Ec.fsaAL107Y:A129G-Gene unter Anwendung des Primerpaars 326/327 konstruiert. Die genomische DNA von Escherichia coli MG1655 und synthetische Gene dienten jeweils als Template-DNA. Die resultierenden PCR-Produkte und der pEXT20-Expressionsvektor wurden mit BamHI/Xbal verdaut und ligiert. Das Plasmid Ec.fsaATA-Pc.tadH wurde durch PCR-Amplifizierung von Ec-fsaAL107Y:A129G und des codonoptimierten synthetischen Pc.tadH-Gens jeweils unter Anwendung der Primerpaare 326/328 und 303/304 konstruiert. Die resultierenden PCR-Produkte wurden jeweils mit BamHI/Swal- and Swal/Xbai-Restriktionsenzymen verdaut und in den mit BamHI/Xbal verdauten pEXT20-Vektor ligiert.
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Eine ähnliche Verfahrensweise erfolgte für die Konstruktion von pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH, in welcher jedoch das Medium-Copy-Plasmid pACT3 als Rückgrat diente. Das Plasmid pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11 wurde durch Amplifizierung des codonoptimierten synthetischen Tt.lac11-Gens unter Anwendung des Primerpaars 438/439 konstruiert. Das PCR-Produkt und der pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Vektor wurden dann mit Xbal/Sall-Restriktionsenzymen verdaut und ligiert. Kürzere Versionen von Tt.thte1497op-Genen, bei denen die Signalsequenz für den periplasmatischen Export am N-Terminus (1: 115-1,068 nt; 2: 154-1,068 nt) fehlt, wurden ebenfalls mit PCR amplifiziert.
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Für die Konstruktion der Plasmide pACT3-Ec.fsaATA-Aa.tadH-Tt.lac11v1, pACT3-Ec.fsaATA-Xc.fdh-Tt.lac11v1 und pACT3-Ec.fsaATA-Ppi.tadH-Tt.lac11.v1 die Gene Aa.tadH, Xc.fdh und Ppi.tadH mit Hilfe der Primerpaare 667/668, 671/672 beziehungsweise 716/717 PCR-amplifiziert. Dabei dienten genomische DNAs der Stämme A. avenae DSM7227, X. campestris DSM3586 sowie ein synthetisches Gen für Ppi.tadH als Template. Die resultierenden PCR-Produkte sowie der Vektor pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11v1 wurden mit Swal / Xbal verdaut und anschließend ligiert.
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Für die Konstruktion des Plasmids pACT3-Go.adh-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11v1 wurden die Gene Go.adh, Ec.fsaATA, Pc.tadH und Tt.Iac11v1 mit Hilfe der Primerpaare 313/314, 326/328, 303/304 und 600/439 amplifiziert. Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit Kpnl/BamHI, Bamhl/Swal, Swal/Xbal beziehungsweise Xbal/Sall, verdaut und in den Kpnl/Sall verdauten pACT3-Vector ligiert.
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Das Plasmid pEXT22-Ec.mdh5Q wurde durch PCR-Amplifizierung des OHB-Reduktase codierenden Gens Ec.mdh5Q (synthetisches Gen) unter Anwendung des Primerpaars 305/258 konstruiert. Das resultierende PCR-Produkt und der Low-Copy-Vektor pEXT22 wurden dann mit Sacl/Bamhl verdaut und ligiert.
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Die Plasmide pEXT22-Ec.mdh5Q-Aa.araD und pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD wurden durch Amplifizierung von Aa.araD- and Hh.araD-Genen jeweils unter Anwendung der Primerpaare 551/552 and 553/554 konstruiert. Genomische DNA von Acidovorax avenae DSM7227 und Herbaspirillum huttiense DSM10281 wurden als die jeweiligen Template-DNAs verwendet. Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit BamHI/Xbal verdaut und einzeln in die entsprechenden Stellen im mit BamHI/Xbal verdauten Vektor pEXT22-Ec.mdh5Q ligiert. Das Plasmid pEXT21-Re.kdgT wurde durch Amplifizierung des Re.kdgT-Gens aus der genomischen DNA von Cupriavidus necator H16 DSM428 unter Anwendung des Primerpaars 454/455 konstruiert. Das PCR-Produkt und das pEXT21-Vektor-Rückgrat wurden mit BamHI/Hindlll-Restriktionsenzymen verdaut und ligiert.
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Das Plasmid pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araDC434S wurde durch inverse PCR auf dem Template pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD konstruiert, welche eine Mutation von Cystein zu Serin in Position 434 unter Nutzung des Primerpaars 718/719 erzeugte. Für die Konstruktion der Plasmide pEXT22-Ec.mdh5Q-Ca.araD und pEXT22-Ec.mdh5Q-Pm.araD die Gene Ca.araD und Pm.araD unter Nutzung der Primerpaare 724/725 beziehungsweise 732/733 PCR-amplifiziert. Die genomischen DNAs von Clostridium acetobutylicum DSM1731 und Paraburkholderia mimosarum DSM21841 dienten dabei als Template. Die resultierenden PCR-Produkte und das Plasmid pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD wurden mit BamHI / Xbal verdaut, aufgereinigt und ligiert.
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Alle resultierenden Konstruktionen wurden in chemisch kompetente E. coli-Zellen (DH5α, NEB) überführt und durch DNA-Sequenzierung hinsichtlich des korrekten Einbaus der Zielgene verifiziert. Die Plasmide wurden dann in den jeweils als Produktionsstamm ausgewählten E. coli -Stamm unter Anwendung von Standardverfahren, wie aus Sambrook, J.; Fritsch, E. F.; Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Mol. cloning a Lab. manual. 1989, No. Ed. 2 bekannt, transformiert.
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Im Folgenden werden die enzymatischen Tests beschrieben:
-
Die Proteinkonzentrationen wurden vor den enzymatischen Tests (Assays) durch die Methode von Bradfort (Roti® -Quant, Roth) bestimmt. Soweit nicht anders beschrieben, wurden alle enzymatischen Tests 20 Minuten lang bei 37 °C in 96-Well-Mikrotiterplatten in einem Gesamtvolumen von 250 µL durchgeführt. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Werte für die Michaelis-Konstante (Km) wurden durch Anpassung der kinetischen Daten für mindestens fünf verschiedene Substratkonzentrationen an die Michaelis-Menten-Gleichung ermittelt. Die Anpassung erfolgte durch nicht-lineare Regression in Matlab® R2015a.
-
Aktivitätsbestimmung der Ethylenglycol-Oehydrogenase:
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Die Enzymaktivität wurde in der oxidativen Richtung durch Messung der Reduktion von NAD+ bei 340 nm (ε = 6.22 mM-1 cm-1) während der Oxidation von Ethylenglycol ermittelt. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 100 mM Natriumglycin (pH 9.5), 0.5 mM NAD+ und entsprechende Mengen an gereinigtem Enzym oder vom Proteinrohextrakt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von entsprechenden Konzentrationen an Substrat gestartet. Eine Einheit U der Ethylenglycol-Dehydrogenase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1.0 µmol of NAD+ pro Minute katalysiert.
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Aktivitätsbestimmung der D-Threose-Aldolase:
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Die Enzymaktivität wurde durch Kopplung der Homo-Aldoladdition von Glykolaldehyd mit der NAD-abhängigen Oxidation von D-Threose, katalysiert durch gereinigte D-Threo-Aldose-1-Dehydrogenase aus Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH), bestimmt. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 60 mM 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure (HEPES) mit pH 8, 10 mM NAD+, 100 µg mL-1 Hilfsenzym und geeigneten Mengen an gereinigtem Enzym oder vom Proteinrohextrakt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von entsprechenden Konzentrationen an Substrat gestartet. Eine Einheit U an D-Threose-Aldolase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1.0 µmol von D-Threose pro Minute katalysiert.
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Aktivitätsbestimmung der Zucker-Dehydrogenase:
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Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte in oxidativer Richtung durch die Messung der Reduktion von NAD(P)+ bei 340 nm während der Oxidation von Kandidaten-Zuckern. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 50 mM HEPES (pH 8), 10 mM NAD(P)+ und geeigneten Mengen an gereinigtem Enzym oder vom Proteinrohextrakt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von (D)-Arabinose oder (D)-Threose (Carbosynth, UK) gestartet. Eine Einheit U der Zucker-Dehydrogenase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1,0 µmol Zucker pro Minute katalysiert.
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Aktivitätsbestimmung der Lactonase:
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Die Enzymaktivität erfolgte durch Messung der Konzentration von Protonen, die aus dem Carboxylatprodukt während der Hydrolyse von Lactonen freigesetzt werden, unter Anwendung des colorimetrischen pH-Indikators Bromthymolblau (ε = 1,14 mM-1 cm-1) bei 616 nm. Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 2.5 mM HEPES (pH 7.1), 200 mM NaCl, 1 % (v/v) DMSO, 0.1 mM Bromothymolblau und geeignete Mengen an gereinigtem Enzym. Die Reaktion wurde durch Zugabe von verschiedenen Mengen von (L)-Fucono-1,4-Lacton oder (D)-Threono-1,4-Lacton gestartet. Eine Einheit U der Lactonase-Aktivität wurde als die Enzymmenge definiert, die die Hydrolyse von 1,0 µmol Lacton pro Minute katalysiert.
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Aktivitätsbestimmung der Zuckersäure-Dehydratase:
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Die Enzymaktivität wurde durch Umwandlung des 2-Ketosäure-Reaktionsproduktes zu einem Semicarbazon bestimmt, dessen Konzentration bei 250 nm gemessen wurde. Eine Kalibrationskurve wurde unter Verwendung von Pyruvat als 2-Ketosäure aufgenommen (ε = 2,24 mM-1 cm-1). Das Reaktionsgemisch für die Aktivitätsbestimmung enthielt 60 mM HEPES (pH 7,3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 und geeignete Mengen an gereinigtem Enzym oder Proteinrohextrakt. Die 1-mL- Reaktion wurde durch Zugabe von verschiedenen Zuckersäuren (L-Fuconat, 2R-Dihydroxivalerat, D-Altronat, D-Tartrat, D-Arabinonat or D-Threonat) gestartet und bei 37 °C inkubiert. Aliquote von 200 µl wurden während der Reaktion nach 0, 10, 20 and 40 Minuten entnommen und mit 100 µl 2 M HCl versetzt. Die Proben wurden dann mit 300 µl Semicarbazid-Lösung (10 g*L-1 Semicarbazid-Hydrochlorid und 15 g*L-1 Natriumacetat) ergänzt und bei 30 °C für 10 Minuten inkubiert. Schließlich wurden 500 µL destilliertes Wasser zu dem derivatisierten Produkt hinzugefügt, wobei sofort die Absorption unter Nutzung einer Quarz-Küvette gemessen wurde. Eine Einheit U der Zuckersäure-Dehydratase-Aktivität (U) wurde als die Menge an Enzym definiert, die die Bildung von 1,0 µmol 2-Ketosäure pro Minute katalysiert.
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Aktivitätsbestimmung der D-Threonat-Dehydratase:
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Die Enzymaktivität wurde durch Kopplung der Dehydration von D-Threonat mit der NADH-abhängigen Reduktion von 2-Keto-4-hydroxybutyrat (OHB) durch gereinigte OHB-Reduktase Ec.Mdh5Q, die aus der Druckschrift Frazäo, C. J. R.; Topham, C. M.; Malbert, Y.; François, J. M.; Walther, T. Rational Engineering of a Malate Dehydrogenase for Microbial Production of 2,4-Dihydroxybutyric Acid via Homoserine Pathway. Biochem. J. 2018, 475 (23), 3887-3901 bekannt ist, bestimmt. Das Reaktionsgemisch enthielt 60 mM HEPES (pH 7,3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,25 mM NADH, 100 µg mL-1 Hilfsenzym und geeignete Mengen an gereinigtem Enzym. Die Reaktion wurde durch die Zugabe verschiedener Mengen an Substrat gestartet. Eine Einheit U der D-Threonat-Dehydrataseaktivität wurde als die Menge an Enzym definiert, die die Bildung von 1.0 µmol OHB pro Minute katalysiert.
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Kandidatenenzyme, die hinsichtlich einer D-Threose-Dehydrogenase oder D-Threonat-Dehydratase-Aktivität getestet wurden, sind in der Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3: Getestete Kandidatenenzyme für D-Threose-Dehydrogenase- und D-Threonat-Dehydratase-Aktivität
Enzyme | Herkunft | Funktionsbeschreibung | UniProt Referenz | Codonoptimierung |
|
Kandidatenenzyme für D-Threose-Dehydrogenasen |
Sc.Ara1 | Saccharomyces cerevisiae | NADP-abhängige D-Arabinose-Dehydrogenase | P38115 | Nein |
Sc.Ara2 | Saccharomyces cerevisiae | NAD-abhängige D-Arabinose-1-Dehydrogenase | Q04212 | Nein |
Pc.TadH | Paraburkholderia caryophylli | D- Threo-Aldose-1-Dehydrogenase | A0A1X7DD C2 | Ja |
PI.LgdA | Paracoccus laeviglucosivorans | Scyllo-Inositol-Dehydrogenase | K7ZP76 | Ja |
Ps.Fdh | Pseudomonas sp. 1143 | D-Threo-Aldose-1-Dehydrogenase | Q52472 | Ja |
Xc.Fdh | Xanthomonas campestris | L-Fucose-Dehydrogenase | A0A3E1 KM H9 | Nein |
Aa.TadH | Acidovorax avenae | D- Threo-Aldose-1-Dehydrogenase | F0Q4S3 | Nein |
Ppi.TadH | Paraburkholderia piptadeniae | D-Threo-Aidose-1-Dehydrogenase | A0A1N7S9V 4 | Ja |
Ss.Adh4 | Sulfolobus solfataricus | D-Arabinose-Dehydrogenase | Q97YM2 | Ja |
Bm.Fdh | Burkholderia multivorans | L-Fucose-Dehydrogenase | A0A0H3KN E7 | Nein |
Kandidatenenzyme für D-Threonat-Dehydratasen |
Ec.llvD | Escherichia coli | Dihydroxysäure-Dehydratase | P05791 | Nein |
Ss.llvD | Sulfolobus solfataricus | Dihydroxysäure-Dehydratase | Q97UB2 | Ja |
Xc.FucD | Xanthomonas campestris | L-Fuconat-Dehydratase | Q8P3K2 | Ja |
Pp.FucD | Pseudomonas putida | L-Fuconat-Dehydratase | Q88J18 | Nein |
Bj.TarD | Bradyrhizobium japonicum | D-Tartrat-Dehydratase | Q89FH0 | Nein |
Aa.AraD | Acidovorax avenae | D-Arabinonate-Dehydratase | F0Q4R8 | Nein |
Hh.AraD | Herbaspirillum huttiense | D-Arabinonate-Dehydratase | A0A4P7AD P2 | Nein |
Hh.AraDC434S | Herbaspirillum huttiense | D-Arabinonate-Dehydratase | A0A4P7AD P2 mutiert in Position C434S | Nein |
Ca.AraD | Clostridium acetobutylicum | D-Arabinonate-Dehydratase | Q97L66 | Nein |
Pm.AraD | Paraburkholderia mimosarum | D-Arabinonate-Dehydratase | NCBI acc no. WP_028214 996.1 | Nein |
Ec.UxaA | Escherichia coli | D-Aitronat-Dehydratase | P42604 | Nein |
-
Ebenso ist in Tabelle 3 angegeben, ob eine Codonoptimierung durchgeführt wurde.
-
Im Folgenden werden die Klonierung, Expression und Aufreinigung von Kandidatenenzymen beschrieben:
-
Die entsprechenden kodierenden Gene wurden durch PCR amplifiziert und in die entsprechenden Stellen des Expessionsvektors pET28a (Firma Novagen) unter Anwendung der in Tabelle 4 aufgeführten Klonierungstechniken und Primer-Paare kloniert, wobei ein N-terminaler Hexa-His-Tag an der Zielsequenz angebracht wurde. Die resultierenden Plasmide wurden in kompetente E. coli DH5α Zellen (NEB) transformiert. Die korrekte Insertion wurde durch Isolation der Plasmide und DNA-Sequenzierung verifiziert, bevor die so erhaltenen Plasmide in den Expressionsstamm E. coli BL21 (DE3) (NEB) transformiert wurden. Die Proteine wurden je nach Eignung in 50 mL LB-Medium oder in Autoinduktionsmedium (Studier F.W./2005/Prot Expr Purif/41/207-234/Protein production by auto-induction in high density shaking cultures) exprimiert. Nach einer ausreichenden Inkubationszeit wurden die Zellen durch Zentrifugation, die 15 Minuten lang bei 1700 x g und 4 °C erfolgte, vom Medium getrennt. Die so erhaltenen Zellpellets wurden bei - 20 °C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt. Die Aufreinigung der Enzyme erfolgte durch Aufnahme der Zellpellets in 1 mL HEPES-Puffer (50 mM, pH 7) und anschließender Ultraschallbehandlung in vier Intervallen von je 20 s (UDS 751, Topas GmbH, Leistung 40 %). Zelltrümmer wurden durch 15 min Zentrifugation bei 13000 x g und 4 °C sowie die nachfolgende Überführung des klaren Überstands in ein neues Reaktionsgefäß abgetrennt. Die Zielproteine wurden aus dem so erhaltenen Proteinrohextrakt mit Affinitätschromatographie entsprechend der Herstellerangaben des Kobalt-Resins (Talon) aufgereinigt. Die aufgereinigten Enzyme wurden anschließend hinsichtlich ihrer Aktivität auf dem natürlichen Substrat (Positivkontrolle) und dem Zielsubstrat charakterisiert. Die Proteinreinigung wurden ausgehend von den gefrorenen Zellkügelchen durchgeführt. Tabelle 4: Primersequenzen, Techniken und verwendete Restriktionsschnittstellen für die Klonierung der Zielgene in den pET28-Expressionsvektor
Zielgen | Klonierungstechnik | Flankierende RE | Primer-Sequenzen (5' - 3') a |
Ec.fsaA | PCR-Restriktion | Ndel | | agatatCATATG GAACTGTATCTGGATACTTCAGAC (SEQ-ID-Nr. 37) |
| | | | Ec-FsaA_pET_fw |
| | EcoRI | | agatatGAATTC TTAAATCGACGTTCTGCCAAACGC (SEQ-ID-Nr. 38) |
| | | | Ec-FsaA_pET_rv |
Ec.fsaA TA | PCR-Restriktion | Ndel | | agatatCATATG GAACTGTATCTGGATACTTCAGAC (SEQ-ID-Nr. 37) |
| | | | Ec-FsaA_pET_fw |
| | EcoRI | | agatatGAATTC TTAAATCGACGTTCTGCCAAACGC (SEQ-ID-Nr. 38) |
| | | | Ec-FsaA_pET_rv |
Ee.mdh5Q | PCR-Restriktion | Ndel | | agatatCATATG AAAGTCGCAGTCCT CGGC (SEQ-ID-Nr. 39) |
| | | | Ec-Mdh22_pET_fw |
| | EcoRI | | agatatGAATTC TTACTTATTAACGAACTCTTCGCCCAG
(SEQ-ID-Nr. 40) |
| | | | Ec-Mdh22_pET_rv |
Tt.lac11 (N-tag) | HiFi | Ndel | 470 | ctggtgccgcgcggcagcCATATG CGCAAACTGCTTGGC (SEQ-ID-Nr. 41) |
| | BamHI | 471 | gtcgacggagctcgaattcGGATCC TTAGAACCCCAGTCCTTTGG
(SEQ-ID-Nr. 42) |
Tt.lac11 (C-tag) | HiFi | Ncolb | 570 | actttaagaaggagatataCCATG CGCAAACTGCTTGG (SEQ-ID-Nr. 43) |
| | Hindlll | 572 | ggtgctcgagtgcggccgcAAGCTTGAACCCCAGTCCTTTGGTTTTC
(SEQ-ID-Nr. 44) |
Tt.lac11 v1 (C-tag) | HiFi | Ncol | 571 | actttaagaaggagatataCCATG GAACCGAGTCAGAATCC
(SEQ-ID-Nr. 45) |
| | Hindlll | 572 | ggtgctcgagtgcggccgcAAGCTTGAACCCCAGTCCTTTGGTTTTC
(SEQ-ID-Nr. 44) |
Tt.lac11 v2 | HiFi | Ncol | 573 | actttaagaaggagatataCCATG GAACGCGCAGATC (SEQ-ID-Nr. 46) |
| | Hindlll | 572 | ggtgctcgagtgcggccgcAAGCTTGAACCCCAGTCCTTTGGTTTTC
(SEQ-ID-Nr. 44) |
Tt.lac11 v3 | HiFi | Ncolb | 574 | actttaagaaggagatataCCATG TGGAGCGAAGGTCC (SEQ-ID-Nr. 47) |
(C-tag) | | Hindlll | 572 | ggtgctcgagtgcggccgcAAGCTTGAACCCCAGTCCTTTGGTTTTC
(SEQ-ID-Nr. 44) |
Sc.ara1 | HiFi | Ndel | 153 | CAGCCATATG TCTTCTTCAGTAGCCTCAACCGAAAAC
(SEQ-ID-Nr. 48) |
| | BamHI | 154 | gaattcGGATCC TTAATACTTTAAATTGTCCAAGTTTGG
(SEQ-ID-Nr. 49) |
Sc.ara2 | HiFi | Ndel | 155 | cagcCATATG GTTAATGAAAAAGTGAATCCATTCGAC
(SEQ-ID-Nr. 50) |
| | EcoRI | 156 | agctcGAATTC TTATATCATTTCTGG
(SEQ-ID-Nr. 51) |
Pc.tadH | HiFi | Ndel | 145 | catcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagcCATATG TCTACCGATAGTTTACAACAGTTTC |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 52) |
| | EcoRI | 146 | tgcggccgcaagcttgtcgacggagctcGAAT TC TTATGCCGGAACCGGTGCAC (SEQ-ID-Nr. 53) |
Pl.lgdA | HiFi | Ndel | 147 | catcacagcagcggcctggtgccgcgcggcag cCATATG AGTAATGCCGAAAAAGC AC (SEQ-ID-Nr. 54) |
| | EcoRI | 148 | tgcggccgcaagcttgtcgacggagctcGAATTC TTAAAAATTCACCGGCTG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 55) |
Ps.fdh | HiFi | Ndel | 149 | catcacagcagcggcctggtgccgcgcggcag cCATATG TCTTCTACTGAACCTGC
(SEQ-ID-Nr. 56) |
| | EcoRI | 150 | tgcggccgcaagcttgtcgacggagctcGAAT TC TTACGGGGTCGGAATTAAG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 57) |
Ss.adh4 | HiFi | Ndel | 151 | catcacagcagcggcctggtgccgcgcggcag cCATATG GAGAACGTGAATATGGTG (SEQ-ID-Nr. 58) |
| | EcoRI | 152 | tgcggccgcaagcttgtcgacggagctcGAAT TC TTACGGGGTGATAACTTG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 59) |
Bm.fdh | PCR-Restriktion | Ndel | 468 | gcaggagcCATATG GATCTGAATCTGCAGGACAAGGTCGT |
| | | | (SEQ-ID-Nr.60) |
| | Hindlll | 469 | gcaggagcAAGCTT TCAGACGAGCGCACGATCGAGATGCGTAT |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 61) |
Ec.ilvD | PCR-Restriktion | Nhel | | agatatGCTAGC ATGCCTAAGTACCGTTCCGCC |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 62) |
| | | | Ec-llvD_pET_fw |
| | EcoRI | | agatatGAATTC TTAACCCCCCAGTTTCGATTTATCG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 63) |
| | | | Ec-llvD_pET_rv |
Ss.ilvD | HiFi | Ndel | 180 | catcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagcCATATG CCGGCAAAATTAAA |
| | | (SEQ-ID-Nr. 64) |
| | EcoRI | 181 | tgcggccgcaagcttgtcgacggagctcGAAT TC TTAAGCGGGACGG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 65) |
Xc.fucD | HiFi | Ndel | 182 | catcacagcagcggcctggtgccgcgcggcag cCATATG CGTACCATTAT CGC |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 66) |
| | EcoRI | 183 | tgcggccgcaagcttgtcgacggagctcGAAT TC TTAGGCTTTGGCTT (SEQ-ID-Nr. 67) |
Pp .fucD | HiFi | Ndel | 486 | ctggtgccgcgcggcagcCATATG AACA GTGCCCCCGAC |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 68) |
| | BamHI | 487 | gtcgacggagctcgaattcGGATCC TCAGGAACGGTTGATGTCG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 69) |
Bj.tarD | HiFi | Ndel | 339 | ctggtgccgcgcggcagcCATATG TCCGTCCGCATCGTC |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 70) |
| | BamHI | 340 | gtcgacggagctcgaattcGGATCC TTACTCCGCCAGCGCCTT |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 71) |
Aa.araD | HiFi | Ndel | 498 | ctggtgccgcgcggcagcCATATG TCGACTGATGCACTGGC |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 72) |
| | BamHI | 499 | cggagctcgaattcGGATCC TCACATCACCGCGCCGAG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 73) |
Hh.araD | HiFi | Ndel | 500 | ctggtgccgcgcggcagcCATATG AAAGCCAACTCTCCCG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 74) |
| | BamHI | 501 | cggagctcgaattcCGATCC TCAGGTGTAGACGCCGATG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 75) |
Ec.uxaA | HiFi | Ndel | 482 | ctggtgccgcgcggcagcCATATG CAATACATCAAGATCCATGC |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 76) |
| | BamHI | 483 | gtcgacggagctcgaattcGGATCC TTATAGCGTTACGCCGCTTTTG |
| | | | (SEQ-ID-Nr. 77) |
a Restriktionsstellen sind unterstrichen und die Codonstart/Stop-Sequenzen sind fett gekennzeichnet |
b Restriktionsstellen gehen nach dem Klonierungsprozess verloren |
-
Die Identifizierung von Enzymen mit D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität wurde folgendermaßen durchgeführt:
-
Zur Identifikation von D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität wurden die Enzyme D-Threo-Aldose-1-Dehydrogenase aus Paraburkholderia caryophylli (Pc.TadH), D-Arabinose-Dehydrogenasen aus Saccharomyces cerevisiae, Sc.Ara1 und Sc.Ara2, Scyllo-Inositol-2-Dehydrogenase aus Paracoccus laeviglucosivorans (PI.LgdA), D-Threo-Aldose-1-Dehydrogenase aus Pseudomonas sp. 1143 (Ps.Fdh), D-Arabinose-Dehydrogenase aus Sulfolobus solfataricus (Ss.Adh4) und L-Fucose-Dehydrogenase aus Burkholderia multivorans (Bm.BmulJ04919), hier als Bm.Fdh bezeichnet, aus genomischer DNA unter Nutzung der in Tabelle 4 gelisteten Primer aus genomischer DNA oder ausgehend von synthetischen Genen (siehe Tabelle 3) amplifiziert. Die Klonierung in den Expressionsvektor pET28a erfolgte unter Anwendung der in Tabelle 4 präzisierten Methoden. In Tabelle 4 sind die Restriktionsstellen unterstrichen, die Kodierungsstart-/Stop-Sequenzen sind Fett gekennzeichnet.
-
Die
2 zeigt schematisch die Ergebnisse des Screenings der Kandidaten-Enzymen für NAD(P)-abhängige D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität in Form eines Säulendiagramms. Für das Screening wurden Substratkonzentrationen von 10 mM Co-Faktor und Zucker eingestellt. Bei fehlender Aktivität wurden die Enzyme in
2 mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Die Enzymaktivitäten werden auf einer logarithmischen Skala im Säulendiagramm dargestellt. Die Ergebnisse sind der Mittelwert von mindestens zwei unabhängigen biologischen Experimenten. Die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung vom Mittelwert. Die genauen Werte sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Tabelle 5 zeigt die spezifischen Aktivitäten des N-His-getaggten, als D-Threose-Dehydrogenase in Frage kommenden Enzyms, ausgedrückt in U pro mg des gereinigten Enzyms, welches mit einer fest eingestellten Menge (10 mM) der Substrate, D-Arabinose oder D-Threose, und der Co-Faktoren, NAD
+ oder NADP
+, gemessen wurde. Die Abkürzung „n.d.“ ist gleichbedeutend mit „nicht detektiert“. Tabelle 5: Dehydrogenase-Aktivität von Kandidatenenzymen auf D-Arabinose und D-Threose
Enzyme | D-Arabinose-Dehydrogenase in U*mg -1 | D-Threose-Dehydrogenase in U*mg -1 |
NAD + | NADP + | NAD + | NADP + |
Sc.Ara1 | 0,02 (±0,006) | 0,52 (±0,18) | n.d. | 0,02 (±0,007) |
Sc.Ara2 | 0,018 (±0,025) | 0,12 (±0,05) | n.d. | n.d. |
PI.LgdA | 2,54 (±0,17) | 0,48 (±0,18) | n.d. | n.d. |
Pc.TadH | 4,65 (±0,20) | 0,382 (±0,240) | 0,27 (±0,02) | n.d. |
Bm.Fdh | 0,05 (±0,01 ) | n.d. | 0,06 (±0,005) | n.d. |
Ps.Fdh | n.d. | 0,84 (±0,43) | n.d. | n.d. |
Ss.Adh4 | n.d. | 0,053 (±0,075) | n.d. | n.d. |
-
Von insgesamt sieben Kandidaten-Enzymen zeigten Sc.Ara1, Pc.TadH und Bm.Fdh eine messbare Aktivität auf D-Threose mit einer der Co-Faktoren NAD+ oder NADP+, was auch aus der 2 und Tabelle 5 hervorgeht. Da Pc.TadH mit 0,27 U* mg-1 die höchste spezifische Aktivität zeigte, wurden mit diesem Enzym weitere kinetische Analysen durchgeführt. Dabei wurde ein Km-Wert von 26,63 mM für das Substrat D-Threose ermittelt. Da Pc.TadH die höchste Aktivität auf D-Threose hatte und eine deutliche Expression in E. coli aufwies, wurde dieses Enzym für die Konstruktion des Stoffwechselweges zur Synthese bevorzugt.
-
Die Identifizierung von Enzymen mit D-Threonat-Dehydratase-Aktivität war, wie sich zeigte, mit Hilfe von in vitro Tests möglich, deren Ergebnisse im Folgenden beschrieben werden. Während Dehydratase-Enzyme mit Aktiviät auf L-Threonat, wie bereits erwähnt, hinlänglich bekannt sind, wurden derartige Enzymaktivitäten auf dem entsprechenden D-Stereoisomer bisher nicht berichtet. In Analogie zu der Strategie, die für die Demonstration der D-Threose-Dehydrogenase-Aktivitäten angewendet wurden, wurden daher Kandidatenenzyme mit bekannten Aktivitäten auf Zuckersäuren mit (2S,3R)-Konfiguration ausgewählt. Die Auswahl der Kandidatenenzyme schloss dabei die L-Fuconat-Dehydratasen aus Xanthomonas campestris (Xc.FucD) und Pseudomonas putida (Pp.FucD), D-Arabinonat-Dehydratasen aus Acidovorax avenae (Aa.AraD) und Herbaspirillum huttiense (Hh.AraD), D-Tartrat-Dehydratase aus Bradyrhizobium japonicum (Bj.TarD) und D-Altronate-Dehydratase aus Escherichia coli (Ec.UxaA) ein. Zusätzlich wurden D-Hydroxysäuren-Dehydratasen aus E. coli (Ec.IIvD) und Sulfolobus solfataricus (Ss.llvD) in die Untersuchungen einbezogen. Die entsprechenden Gene wurden mittels der in den Tabellen 3 und 4 beschriebenen Primer und Techniken in den pET28a Vektor kloniert. Nach Expression und Reinigung der Enzyme entsprechend der oben beschriebenen Methoden wurden diese hinsichtlich ihrer Aktivität auf D-Threonat und anderer Zuckersäuren wie oben beschrieben überprüft.
-
Die 3 zeigt ein Säulendiagramm mit den Ergebnissen des Screenings der genannten Kandidaten-Enzyme für D-Threonat-Dehydratase-Aktivität. Alle gereinigten Kandidaten-Enzyme wurden an D-Threonat und dem entsprechenden natürlichen Substrat unter Anwendung des genannten Semicarbazid-Tests, welcher 2-Keto-Säuren erkennt, überprüft. Die Substratkonzentrationen wurden mit 10 mM eingestellt, außer für Aa.AraD und Hh.AraD, wo 1 mM natürliches Substrat angewendet wurde. Bei fehlender Aktivität sind die Enzyme mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Die Enzymaktivitäten sind auf einer logarithmierten Skala im Säulendiagramm dargestellt. Die genauen Werte der Aktivitäten sind in der Tabelle 6 dargestellt.
-
Die Tabelle 6 zeigt die spezifischen Aktivitäten der getesteten N-His-getaggten Enzyme. Die Ergebnisse werden als Mittelwert (+/- Standardabweichung) von mindestens zwei biologischen Replikaten angegeben. Die Abkürzung „n.d.“ ist gleichbedeutend mit „nicht detektiert“. Tabelle 6: Aktivität verschiedener Dehydratasen auf D-Threonat und ihren natürlichen Substraten
Enzym | Natürliches Substrat | Aktivität gegenüber natürlichem Substrat (U mg -1 ) | Aktivität gegenüber (D)-Threonat (Umg -1 ) |
Ec.llvD | 2R-Dihydroxyvalerat | 0,88 (±0,32) | n.d. |
Ss.llvD | 2R-Dihydroxyvalerat | 0,01 (±0,004) | n.d. |
Xc.FucD | L-Fuconat | 4,03 (±1,07) | n.d. |
Pp.FucD | L-Fuconat | n.d. | n.d. |
Bj.TarD | D-Tartrat | 4,68 (±0,67) | n.d. |
Aa.AraD | D-Arabinonat | 0,30 (±0,06)a | 0,18 (±0,08) |
Hh.AraD | D-Arabinonat | 0,58 (±0,04)a | 0,30 (±0,02) |
Ec.UxaA | D-Altronat | 0,07 (±0,05)a, b | n.d. |
a Enzymaktivität, getestet am Substrat bei einer Endkonzentration von 1 mM. |
b Enzymaktivität in Gegenwart von FeSO4 (0,5 mM). Keine Aktivität wurde in Gegenwart von MgCl2 (10 mM) oder MnSO4 (10 mM) beobachtet. |
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Unter den getesteten Enzymen zeigten Hh.Arad und Aa.AraD eine signifikante Aktivität auf D-Threonat, wobei sie spezifische Aktivitäten von 0.30 U mg-1 beziehungsweise 0.18 U mg-1 aufwiesen, wie aus Tabelle 6 und 3 hervorgeht.
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Im Folgenden wird die Konstruktion einer Variante der Threono-1,4-Lactonase Tt.Lac11 aus T. terrifontis mit verbesserter Expression in E. coli beschrieben. Die Lactonase Tt.Lac11 aus T. terrifontis ließ sich in E. coli nur sehr schwer exprimieren, was eine geringe Ausbeute an aufgereinigtem Enzym für die kinetische Charakterisierung zur Folge hatte, und eine geringe Aktivität dieses Enzymes im Produktionsstamm erwarten ließ. Durch eine Analyse der Aminosäuresequenz der Lactonase wurde eine N-terminale Signalsequenz identifiziert, welche den Export des Enzyms ins Periplasma bewirken könnte. Um die zytosolische Expression von Tt.Lac11 zu verbessern, wurden N-terminal verkürzte Varianten dieses Proteins hergestellt und hinsichtlich ihrer Exprimierbarkeit in E. coli getestet. Es konnte gezeigt werden, dass unter Verwendung einer um 38 Aminosäuren verkürzten Variante des Enzyms (Δ1-38) eine um den Faktor 34 erhöhte Expression erzielt werden kann, wie aus Tabelle 7 hervorgeht. Diese Variante wird im Folgenden mit Tt.Lac11v1 bezeichnet, während eine um 51 Aminosäuren verkürzte Variante mit Tt.Lac11v2 und eine um 76 Aminosäuren verkürzte Variante mit Tt.Lac11v3 bezeichnet wird. Die Tabelle 7 zeigt Erträge und Aktivitäten von verkürzten Varianten der Poly-His-getaggten Tt.Lac11-Lactonase bei Expression mit pET28 in E. coli BL21 (DE3). Die Resultate entsprechen Mittelwert und Standardabweichung aus zwei unabhängigen biologischen Replikaten. Tabelle 7: Erträge und Aktivitäten von verkürzten Varianten der Poly-His-getaggten Tt.Lac11-Lactonase bei Expression mit pET28 in E. coli BL21 (DE3)
Position His-Tag | Exprimiertes Protein | Konzentration nach Reinigung (mg*mL -1 ) | Aktivität (U mg -1 ) auf 4 mM Substrat |
L-Fucono-1,4-Lacton | D-Threono-1,4-Lacton |
N-term | wt | 0,142 | 1,21 (±0,22) | 1,49 (±0,23) |
C-term | wt | 0,211 | 4,22 (±0,28) | 4,71 (±1,83) |
C-term | Δ1-38 | 4,886 | 16,46 (±2,01) | 12,35 (±1,97) |
C-term | Δ1-51 | 2,076 | 12,10 (±0,85) | 7,65 (±0,04) |
C-term | Δ1-76 | 0,134 | n.d. | 0,21 |
-
Die Biosynthese von DHB aus Glykolaldehyd wurde durch die simultane Expression des gesamten Stoffwechselwegs in einem Produktionsstamm demonstriert. Dafür wurde in allen Experimenten der Ausgangsstamm E. coli TW64 (MG1655 ΔyqhD ΔaldA) verwendet und mit Plasmiden transformiert, welche die Expression des synthetischen Stoffwechselwegs entweder ganz oder in Teilen gewährleisteten. Die Zellen wurden in 250 mL Schüttelkolben auf Mineralsalzmedium, welches mit 10 % (v/v) LB Medium komplementiert wurde, bei 37 °C und 220 rpm in einem Inkubator (Infors) kultiviert. IPTG (0,5 mM) wurde zugegeben, nachdem die Kulturen einen OD600-Wert von zirka 0,6 erreichten. Glykolaldehyd (20 mM) wurde zu den Kulturen gegeben, als der OD600-Wert der Kulturen zirka 2,0 betrug. Die Inkubationszeit war 48 Stunden. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert (+/-Standardabweichung) von mindestens zwei biologischen Replikaten dargestellt. Die Konzentrationen von DHB sowie der Stoffwechselzwischenprodukte und Glykolaldehyd wurden auf einem HPLC-System (K-2600, Knaur), welches mit einem UV-Vis-Detektor (HP 1047A, Hewlett-Packard, USA) ausgerüstet war, bestimmt. Das Injektionsvolumen betrug 20 µL und die Substanzen wurden auf einer Rezex RoA-organic acid H+ Säule, ausgestattet mit einer SecurityGuard cartrige (Phenomenex, USA), unter Nutzung von 0.5 mM H2SO4 als Laufmittel bei einer Flussrate von 0,5 mL/min aufgetrennt. Die Bestimmung von D-Glukose, D-Threose, Glykolaldehyd, D-Threonat und Acetat erfolgte bei 35 °C, während DHB und Ethylenglycol bei 80 °C gemessen wurden. Da D-Threonolacton und D-Threonat mit dieser Methode nicht aufgelöst werden können, werden die Konzentrationen dieser Metabolite als gepoolte Werte für „D-Threonat/Lacton“ angegeben.
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Die Ergebnisse der Versuche einer Biokonversion von Glykolaldehyd (GA) zu DHB sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8: Ergebnisse der Biokonversion von 20 mM Glykolaldehyd zu DHB
Stamm | Plasmide | GA (mM) (verbraucht) | D-Threose (mM) (produziert) | D-Threonat/ Lacton (mM) (produziert) | DHB produziert (mM) |
TW293 | pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11 / pEXT22-Ec.mdhSQ-Hh.araD | 14,02 (±2,33) | 0,20 (±0,09) | 2,69 (±0,18) | - |
TW304 | pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11 / pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD / pEXT21-Re.kdgT | 12,77 (±6,41) | 1,59 (±0,19) | 2,39 (±1,59) | 0,08 |
TW354 | pACT3-Ec.fsaATA-Pc.tadH-Tt.lac11v1 / pEXT22-Ec.mdh5Q-Hh.araD / pEXT21-Re.kdgT | 15,61 (±2,44) | 2,99 (±0,41) | 1,41 (±0,14) | 0,16 (±0,04) |
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In Stamm TW293 wurden alle Enzymaktivitäten exprimiert, die entsprechend des vorgeschlagenen Stoffwechselwegs notwendig sind, um Glykolaldehyd zu DHB umzuwandeln. Überraschenderweise konnten nach 48 Stunden Kultivierung zwar die Zwischenstufen D-Threose und D-Threonat/Lacton nachgewiesen werden, aber kein DHB (Tabelle 8).
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Da die Lactonase Tt-Lac11 eine Signalsequenz aufweist, die den Transport dieses Enzyms ins Periplasma bewirken könnte, wurde vermutet, dass die Ringspaltung des Lactons zu Threonat im Periplasma stattfindet und somit ein Re-Import des resultierenden D-Threonat notwendig wird. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde zusätzlich zu allen Enzymen des Stoffwechselwegs die D-Threonat-importierende Permease (Re.kdgT) aus Cupriavidus necator in Stamm TW304 exprimiert. Tatsächlich konnten mit diesem Stamm 0,08 mM DHB aus Glykolaldehyd produziert werden. Damit wird der Beweis für die Funktion des vorgeschlagenen Stoffwechselwegs gemäß 1 erbracht.
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Um die Notwendigkeit eines Exports oder eines Imports von Stoffwechselzwischenprodukten zu beseitigen, wurden drei gekürzte Formen von TtLac11 erzeugt, von denen unterschiedlich lange Abschnitte ihrer N-terminalen Sequenzen entfernt wurden (Tabelle 7). Die Lactonase-Variante Tt. Lac11 v1 (Δ1-38 aa) zeigte eine 34-fach verbesserte Expression in E. coli und eine zehnfach verbesserte spezifische Aktivität von D-Threono-1,4-Lacton. Daher wurde dieses Konstrukt ausgewählt, um in diesem Ausführungsbeispiel die erforderliche zytoplasmatische Lactonaseaktivität im Syntheseweg bereitzustellen. Der Stamm (TW354), der die verbesserte Lactonase exprimierte, war in der Lage, 0.16 mM DHB zu akkumulieren.
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Identifizierung von Enzymen mit D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität mit Hilfe von Ganzzell-Biotransformationen von Glykolaldehyd zu DHB
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Im vorangegangenen Ausführungsbeispiel wurde gezeigt, dass es mit Hilfe des vorgeschlagenen Stoffwechselwegs möglich ist, Glykolaldehyd zu DHB in einer Ganzzell-Biotransformation umzuwandeln. Die Expression von alternativen Kandidatenenzymen für einzelne Reaktionsschritte im beschriebenen Stoffwechselweg und die gleichzeitige Messung der daraus resultierenden DHB-Konzentration kann daher dazu dienen, zusätzliche oder besser geeignete Enzyme mit den gewünschten Aktivitäten zu identifizieren. Entsprechend dieser Strategie wurde zunächst ein Stamm konstruiert, der keine D-Threose-Dehydrogenase exprimiert, ansonsten aber den gesamten Stoffwechselweg einschließlich der Threonat-Permease enthält. Darüber hinaus wurden die Stämme TW 354, TW444, TW445 und TW446 konstruiert, die zusätzlich verschiedene Kandidatenenzyme für die D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität exprimierten. Die Stämme wurden wie im oben beschriebenen Ausführungsbeispiel kultiviert und die Konzentrationen von DHB und anderer Zwischenprodukte nach 48 Stunden Inkubation gemessen.
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Erwartungsgemäß war der Stamm E. coli TW559 ohne D-Threose-Dehydrogenase nicht in der Lage, die aus Glykolaldehyd synthetisierte D-Threose zu DHB oder den Stoffwechselprodukten D-Threonat/Lacton umzuwandeln, wie die in Tabelle 9 dargestellten Ergebnisse zeigen. Wenn zusätzlich die Kandidatenenzyme Pc.TadH, Xc.Fdh oder Aa.TadH exprimiert wurden, konnte die Produktion von DHB nachgewiesen werden, womit gezeigt wurde, dass diese Enzyme eine D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen. Im Gegensatz dazu konnte bei Expression der Ppi.TadH kein DHB gemessen werden, wodurch gezeigt wurde, dass dieses Enzym entweder keine D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität aufweist, oder sich nicht ausreichend in E. coli exprimieren lässt. Tabelle 9: Ergebnisse der Biokonversion von 10 mM Glykolaldehyd zu DHB in Abhängigkeit der variierten Kandidatenenzyme für D-Threose-Dehydrogenase-Aktivität
Stamm | Variierte Threose DH | Metabolitkonzentrationen nach 48 h [mM] |
D-Threose | D-Threonat/ Lacton(*) | DHB | EG |
TW559 | keine | 2,5 | n.d. (n.d.) | n.d. | 0,65 |
TW354 | Pc.TadH | 0,05 (1,46) | n.d. (1,34) | 0,45 | 0,45 |
TW444 | Aa.TadH | 0,37 (1,27) | n.d (0,11) | 0,29 | 1,46 |
TW445 | Xc.fdh | n.d. (0,75) | n.d (0,08) | 1,13 | 0,34 |
TW446 | Ppi.TadH | 0,34 (2,13) | n.d (0,13) | n.d | 0,69 |
(*) Die in Klammern gezeigten Werte entsprechen den Konzentrationen dieser Stoffe nach 24 h
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Identifizierung von Enzymen mit D-Threonat-Dehydratase-Aktivität mit Hilfe von Ganzzell-Biotransformationen von Glykolaldehyd zu DHB
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Ähnlich wie im vorangegangenen Beispiel ist die Identifizierung von D-Threonat-Dehydratasen durch die Quantifizierung der DHB-Bildung auf Glykolaldehyd nach Austausch der Hh.AraD mit anderen Kandidatenenzymen im Produktionsstamm möglich. Ein weiteres Kriterium für die Identifizierung verbesserter D-Threonat-Dehydratasen ist die Geschwindigkeit des D-Threonatabbaus. Entsprechend dieser Strategie wurden die Mutante Hh.AraD C434S, die Ca.AraD und das Enzym Pm.AraD anstelle der bisher genutzten Hh.AraD in den Produktionsstämmen TW452, TW453 beziehungsweise TW454 exprimiert und hinsichtlich ihres Einflusses auf die Geschwindigkeiten des Threonatabbaus und der DHB-Bildung untersucht. Wie aus den in Tabelle 10 dargestellten Ergebnissen hervorgeht, stellt das Enzym Pm.AraD keine D-Threonat-Dehydratase-Aktivität bereit oder kann nicht ausreichend in E. coli exprimiert werden, da bei Nutzung dieses Enzyms im Produktionsstamm keine DHB-Produktion nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu ermöglichen sowohl die Mutante Hh.AraD C434S und Pm.AraD die Produktion von DHB, wodurch ihre D-Threonat-Dehydratase-Aktivität belegt wird. Darüber hinaus wird durch die Ergebnisse gezeigt, dass die Mutante Hh.AraD C434S D-Threonat schneller abbaut, was zu einer verstärkten Produktion von DHB führt. Tabelle 10: Ergebnisse der Biokonversion von 20 mM Glykolaldehyd zu DHB in Abhängigkeit der variierten Kandidatenenzyme für D-Threonat-Dehydratase-Aktivität
Stamm | Variierte Threonat-Dehydratase | Metabolitkonzentrationen nach 48 h [mM] |
D-Threose | D-Threonat/ Lacton | DHB | EG |
TW445 | Hh.AraD | n.d. | 0,52 | 0,52 | 0,31 |
TW452 | Hh.AraD C434S | n.d. | 0,35 | 0,87 | 0,23 |
TW453 | Ca.AraD | n.d. | 5,39 | n.d. | 0,41 |
TW454 | Pm.AraD | n.d. | 1,31 | 0,35 | 0,21 |
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Identifizierung einer geeigneten NAD-abhängigen Ethylenglycol-Dehydrogenase
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Um die Umwandlung von Ethylenglycol (EG) zu DHB oder Threonin mit Hilfe des beschriebenen Stoffwechselwegs zu erreichen, muss der Stoffwechselweg um eine Reaktion erweitert werden, welche die Oxidation von Ethylenglycol zu Glykolaldehyd ermöglicht. Wie bereits erwähnt, sind mehrere Enzyme bekannt, die eine NAD-abhängige Oxidation von Ethylenglycol zu Glykolaldehyd katalysieren. Um zu testen, welches Enzym für die Komplementierung des beschriebenen Stoffwechselwegs am geeignetsten ist, wurde ein wachstumsabhängiges Testsystem eingesetzt, bei dem die Wachstumsgeschwindigkeit des Teststammes von der in vivo Aktivität der Ethylenglycol-Dehydrogenase abhängt. Es ist bekannt, dass E. coli natürlicherweise keine Ethylenglycol-Dehydrogenase exprimiert und daher nicht auf dem Substrat Ethylenglycol als alleiniger Kohlenstoffquelle wachsen kann. Die Expression einer Ethylenglycol-Dehydrogenase ermöglicht allerdings die Umwandlung von Ethylenglycol zu Glykolaldehyd und damit ein Wachstum auf diesem Substrat. Daher wurden die drei Kandidatenenzyme Go.Adh, Ec.FucO und Ec.FucO 16L:L7V mit Hilfe eines pEXT20 Vektors in den E. coli Stämmen E. coli ΔyqhD und E. coli ΔyqhD ΔaldA exprimiert. Die Konstrukte auf Basis der Doppelmutante E. coli ΔyqhD ΔaldA dienten dabei als Kontrolle, da diese Stämme in Folge der Deletion der Glykolaldehyd-Dehydrogenase AldA nicht auf Ethylenglykol wachsen können. Die Teststämme wurden auf Mineralsalzmedium inkubiert, welches die gleiche Zusammensetzung hatte, wie in den vorangehend beschriebenen Experimenten. In diesem Medium wurde lediglich die Glukose als alleinige Kohlenstoffquelle durch 100 mM Ethylenglycol ersetzt. Die Teststämme wurden in Mikrotiterplatten (250 µL Medium pro Well) bei einer Schüttelfrequenz von 880 rpm und einer Temperatur von 37 °C in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (Tecan) inkubiert. Die Wachstumsgeschwindigkeiten wurden durch regelmäßige Messung der OD600 ermittelt. Wie in 4 gezeigt wird, ermöglichte die Ethylenglycol-Dehydrogenase Go.Adh das schnellste Wachstum, gefolgt von Ec.FucO 16L:L7V und Ec.FucO. Aus diesem Grund wurde die Go.Adh nachfolgend als Ethylenglycol-Dehydrogenase für die Umwandlung von Ethylenglycol zu DHB mit Hilfe des beschriebenen Stoffwechselwegs eingesetzt.
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Demonstration der Synthese von DHB ausgehend von Ethylenglycol
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Die Biosynthese von DHB aus Ethylenglycol wurde durch die simultane Expression des gesamten Stoffwechselwegs einschließlich der Ethylenglycol-Dehydrogenase in einem Produktionsstamm demonstriert. Dafür wurde in allen Experimenten der Ausgangsstamm E. coli TW64 (MG1655 ΔyqhD ΔaldA) verwendet und mit Plasmiden transformiert, welche die Expression des synthetischen Stoffwechselwegs einschließlich der Ethylenglycol-Dehydrogenase Go.Adh gewährleisteten. Die Kultivierung des so konstruierten Produktionsstammes TW363 sowie die Messung der Substrat- und Produktkonzentrationen erfolgte wie im o.g. Ausführungsbeispiel für die Synthese von DHB aus Glykolaldehyd. Im Gegensatz zum genannten Beispiel wurde kein Glykolaldehyd zu den Kulturen gegeben, sondern es wurde Ethylenglycol den Kulturen nach dem Erreichen einer OD von 0,6 in verschiedenen Anfangskonzentrationen zugesetzt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11: Ergebnisse der Biokonversion von Ethylenglycol (EG) zu DHB durch Stamm TW363
Anfangskonzentration EG (mM) | Verbrauch von EG [mM] | Gebildete Produkte [mM] |
| Glykolaldehyd | D-Threose | D-Threonat/ Lacton | DHB |
0 | - | 0,00 | 0,06 | 0,00 | 0,00 |
160 | 7,20 | 0,00 | 0,05 | 0,00 | 0,00 |
320 | 10,3 | 0,42 | 0,05 | 0,17 | 0,36 |
640 | 17,0 | 3,87 | 0,29 | 1,57 | 0,19 |
1280 | 30,8 | 6,34 | 1,08 | 2,09 | 0,00 |
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Im Folgenden sind jeweils die DNA-Sequenzen von bestimmte Enzyme codierenden Genen und die Aminosäuresequenzen der entsprechenden Enzyme aufgeführt.
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Sequenzen für Ec.FucO
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 78):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 79) im Einbuchstabencode :
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Sequenzen für Ec.FucOOR (Ec.FucO 16L:L7V)
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 80):
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Aminosäure-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 81):
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Sequenzen für Go.Adh
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 82):
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Aminosäure-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 83):
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Sequenzen für Ec.FsaA
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 84):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 85):
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Sequenzen für Ec.FsaATA
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 86):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 87):
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Sequenzen für Sc.Ara1
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 88):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 89):
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Sequenzen für Sc.Ara2
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 90):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 91):
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Sequenzen für Pc.TadH
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 92):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 93):
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Sequenzen für Pl.LgdA
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 94):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 95):
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Sequenzen für Ps.Fdh
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 96):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 97):
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Sequenzen für Xc.Fdh
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 98):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 99):
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Sequenzen für Aa.TadH
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 100):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 101):
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Sequenzen für Ppi.TadH
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 102):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 103):
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Sequenzen für Ss.Adh4
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 104):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 105):
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Sequenzen für Bm.Fdh
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 106):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 107):
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Sequenzen für Tt.lac11
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 108):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 109):
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Sequenzen für Tt.lac11v1
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 110):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 111):
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Sequenzen für Tt.lac11v2
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 112):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 113):
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Sequenzen für Tt.lac11v3
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 114):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 115):
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Sequenzen für Ec.llvD
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 116):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 117):
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Sequenzen für Ss.llvD
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 118):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 119):
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Sequenzen für Xc.FucD
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DNA-Sequenz (codonoptimiert, SEQ-ID-Nr. 120):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 121):
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Sequenzen für Pp.FucD
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 122):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 123):
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Sequenzen für Bj.TarD
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 124):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 125):
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Sequenzen für Aa.AraD
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 126):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 127):
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Sequenzen für Hh.AraD
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 128):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 129):
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Sequenzen für Hh.AraDC434S
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 130):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 131):
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Sequenzen für Ca.AraD
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 132):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 133):
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Sequenzen für Pm.AraD
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 134):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 135):
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Sequenzen für Ec.UxaA
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 136):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 137):
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Sequenzen für Ec.Mdh5Q
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 138):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 139):
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Sequenzen für Re.KdgT
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DNA-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 140):
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Aminosäuresequenz (SEQ-ID-Nr. 141):
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Im Folgenden sind die DNA-Sequenzen für verschiedene Plasmide aufgeführt.
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DNA-Sequenz für pACT3-Ec.fsaA
TA-Pc.tadH- Tt.lac11
v1(SEQ-ID-Nr. 142)
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DNA-Sequenz für pACT3-Ec.fsaA
TA-Xc.fdh- Ttlac11
v1 (SEQ-ID-Nr. 143)
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DNA-Sequenz für pACT3-Go.adh-Ec.fsaA
TA-Pc.tadH-Tt.lac11
v1 (SEQ-ID-Nr. 144)
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DNA-Sequenz für pEXT22- Ec.mdh
5Q-Hh.araD (SEQ-ID-Nr. 145)
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Bezugszeichenliste
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- I
- Xylose-Isomerase
- II
- Xylulose-1-Kinase
- III
- Xylulose-1P-Aldolase
- IV
- Ethylenglycol-Dehydrogenase (Membran-gebunden)
- V
- Ethylenglycol-Dehydrogenase (zytosolisch)
- VI
- Methanoldehydrogenase
- VII
- Glykolaldehyd-Synthase
- VIII
- D-Threose-Aldolase
- IX
- D-Threose-Dehydrogenase
- X
- D-Threono-1,4-Lactonase
- XI
- D-Threonat-Dehydratase
- XII
- L-Homoserin-Transaminase
- XIII
- L-Homoserin-Kinase
- XIV
- L-Threonin-Synthase
- XV
- 2-Keto-4-Hydroxybutyrat (OHB)-Reduktase
- ATCC
- American Type Culture Collection
- DH
- Dehydrogenase
- DHB
- 2,4-Dihydroxybutyrat, 2,4-Dihydroxybuttersäure
- EG
- Ethylenglycol
- HEPES
- 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
- HMTB
- D/L-2-Hydroxy-4-(Methylthio)butyrat
- IPTG
- Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
- LB
- Lysogeny broth (LB)-Medium, komplexes Nährmedium zur Kultivierung von Bakterien
- NAD
- Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid
- NADP
- Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
- OD
- optische Dichte
- OD600
- optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm
- OHB
- 2-Keto-4-Hydroxybutyrat in Form eines 2-Keto-4-Hydroxybutyrat-Salzes oder der Säure 2-Keto-4-Hydroxybuttersäure
- PCR
- Polymerase-Kettenreakton
- HiFi
- High-Fidelity-Polymerase
- RBS
- Ribosombindungssequenz
- RE
- Restriktionsenzyme
- UniProt.
- bioinformatische Datenbank für Proteine aller Lebewesen und Viren (englisch: universal protein database)
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.