CN111849806B

CN111849806B - 一株海草根际促生固氮菌nxt28及其应用

Info

Publication number: CN111849806B
Application number: CN202010597865.6A
Authority: CN
Inventors: 周卫国; 董俊德; 凌娟; 丁德文; 索安宁; 龙丽娟; 林显程; 杨清松; 张颖; 孙英婷
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: CN111849806A

Abstract

本发明公开了一株海草根际促生固氮菌NXT28及其应用。Raoultella terrigena NXT28，保藏编号：CCTCC No.M 2017843。本发明从海草从南沙群岛分布着的泰来草、海神草和喜盐草中均分离得到固氮菌NXT28，并对其进行了形态学、生理生化特性和***发育学方面的鉴定，鉴定其为拉乌尔菌(Raoultella terrigena NXT28)。该菌株通过生物固氮作用能显著提高海水中硝酸盐和亚硝酸盐浓度，可增强海草的光合作用能力，并促进海草叶和根的生长。因此，该菌株Raoultella terrigena NXT28在海洋微生物菌剂制备方面具有较高的价值和广阔的应用前景。

Description

一株海草根际促生固氮菌NXT28及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株海草根际促生固氮菌NXT28及其应用。

背景技术

植物根际促生菌是一种自由生活在土壤或定殖在植物根际上对植物产生有益影响的微生物。它可通过多种机制促进植物的生长，如产生植物生长素、抑制有害微生物/病原体、溶解氮磷营养盐以及诱导宿主对多种病原体的抗病性和耐受性；具体包括通过生物固氮提高环境中可利用氮素，提高根系对硝酸盐的吸收能力；加快植物根际中磷酸盐的溶解，增加生物利用度；释放激素、挥发性化合物和其他生长调节物质；参与重金属污染土壤的修复；也能提高植物的耐旱性和耐盐性。综上，植物根际促生菌可以有效地帮助植物本身获得生长需要的营养物质，这对于营养匮乏地区植物的生长是至关重要的。

许多研究都为热带和温带地区海草生长过程中出现的营养限制提供实验证据，结果表明海洋植物可能依靠它们共附生微生物来获得营养。氮素是限制海草生长和初级生产力的基本要素，由此，生物固氮过程成为了研究海草与微生物间相互作用的热点。已有的研究表明，泰来草和大叶藻根际中固氮细菌的丰度是无海草覆盖区沉积物中的300倍，由海草根际固氮微生物产生的铵能够满足植物33％-100％的氮需求。

目前全球海草床生境退化现象严重，植株移植法是海草修复的主要修复方法之一(张沛东等，2013)。从海草中获得的很多细菌与陆地植物根际促生菌代谢特性相似，这意味着这些海草微生物在提高其宿主适应性方面具有潜在作用(Tarquinio等.，2019)。接种源于海草微生物群落中的特定细菌可以提高海草对外界环境胁迫的适应能力，是进一步恢复海草栖息地的新方法。尽管陆地植物根际促生菌的研究和农业生产应用非常广泛，在海洋植物中研究开发仍然不足，通过植物根际促生菌接种的方法用于促进移植海草的繁育和生长的研究较少。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株从岛礁生态***海草根际沉积物中分离得到的固氮菌 -Raoultella terrigena NXT28，其于2017年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC No.M2017843。

该菌在已有的海草细菌分离和研究中未见相关报道。16S rRNA基因和nifH基因鉴定结果表明该菌隶属于拉乌尔菌属(Raoultella terrigena NXT28)，乙炔还原法测定出菌株NXT28 固氮活性为11.58nmol C₂H₂·mL^-1·h^-1。

所述固氮菌株Raoultella terrigena NXT28具有如下形态和生理生化特性：

菌落特征表现为球状，乳白色，粘稠，易挑起，无鞭毛，革兰氏染色阳性。对数生长期为30-36h，温度范围为24-40℃，盐浓度耐受范围为0-8％，pH生长范围为6-8。硝酸盐还原阳性，明胶水解阴性，淀粉水解阳性，能利用鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖、蔗糖、 ***糖、半乳糖、甘露醇作为碳源。主要极性脂成分为磷脂酰乙醇胺(PE)、双磷脂酰甘油(DPG)和磷脂酰甘油(PG)，此外还有少量的未知结构的脂(L1，L2，L3，L4)。甲基萘醌醌型为MK-8。DNA G+C含量为66.43％。

本发明的第二个目的是提供固氮菌株Raoultella terrigena NXT28在制备海草根际促生菌剂中的应用。

所述的固氮菌Raoultella terrigena NXT28的菌液是通过以下方式制备的：

将拉乌尔菌NXT28接种入LB培养基中富集至培养液中的活菌数达到10⁸CFU/mL。然后将海草根部用菌液浸泡3-4h。发现所述固氮菌Raoultella terrigena NXT28接种后能有效提高海草周围海水硝酸盐和亚硝酸盐浓度、海草光合作用和海草新根叶数。

因此，本发明的第三个目的是提供固氮菌株Raoultella terrigena NXT28在制备提高海草周围海水氮营养盐浓度的制剂中的应用。

本发明的第四个目的在于提供固氮菌株Raoultella terrigena NXT28在制备提高海草光合作用的制剂中的应用。

本发明的第五个目的在于提供固氮菌株Raoultella terrigena NXT28在制备提高海草根叶数的制剂中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种海草根际促生菌剂、提高海草周围海水氮营养盐浓度的制剂、提高海草光合作用的制剂或提高海草根叶数的制剂，含有Raoultellaterrigena NXT28作为活性成分

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明从海草从南沙群岛分布着的泰来草、海神草和喜盐草中均分离得到固氮菌NXT28，并对其进行了形态学、生理生化特性和***发育学方面的鉴定，鉴定其为拉乌尔菌(Raoultella terrigena NXT28)。该菌株通过生物固氮作用能显著提高海水中硝酸盐和亚硝酸盐浓度，可增强海草的光合作用能力，并促进海草叶和根的生长。因此，该菌株Raoultella terrigena NXT28在海洋微生物菌剂制备方面具有较高的价值和广阔的应用前景。

Raoultella sp.NXT28，其于2017年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC No.M 2017843。

附图说明

图1是拉乌尔菌NXT28基于邻接法构建的16S rRNA的***发育进化树。

图2是拉乌尔菌NXT28基于邻接法构建的nifH的***发育进化树。

图3是拉乌尔菌NXT28接种后泰来草叶光合有效辐射(PAR)和电子传递速率(ETR)的光合曲线。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：固氮菌的筛选

1.分离培养基

海草固氮培养基：NaCl 25g，KCl 0.56g，MgSO₄·7H₂O 4.8g，MgCl₂·6H₂O 4.0g，K₂HPO₄ 0.01g，FeSO₄·7H2O 0.001g，Tris 0.48g，蛋白胨4.0g，酵母提取物2.0g，甘油2mL，去离子水1L，pH8.2，配制方法是将各成分按其含量混合均匀。固体培养基中加入质量分数2％的琼脂，其中液体培养基采用0.22μm抽滤法灭菌。

Ashby无氮培养基：甘露醇5.0g，KH₂PO₄·H₂O 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 5.0g，CaSO₄ 0.1g，CaCO₃ 5.0g，陈海水和去离子水各500mL，pH7.0，配制方法是将各成分按其含量混合均匀，灭菌。固体培养基中加入2％的琼脂。

LB培养基：(菌种活化和保藏)：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，去离子水1L，配制方法是将各成分按其含量混合均匀，灭菌。固体培养基中加入2％的琼脂。

2.海草沉积物固氮菌筛选

2016年7月从南沙群岛采集泰来草、海神草和喜盐草根际沉积物样品。分别使用稀释涂布法和富集培养法进行固氮菌的筛选。其一，取0.2g海草根际沉积物用无菌海水稀释成10^-3、 10^-4、10^-5，随后分别涂布于固体海草固氮培养基和Ashby无氮培养基；其二，取2g海草沉积物样品分别放入98mL液体海草固氮培养基和Ashby无氮培养基中，放置于摇床28℃180rpm 下富集培养3d，随后吸取200μL菌悬液稀释成10^-3、10^-4、10^-5后，涂布于固体海草固氮培养基和Ashby无氮培养基中。

将固体平板放置于28℃恒温培养箱中培养，然后根据平板上长出的菌落大小、颜色、质地挑取菌落于新的海草固氮培养基上划线培养，直至纯化成单菌落为止，获得固氮菌株 NXT28。

3.固氮nifH基因扩增

将分离纯化后固氮菌株NXT28接种入LB液体培养基中，培养至生长指数期后，取2mL 菌液4000rpm离心5min，去除上清液，剩余的菌体使用E.Z.N.A.细菌DNA试剂盒(OmegaBio-tek，USA)提取DNA，扩增细菌的nifH基因，nifH基因的扩增引物为polF (5'-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3')和polR(5'-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3')， PCR扩增体系为:1μL模板DNA/cDNA，0.5μL正反向引物，12.5μL Ex Taq酶(Takara， Japan)，0.5μL BSA(0.1％，sigma)和10μL无菌水，PCR扩增程序为：95℃5min；95℃ 45s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将PCR扩增产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳确定条带后(360bp)进行测序，其序列如SEQ ID NO.2所示。

4.固氮活性测定

将固氮菌株NXT28接种入LB培养基于28℃摇床震荡培养8h后，移入密封小气瓶中，抽出5％体积的空气，随后注入等体积的乙炔气体，继续培养8h，吸取20μL气体下检测。首先以乙烯(浓度100ppm)作为标准气体建立乙烯峰面积和浓度的标准曲线，随后，从采气瓶中吸取20μL气体于气相色谱仪(GC112A，China)下检测乙烯产生量。色谱条件设置为：柱箱初始温度120℃、进样器150℃、检测器200℃。每个样品设置3个重复。计算出的固氮活性以每毫升菌液每小时内转化的乙炔量表示。

使用乙炔还原法根据乙烯峰图和公式计算出的菌株NXT28固氮活性为11.58nmolC2H2·mL-1·h-1。

实施例2：固氮菌NXT28的鉴定

1.形态学特征

菌株NXT28菌落特征表现为球状，乳白色，粘稠，易挑起，无鞭毛，革兰氏染色阳性。

2.生理生化特征

如表1所示，参考细菌鉴定手册对菌株NXT28的生理生化特性进行测定。结果表明，菌株NXT28的对数生长期为30-36h，温度范围为24-40℃，盐浓度耐受范围为0-8％，pH生长范围为6-8。硝酸盐还原阳性，明胶水解阴性，淀粉水解阳性，能利用鼠李糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖、蔗糖、***糖、半乳糖、甘露醇作为碳源。

3.化学分类特征

菌株NXT28的主要极性脂成分为磷脂酰乙醇胺(PE)、双磷脂酰甘油(DPG)和磷脂酰甘油(PG)，此外还有少量的未知结构的脂(L1，L2，L3，L4)。菌株NXT28甲基萘醌醌型为MK-8。DNA G+C含量为66.43％。

4.***发育分析

将分离纯化后的细菌使用E.Z.N.A.细菌DNA试剂盒(Omega Bio-tek，USA)提取DNA，然后分别扩增细菌的16S rRNA基因和nifH基因。将测序的结果进行BLAST比对，16SrRNA 基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)比对结果表明菌株NXT28与Raoultellaterrigena ATCC 33257相似性最高，达99.64％；nifH基因序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)比对结果表明，菌株NXT28与Raoultella terrigenaDR-E5的相似性最高，相似性为97.57％。16S rRNA基因和nifH基因进化树分别如图1，图2所示。

表1拉乌尔菌NXT28的生理生化特征

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性；“*”表示未知

将固氮菌NXT28命名为：拉乌尔菌(Raoultella terrigena)NXT28，于2017年12月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC No.M2017843。

实施例3：固氮菌NXT28对海草的促生试验

1、菌株活化

将拉乌尔菌NXT28接种入LB培养基中，28℃摇床培养至培养液中的活菌数达到10⁸CFU/mL。

2、泰来草室内培养实验设计

实验设置有对照组、原位底质菌剂组和人工底质菌剂组，每种处理设置三个生物学重复。首先分别向对照组和原位底质菌剂组培养缸(25L)中移入原位沉积物，人工底质菌剂组培养缸中加入灭菌后的沙砾石，保证每缸底质的厚度为5cm；然后移入采集的生长状态健康的海草泰来草植株，其中，处理组(原位底质菌剂组和人工底质菌剂组)中海草根部用拉乌尔菌NXT28菌液浸泡3-4h，每缸放入12株生长状况大体相同海草；最后加入原位海水。每一培养缸装配有自我循环的水泵和12h：12h昼夜循环的LED灯，分装后的泰来草放置于实验室内恒温(28℃)培养。菌剂和海水每周更换一次，持续培养30天。

3.海草指标测定

3.1海水营养盐

泰来草培养30天后，收集海水经0.2μm聚碳酸酯滤膜过滤后通过AA3自动营养盐分析仪测定营养盐。如表2所示，原位底质菌剂组和人工底质菌剂组海水中硝酸盐和亚硝酸盐含量分别是对照组的3.7和2.66倍，表明该菌剂的添加能明显提高海草周围海水中硝酸盐和亚硝酸盐的浓度，具有解决寡营养海域海草生产力较低的难题的潜力。

表2不同处理组海水营养盐情况

3.2泰来草光合作用

光合曲线主要表征海草在光合作用过程中转移电子和能量的能力。泰来草培养30天后，对泰来草进行30分钟的暗适应，从每个培养缸中随机挑选3株海草，将Diving-PAM探头对准叶子表面，连续在168、320、559、796、1068、1532、2035和3011μmol photons m^-2s^-1八个光照强度下测定海草叶的电子传递速率，其中，不同光照强度测定间隔时间为20s。如图3 所示，海草在培养30天后，原位底质菌剂组和人工底质菌剂组泰来草叶的光合曲线斜率和最大电子传递速率(ETRmax)均显著高于对照组，表明固氮菌剂NXT28的添加能提高海草的光合作用能力。

3.3泰来草新叶数和新根数

分别在培养前和培养30天后记录每株海草的叶数和根数，记录海草植株的生长状况。如表3所示，加入菌剂后的原位底质菌剂组新叶数和新根数分别是对照组的1.14倍和1.92倍；加入菌剂后的人工底质菌剂组新叶数较对照组略少，新根数是对照组的1.62倍。这些结果表明菌剂的添加对泰来草具有较好的促生作用。有望研制微生物菌剂应用于海草床生境的生态修复。

表3不同处理组的泰来草新增的平均叶数和平均根数

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一株海草根际促生固氮菌NXT28及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1405

<212> DNA

<213> 拉乌尔菌 NXT28(Raoultella terrigena NXT28)

<400> 1

gcagtcgagc ggtagcacag aagagcttgc tctttgggtg acgagcggcg gacgggtgag 60

taatgtctgg gaaactgcct gatggagggg gataactact ggaaacggta gctaataccg 120

cataacgtcg caagaccaaa gtgggggacc ttcgggcctc atgccatcag atgtgcccag 180

atgggattag ctagtaggtg aggtaatggc tcacctaggc gacgatccct agctggtctg 240

agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 300

tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg 360

ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgagg aggaaggcgt taaggttaat aaccttgtcg 420

attgacgtta ctcgcagaag aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg 480

gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgtcaag 540

tcggatgtga aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatc cgaaactggc aggctagagt 600

cttgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat 660

accggtggcg aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga 720

gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgctgtaaac gatgtcgact tggaggttgt 780

tcccttgagg agtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc 840

gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900

aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccagagaact tagcagagat 960

gctttggtgc cttcgggaac tctgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg 1020

tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcggttc 1080

ggccgggaac tcaaaggaga ctgccagtga taaactggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1140

gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcatat acaaagagaa 1200

gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcata aagtatgtcg tagtccggat cggagtctgc 1260

aactcgactc cgtgaagtcg gaatcgctag taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata 1320

cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta 1380

ggtagcttaa ccttcgggag ggcgc 1405

<210> 2

<211> 361

<212> DNA

<213> 拉乌尔菌 NXT28(Raoultella terrigena NXT28)

<400> 2

ggggaaggct gatctgcacg ctaagcacag aacaccatta tggagatggc cgcggaagtg 60

ggctcggtgg aggacctcga gctcgaagat gtcctgcaaa tcggctacgg cgacgtgcgc 120

tgtgcagaat caggcggccc ggagccaggc gtcggctgcg cgggtcgcgg ggtgatcacc 180

gccatcaact tcctcgagga ggaaggcgcc tatgaggacg atctcgactt cgtgttctat 240

gacgtgctcg gggacgtggt ctgcggcggc ttcgcgatgc caatccgtga aaataaggcc 300

caggagatct atatcgtctg ctccggcgaa atgatggccc tttatgccgc caacaccata 360

a 361

Claims

1.拉乌尔菌（Raoultella sp. ）NXT28，保藏编号：CCTCC No.M 2017843。

2.权利要求1所述的拉乌尔菌NXT28在制备海草根际促生菌剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将拉乌尔菌NXT28接种入LB培养基中富集至培养液中的活菌数达到10⁸ CFU/mL，然后将海草根部用菌液浸泡3-4h。

4.权利要求1所述的拉乌尔菌NXT28在制备提高海草周围海水氮营养盐浓度的制剂中的应用。

5.权利要求1所述的拉乌尔菌NXT28在制备提高海草光合作用的制剂中的应用。

6.权利要求1所述的拉乌尔菌NXT28在制备提高海草根叶数的制剂中的应用。

7.一种海草根际促生菌剂、提高海草周围海水氮营养盐浓度的制剂、提高海草光合作用的制剂或提高海草根叶数的制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的拉乌尔菌NXT28作为活性成分。