CN108292035B - 由纳米多孔材料制成的用于浸没式显微术的样品定界元件 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种样品定界元件(1)，其至少在一个区域中由纳米多孔材料构成，纳米多孔材料对于通过显微镜(6)可捕捉的至少一个观察辐照(9)是透明的，其中纳米多孔材料包括孔(2)，其平均孔径小于观察辐照(9)的波长，并且纳米多孔材料的体积的至少5％的比例由至少在纳米多孔材料的部分中的孔(2)占据。该材料具有开放孔隙率，平均孔径至多为1000nm，并且纳米多孔材料的每单位体积的孔(2)的数目和/或平均孔径沿着样品定界元件(1)的至少一个范围改变，使得在样品定界元件(1)中形成孔梯度(11)，并且其具有其中不存在孔隙率的至少一个梯度部分，使得通过样品定界元件(1)，实现样品定界元件(1)的一个侧表面(1.1，1.2)上的样品介质(3)与样品定界元件(1)的相对的侧表面(1.1，1.2)上的浸没介质(4)的分离。本发明还涉及使用样品定界元件(1)的显微术方法，以及显微镜(6)。此外，本发明涉及用于生产样品定界元件(1)的可能材料。

Description

由纳米多孔材料制成的用于浸没式显微术的样品定界元件

技术领域

本发明涉及如所附权利要求1所要求保护的样品定界元件。本发明还涉及显微术方法和显微镜。

背景技术

浸没式物镜的使用在显微术中提供多种优势，所有优势最终由浸没式物镜的更高的可实现数值孔径产生。所述的优势例如是更高的空间分辨率、更高的光收集效率、更高的信噪比和/或更好的信号背景比、更短的曝光时间和更好的时间分辨率，并且还降低生物样品上的光毒性作用。最后的优势特别是在生物样品的显微术中是非常重要的，例如活细胞和/或生物活性分子。

通过使用与浸没介质协作的浸没式物镜，可以使数值孔径最大化，其中相应的浸没介质具有最大可能折射率。在这种情况下，将要观察的样品用薄盖玻片覆盖，或者将样品施加于盖玻片，并且将浸没介质施加于盖玻片的背离样品的那个侧表面。盖玻片防止浸没介质和样品介质的互混以及浸没介质对样品的污染。

已知的浸没介质包含例如油、油性物质和可变形的透明塑料，诸如DE 14 72 294A中所描述。

浸没介质的折射率的有利上限由盖玻片的折射率给定。如果浸没介质和盖玻片的折射率是相同的，则该盖玻片在光学上不再有效，并且在样品的观察期间不会引起成像像差。

这样的折射率的匹配典型地是通过油浸没式物镜和作为浸没介质的油而可实现的。

特别地，样品介质中通常存在生物样品，使得至少暂时地保持样品或者其成分的天然性质。

如果样品介质的折射率偏离盖玻片和/或浸没介质的折射率(在生物样品的情况下常常是这种情况)，则在油浸没式物镜的情况下，仅可以在非常靠近盖玻片的焦平面中进行最优工作，因为由于折射率上的突然变化而产生像差(主要是球面像差)，像差随着焦平面在样品中的深度而增大。

因此，水浸没式物镜更适用于显微镜，特别是对活细胞。因为细胞位于水性样品介质中，所以浸没介质和样品介质的折射率非常相似。只有盖玻片的折射率偏离。

如果通过校正将盖玻片的光学效应消除，则随着焦平面更加深地穿透到样品中不会发生球面像差。

然而，这样的校正对指定厚度、平面度和玻璃类型的盖玻片指定，出于这些原因，特别是水浸没式物镜通常配备有校正功能，该校正功能可以用于校正盖玻片厚度的波动，该波动在作为浸没式物镜中的镜头或镜头组的移置的结果而以产生的方式是不可避免的。

因为即使细胞不在纯水性溶液中由显微术检查而且细胞附加地具有与样品介质不同的折射率，所以各种各样的浸没介质是可用的。活细胞的显微术的典型浸没介质是水、水的有机替代介质、甘油、TDE和诸如硅酮油的指定浸没油。

在常温下所有浸没介质是液体。只有浸没介质具有与样品介质精确相同的光学参数，才能实现最佳图像质量以及最大信号强度和穿透深度。

因此，在使用浸没式物镜和通过浸没介质的显微术的情况下产生局限性和缺点。就此而言，盖玻片通常具有与浸没介质不同的光学性质，因此需要专用物镜，特别是浸没式物镜。浸没介质通常具有与样品介质不同的光学性质，因此甚至专用物镜的性能下降。这在原理上导致了在焦平面的相对较高的穿透深度下的球面像差和色差。

然而，甚至已校正的专用物镜对于盖玻片引起的像差是高度敏感的。这种像差例如是由于显微镜的束路径中以倾斜形式定位的盖玻片而产生的像差。如果侧表面不彼此平行或者盖玻片是相对于光学平面倾斜，则也会产生像差。盖玻片的厚度的波动同样地导致像差，其中像差的强度与盖玻片和浸没介质之间的折射率上的差异近似成比例放大。

出于上面所提及的原因，就适当的显微镜的实现方式而言，专用物镜必须存在于每种浸没介质的清单中。这样的专用物镜例如是油浸没式物镜、硅酮油浸没式物镜、甘油浸没式物镜和水浸没式物镜。在技术上和经济上可维持的成本的情况下，每个专用物镜在每种情况下仅可实施一种校正功能。举例而言，例如通过多浸没式的物镜，提供盖玻片厚度校正或折射率浸没介质校正。

作为大量专用物镜的替代例，可以使用特别地设计的浸没式物镜，例如从DE 2655 041 C2已知的。本文中所公开的浸没式物镜具有在前置镜头的前面的由透明材料构成的板，所述板沿着光学轴线是可移置的。出于校正不同浸没介质的折射率和盖玻片厚度的目的，板和盖玻片之间的由浸没介质填充的间隔的厚度是可调整的。

DE 10 2013 107 297 A1公开了样品的覆盖物，其中覆盖物由具有开放孔隙率的纳米多孔材料构成，并且对于通过显微镜可捕捉的观察辐照是透明的。材料的平均孔径小于观察辐照的波长。

US 2007/0128069 A1公开了多孔盖玻片，其孔从一侧表面延伸至相对的侧表面。盖玻片提供有同样通体多孔的膜。从DE 10 2011 076 238 A1已知非常相似膜，其具有对细胞和细胞成分的过滤功能。

纳米多孔材料还附加地用于其他技术领域，并且用于例如在US 2013/0170044 A1和US 2014/0334006 A1中所描述的耐划伤性的光学滤波器。

发明内容

本发明基于提出以下的可能性的目标：在使用浸没介质的显微术的情况下，至少将现有技术中已知的缺点和局限性降低。

该目标通过如独立权利要求1所要求保护的样品定界元件、如权利要求8所要求保护的显微术方法、以及如权利要求10所要求保护的显微镜来实现。在从属权利要求中指定有利的配置。

该目的通过样品定界元件来实现，其至少在一个区域中由纳米多孔材料构成，纳米多孔材料对于通过显微镜可捕捉的至少一个观察辐照是透明的，纳米多孔材料的平均孔径直径小于观察辐照的波长。根据本发明的样品定界元件的特性是：纳米多孔材料是具有开放孔隙率的纳米多孔材料，并且具有含有至多1000nm的平均孔径的孔。材料体积的至少5％的比例被孔占据。纳米多孔材料的每单位体积的孔数目和/或平均孔径沿着样品定界元件的至少一个范围改变，使得在样品定界元件中形成孔梯度。孔梯度包括无孔层。

材料体积的由所有孔的体积所构成的比例还称为体积分数。

在开放孔隙率的情况下，孔(其中其至少大部分)是互连的。

在样品定界元件的一个可能的实施例中，基于分布函数确定平均孔径。将所有孔中的95％所具有的减和/或加其标准差的直径确定为平均孔径。

本发明的本质是样品定界元件，其至少部分地实施施加于样品定界元件上的浸没介质的光学性质，并且同时实现盖玻片的传统功能，即样品介质和浸没介质的分离。

为了确保样品介质和浸没介质的分离，孔梯度具有不存在孔隙率的至少一个梯度部分。以此方式，可以通过样品定界元件来使样品定界元件的一个侧表面上的样品介质与样品定界元件的相对的侧表面上的浸没介质的分离成为可能。

根据本发明的样品定界元件具有例如以下商业可得的盖玻片的尺寸：例如具有0.02至0.21mm的厚度的18×18mm、22×22mm或24×40mm。样品定界元件还可以实施有单独尺寸、设计和/或厚度。在其它实施例中，可以对多孔板(multi-well plate)或诸如皮氏培养皿(Petri dish)的容器来设计样品定界元件。

在其他可能的实施例中，将样品定界元件实施为中空圆柱体。该实施例例如使将样品定位在样品定界元件的内部并且由显微术检查样品成为可能。样品定界元件的该设计可以有利地用于光片显微术方法和/或激光扫描显微术中。

样品定界元件的光学特性有利地适配于单独浸没介质。为了该目的，样品定界元件至少区域地由纳米多孔材料构成。纳米多孔材料形成样品定界元件的区域，当在显微镜中使用样品定界元件时观察辐照穿过该区域。

由于纳米多孔材料的高有效内表面积，样品定界元件吸收相应的浸没介质和/或样品介质。在这种情况下，纳米多孔材料的孔的平均孔大小相对于观察辐照的波长必须是小的，以便填充有介质(特别是浸没介质和/或样品介质)的样品定界元件是具有介于材料的折射率和浸没介质的折射率之间的有效折射率的光学均匀物体。在这种情况下，准确值取决于相应的体积分数

其中V_材料是材料体积且V_孔是孔体积。

对于电介质介质而言，有效折射率n_eff得到良好近似为：

其中n₁和n₂是相应介质的折射率(折射的指数)。

因为孔担当散射中心，所以除了有效折射率n_eff之外，还应该考虑到样品定界元件的散射性质。可以使用米氏(Mie)散射理论估计其散射性质，并且同样地具有体积分数

和平均孔尺寸的纳米多孔材料的散射和消光系数。

如果平均孔径具有不大于±10％的方差，则是有利的。低方差使有效折射率n_eff的更精确匹配成为可能并降低有效折射率n_eff的局部不均匀性。

特别地通过体积分数和/或孔的平均孔径的选择，有效折射率n_eff的匹配是可能的。在这种情况下，附加地考虑样品定界元件的材料及其光学性质。

观察辐照是通过检测器单元可检测的电磁辐照，特别是光。检测器单元例如是人眼、相机、红外相机(IR相机)、UV感光相机(UV＝紫外光)、CCD(电荷耦合器件)相机、激光扫描显微镜的检测器和/或CMOS(互补金属氧化物半导体)芯片。

观察辐照的波长选自200至2000nm的波长范围，因此样品定界元件可用于显微术用途的广泛领域。

在样品定界元件的其他实施例中，观察辐照的波长选自200至850nm的波长范围，例如选自380至780nm的波长范围。

平均孔径是在0.5nm至100nm的数值范围中。为了进一步降低发生的散射效应，在1nm至10nm的数值范围中有利地选择平均孔径。

取决于孔梯度的实际配置，沿着孔梯度样品定界元件的光学性质是可调整的。此外，通过孔梯度的配置或样品定界元件内的孔梯度，介质(例如浸没介质)的分布是可调整的。

在样品定界元件的一个特定实施例中，在其中形成两个孔梯度，孔梯度分别从样品定界元件的侧表面出发。侧表面是彼此相对的，使得孔梯度朝向彼此行进。关于材料的每单位体积的孔数目和/或平均孔径，以相互相对的形式形成孔梯度。特别地，孔梯度的每一个具有材料的每单位体积的高孔数目(孔密度)和/或大平均孔径。孔密度和/或平均孔径在相对侧表面的方向上降低。

该实施例支持相应的侧表面处的浸没介质和/或样品介质的穿透。然而由于在样品定界元件的内部非常低以至不存在的孔密度和/或非常低的平均孔径(例如样品定界元件的内部中的平面或无孔层中)，因而两种介质保持彼此分离。

在其他可能实施例中，样品定界元件(特别是其孔)填充有具有已知光学性质的凝固或液体介质，其中凝固或液体介质保持在样品定界元件中。

用具有水浸没式物镜或所谓的“活细胞浸没式物镜”的匹配的有效折射率来实施这样的样品定界元件，或这样的样品定界元件是可以之实施的。因此，与现有技术比较，可以对诸如缓冲液或包埋介质中的样品介质中的样品有利地实现不存在样品定界元件的光学上最佳的情况。

该实施例可以提供具有期望光学性质的样品定界元件，例如形式为已准备的且可立即使用的样品定界元件，该样品定界元件填充有凝固或液体介质。作为示例，这消除了以下方法步骤：用浸没介质使样品定界元件湿润且浸没介质穿透到样品定界元件中，因此可以发生更少的操作错误并且对于实际显微术过程的准备需要更少时间。

纳米多孔材料可以是玻璃、塑料或塑料混合物。例如从US 2003/0229189 A1已知纳米多孔材料的生产。样品定界元件可以例如由US 2003/0229189 A1中和/或“多孔和重构的玻璃”(T.H.Elmer，1992，工程材料手册，4卷，陶瓷和玻璃，427-432)文章中所公开的纳米多孔材料的至少一个构成。

为了生产样品定界元件，可以使用具有至多1000nm的平均孔径和由孔形成的材料体积至少5％比例的纳米多孔材料。

在用于生产样品定界元件的纳米多孔材料的用途的其他配置中，使用对于观察辐照透明的纳米多孔材料并且其平均孔径小于观察辐照的波长。

在这种情况下，观察辐照的波长在200至2000nm的波长范围内，例如在200至780nm的波长范围内，并且在其他实施例中在380nm至780nm的波长范围内。

该目标还在显微术方法中实现。显微术方法包括以下步骤：

提供根据本发明的样品定界元件并且提供样品。所提供的样品定界元件可以已经填充有关凝固或液体介质，特别是填充有浸没介质和/或用样品介质。由样品定界元件将样品定界(例如覆盖或包围)。如果样品定界元件的孔还未填充，则将它们用浸没介质和/或样品介质填充。

该方法然后包括以浸没介质湿润样品定界元件，并且用浸没介质接触浸没式物镜。通过检测穿过浸没式物镜以及穿过样品定界元件的观察辐照的至少一束来观察样品。

可以由人眼进行观察辐照的检测。在其他配置中，使用如上面已解释的检测单元，通过其可选地除观察辐照的检测之外，还使数据技术的采集、储存和/或其评估称为可能。

在显微术方法的一个配置中，将包埋在包埋介质中的样品作为样品提供。

在显微术方法的其他配置中，将包埋样品用样品定界元件来覆盖，其中包埋样品与具有孔的(也就是说多孔的)样品定界元件的侧表面接触。

该显微术方法的配置例如适合于由显微术自动检查包埋样品，因为已经可以保持在样品定界元件下面的气体可以经由孔逸出，并且因此避免了包含不期望的气泡。

作为示例，例如，浸没油、水、甘油或包含水和甘油的混合物可以用作浸没介质。

包括用于安装样品载玻片的样品载玻片安装件的显微镜适合于实施显微术方法。

样品载玻片提供有样品定界元件。在这种情况下，特别是将样品载玻片保持在样品载玻片安装件，并且由样品定界元件来定界位于样品载玻片上、中、处或下方的样品。

在一种根据本发明的显微镜的发展实施例中，所述显微镜包括浸没介质互换设备。

浸没介质互换设备包括用于向根据本发明的样品定界元件给送浸没介质的浸没介质给送器。样品定界元件存在于保持在样品载玻片安装件中的在样品载玻片上，特别是用样品定界元件将位于样品载玻片上的样品定界，例如覆盖。

浸没介质互换设备还包括泵单元和控制单元，该泵单元用于浸没介质从供应容器穿过浸没介质给送器去往样品定界元件的受控传输，并且该控制单元驱动泵单元。

浸没介质互换设备能够交换浸没介质，而不必出于该目的互换样品和/或浸没式物镜。

此外，可以借助于以下事实有利地使像差的校正成为可能：如所需要，将当前所使用的浸没介质交换为具有不同折射率的不同浸没介质，并且可以校正从而确定的像差。

作为示例，在其它实施例中，浸没介质互换设备借助于当前所使用的浸没介质是连续地或在特定时间点可交换的或被交换的事实，使得对样品定界元件的和/或样品的浸没介质进行温度调节。

根据本发明的样品定界元件、根据本发明的显微术方法和根据本发明的显微镜以及用于生产根据本发明的样品定界元件的纳米多孔材料的用途在每个情况下有利地使样品定界元件的折射率能够近似于或可近似于浸没介质的折射率。由样品定界元件的效应(例如由于样品定界元件的厚度的波动)引起的像差、楔形像差和/或倾斜有利地降低。

对于根据本发明的显微镜而言，不再需要将具有相应浸没介质的浸没式物镜的传统物镜清单保持可用。对于显微镜用户而言有利地实现了一个或多个浸没式物镜的用途的较大灵活性。此外，因为根据本发明的样品定界元件引起降低的像差，所以图像优化是可自动化的并且校正功能可以完全省去。因此，可以将显微镜的光学设计简化而不损失品质。

附图说明

下面基于示例性实施例和附图更详细地解释本发明。附图中：

图1示出了与样品、浸没介质和显微镜的浸没式物镜一起的样品定界元件的第一示例性实施例的示意图。

图2示出了与样品、浸没介质和显微镜的浸没式物镜一起的样品定界元件的第二示例性实施例的示意图。

图3示出了与样品、浸没介质和显微镜的浸没式物镜一起的样品定界元件的第三示例性实施例的示意图。

图4示出了与样品、浸没介质和显微镜的浸没式物镜一起的样品定界元件的第四示例性实施例的示意图。

图5示出了与样品、浸没介质和显微镜的浸没式物镜以及显微镜的照明物镜一起的样品定界元件的第五示例性实施例的示意图。

图6示出了具有浸没介质互换设备的显微镜的一个示例性实施例的示意图。

图7a示出了在第一方法状态下显微术方法的一个配置的示意图。

图7b示出了在第二方法状态下显微术方法的一个配置的示意图。

图7c示出了在第三方法状态下显微术方法的一个配置的示意图。

具体实施方式

参考示意图解释示例性实施例。相同的附图标记指代相同的技术元件。

在图1至5中部分示出的显微镜6是适合于使用浸没式物镜5的显微术的显微镜6。出于清楚的原因，显微镜6仅仅在示意图中示出，并且仅示出了与描述有关的显微镜6的部件。

样品覆盖元件1的第一示例性实施例在图1中与样品3、浸没介质4和显微镜6的浸没式物镜5一起示出。

将样品定界元件1以一个侧表面(其称为样品侧侧表面1.1)放置在样品3上，并且覆盖朝向顶部的所述样品。

样品3由生物材料(例如组织)构成并且被引入到样品介质中，以防止生物材料经受结构改变(例如由于组织的细胞的渗透压不足因而萎陷(collapse))，并且以抵消生物材料的降解。样品3的原生性质由样品介质至少临时地维持。

术语样品3以广义的方式用于将要观察的材料(例如生物材料)，并且包含存在的样品介质。

在样品定界元件1的物镜侧侧表面1.2上，施加以浸没油形式的浸没介质4，并且该浸没介质4将物镜侧侧表面1.2和实施为油浸没式物镜的浸没式物镜5之间的空间填充。此外，一定比例的浸没介质4已经穿透到孔2中，由此用浸没介质4填充样品定界元件1。

样品3位于样品载玻片7上(参见图6和7a至7c)，该样品载玻片7相对于显微镜6的光学轴线6.1由显微镜6的样品载玻片安装件8(参见图6)来保持。

浸没式物镜5沿着光学轴线6.1在Z方向Z上可调整地布置在显微镜6上。

浸没式物镜5设定在Z方向Z上并且聚焦到焦平面10中，使得观察辐照9从焦平面10穿过样品定界元件1、浸没介质4、显微镜6的浸没式物镜5和其他光学元件(未示出)是可检测的。

用实线由观察辐照9的束的边缘线的路线图示了观察辐照9。边缘射线的路线示意性指示了，在从样品3传输到样品定界元件1以及从样品定界元件1传输到浸没介质4时观察辐照9的折射条件。

仅出于比较的目的，图1用断划线示出了该观察辐照9的束的边缘线的路线，如观察辐照9在使用常规盖玻片的情况下将表现的。

可见，特别是在浸没介质4和样品定界元件1之间的边界处，与使用根据本发明的样品定界元件1的情况相比，使用常规盖玻片的情况下观察辐照9折射至更大程度。

样品定界元件1由具有开放孔隙率的纳米多孔材料构成，其中该纳米多孔材料沿着孔梯度11(用三角形表示)遍布着孔2。从物镜侧侧表面1.2出发、在相对的样品侧侧表面1.1的方向上的孔2以降低的孔密度(也就是说以纳米多孔材料的每单位体积的孔2的递减数目)分布。在样品侧侧表面1.1处，无孔层12形成在纳米多孔材料中，所述无孔层防止填充孔2的浸没介质4与样品3和/或与样品介质混合。

孔2具有5nm的平均孔径。在示例性实施例中，样品定界元件的纳米多孔材料的由孔体积构成的(平均)体积比例(所述比例称为体积分数

)是0.2或20％。

基于5nm的平均孔径和0.2的体积分数

根据米氏散射理论确定0.0028/mm的散射系数。给定样品定界元件1的厚度d为0.17mm，所确定的散射系数几乎不会是不利的。

在图2中的第二示例性实施例中示出了根据本发明的样品定界元件1的第二示例性实施例，其中两个孔梯度11以相对于彼此的相对的形式形成。相应孔梯度11在Z方向Z上从样品侧侧表面1.1并从物镜侧侧表面1.2出发来形成。在这种情况下，在孔梯度11的每一个中，孔密度朝着样品定界元件1的中心降低，使得无孔层12存在于样品定界元件1的中心。无孔层12防止样品3的污染物和/或样品介质与浸没介质4混合。

从样品侧侧表面1.1，样品3可以从样品侧侧表面1.1出发穿透到孔梯度11的孔2中，和/或样品3已经穿透到孔2中。

浸没介质4可以从物镜侧侧表面1.2出发穿透到孔梯度11的孔2中，和/或浸没介质4已经穿透到孔2中。

在样品定界元件1的其他实施例中，通过除变化的孔密度之外或附加于变化的孔密度的孔2的平均孔径的变换来形成孔梯度11中的至少一个。

此外，样品定界元件1的其他实施例中，在X方向X和/或Y方向Y上在样品定界元件1的范围中形成一个或多个孔梯度11。

如果多个孔梯度11形成在样品定界元件1中，则它们可以在样品定界元件1的其他实施例中彼此相同地形成。作为示例，孔梯度11的孔密度和/或平均孔径在相同的X、Y和/或Z方向上增大或减小。

此外，如在图3中样品定界元件1的第三示例性实施例所示出的，根据本发明的样品定界元件1可以包括一个或多个密封层13。样品定界元件1包括在物镜侧侧表面1.2上的液体密封的密封层13。

尽管样品3可以穿透和/或已经穿透到孔2中，但是除了无孔层12，密封层13也防止浸没介质4穿透到孔2中。密封层13与无孔层12一起保持将浸没介质4和样品3彼此分开。

在其它实施例中，密封层13由膜和/或由涂层形成。密封层13还可以是功能性涂层并且使细胞能够生长。

在样品定界元件1的其它实施例中，在样品侧侧表面1.1处或上形成密封层13。

在侧表面1.1、1.2中的一个处的密封层13可以由短暂加热和纳米多孔材料的微结构的相关联改变来制造。在其它实施例中，例如通过在侧表面1.1、1.2上印刷、涂漆、溅射、粘合接合、旋涂和/或层压来生产密封层13。

在图4中示出包括在样品侧侧表面1.1上和在物镜侧侧表面1.2两者上的相应密封层13的样品定界元件1。

在这种情况下，用具有已知光学性质的凝固或液体介质14填充孔2。这样的样品定界元件1的折射率最佳地可调整到期望的有效折射率n_eff，例如水的有效折射率。以这种方法调整的样品定界元件1可直接用于显微术，并且可以提供为预先制造的形式或已经以预先制造的形式提供。在孔梯度11中的相应的介质14可以具有不同光学性质，并且例如适合于样品介质和/或适合于浸没介质4。

在其他可能实施例中，所有侧表面设置有密封层13。孔2用具有已知光学性质的凝固或液体介质14填充，该介质保持在样品定界元件1中。

如图5中所示出的样品定界元件1的第五示例性实施例的情况下，所述样品定界元件实施为中空圆柱体，其内圆柱表面是样品侧侧表面1.1并且其外圆柱表面是物镜侧侧表面1.2。

显微镜6的浸没式物镜5以其光学轴线6.1取向，光学轴线6.1与样品定界元件1的圆柱体纵向轴线1.3正交，并且经由浸没介质4与物镜侧侧表面1.2接触。

此外，显微镜6的照明物镜25以与圆柱体纵向轴线1.3和与光学轴线6.1正交地取向的方式存在。

以简化形式示出的样品3存在于样品定界元件1中，并且由侧表面1.1、1.2包围。通过照明物镜25，样品3被照明或者是可照明的。

如果将浸没式物镜5的光学轴线6.1和由照明物镜25实现的照明被导向到样品定界元件1内的相同空间中，则可以通过浸没式物镜5观察以此方式照明的样品3。

在这种情况下，为了避免来自样品3的离焦区域的不期望的杂散辐照，如果在窄定界体积中(例如在所谓的光片中)实现照明则是有利的。

可以在样品定界元件1中用已经例如在关于第一至第四示例性实施例的任一个中所解释的方式来分布并且形成孔2。

除了样品定界元件1的第五示例性实施例之外，在图5中所示出的布置示意性示出了以光片显微镜和/或激光扫描显微镜的形式的显微镜6。

为了能够有效地使用样品定界元件1，诸如图6中所示出的修改的显微镜6是有利的。

显微镜6包括安装样品载玻片7的样品载玻片安装件8。此外，存在浸没介质互换设备18。后者包括向样品定界元件1给送浸没介质4的浸没介质给送器20。浸没介质给送器20连接于泵单元19，用于浸没介质4从供应容器(未示出)穿过浸没介质给送器20去往样品定界元件1的受控输送。通过控制单元21，泵单元19是可驱动的。

通过光源23，照明辐照和/或激励辐照是可发生的并且可提供的。通过所提供的照明辐照和/或激励辐照，样品3是可照明的和/或可激励的。

通过检测单元22，观察辐照9是可检测的。光源23和检测单元22以适合于数据交换的方式连接于控制单元21并且是通过控制单元21可驱动的。所检测的观察辐照9的数据由检测单元22可通信到控制单元21。控制单元21配置为储存和/或评估所检测的观察辐照9的所通信的数据。

取决于所检测的观察辐照9的数据和/或取决于在其评估期间所确定的结果，泵单元19、检测单元22、光源23、用于在Z方向Z上调整浸没式物镜5的驱动器24和/或可选地用于在XY平面XY中调整样品载玻片安装件8的驱动器24是可驱动的。

在这种情况下，观察辐照9可以是照明辐照和/或激励辐照的反射的部分。在显微镜6的其他实施例中和在显微术方法的其他配置中，观察辐照9是由激励辐照带来的辐照，例如荧光辐照。

可选地，在显微镜6的其他实施例中，设置了用于将所交换浸没介质4传输掉的浸没介质排放器。

此外，在显微镜6的其他实施例中，存在用于检测样品定界元件1的、样品3的和/或浸没介质4的温度的至少一个传感器。

样品定界元件1的上述实施例，可选地与显微镜6的实施例一起可用在显微术方法中。为了该目的，提供样品定界元件1和将要观察的样品3。将样品3施加或放置到样品载玻片7上，并且由样品定界元件1来定界，例如覆盖或包围。之后，物镜侧侧表面1.2用浸没介质4湿润。浸没式物镜5与浸没介质4接触。出于产生、激励和/或提供观察辐照9的目的，用照明辐照和/或激励辐照照明样品。

通过检测穿过浸没式物镜5以及穿过样品定界元件1的观察辐照9的至少一束来观察样品3。

在一个可能的配置中，显微术方法适合于观察包埋样品3。在观察之前，如图7a所示出的，提供包埋在包埋介质15中的样品3。包埋介质15包含非期望的气泡16。

如图7b中所示出的，在Z方向Z上通过操作器17将样品定界元件1放置到包埋的样品3上，该样品定界元件1的样品侧侧表面1.1是多孔的并且不具有液体密封的密封层13。由于这里在包埋的样品3上产生的力的影响，将一些气泡16在X和/或Y方向X、Y上横向地从包埋的样品3逐出。

未横向地被逐出的气泡16穿过样品侧侧表面1.1进入样品定界元件1，穿过样品定界元件1的孔2(参见图1至4)到样品3的环境中并且以这种方式被从包埋样品3移除。

在图7c中，操纵器17在Z方向Z上被从样品定界元件1抬离并且被移除。包埋样品3由样品定界元件1覆盖。

样品定界元件1呈现(assume)包埋介质15的折射率。在其他显微术方法中，选择浸没介质4并且将其施加到样品定界元件1，其折射率匹配包埋介质15的折射率，也就是说是相似的或相同的。

在该方法的其他配置中，包埋样品3的覆盖和浸没介质4的交换是自动的。

附图标记

1 样品定界元件

1.1 样品侧侧表面

1.2 物镜侧侧表面

1.3 圆柱体纵向轴线

2 孔

3 样品

4 浸没介质

5 浸没式物镜

6 显微镜

6.1 光学轴线

7 样品载玻片

8 样品载玻片安装件

9 观察束

10 焦平面

11 孔梯度

12 无孔层

13 密封层

14 介质

15 包埋介质

16 气泡

17 操纵器

18 浸没介质互换设备

19 泵单元

20 浸没介质给送器

21 控制单元

22 检测单元

23 光源

24 驱动器

25 照明物镜

D 厚度

Claims (7)

1.一种样品定界元件(1)，其至少在一个区域中由纳米多孔材料构成，所述纳米多孔材料对于通过显微镜(6)可捕捉的至少一个观察辐照(9)是透明的，其中所述纳米多孔材料具有孔(2)，所述孔的平均孔径小于所述观察辐照(9)的波长，并且

-所述纳米多孔材料的体积的至少5％的比例由至少在所述纳米多孔材料的部分中的所述孔(2)占据，其特征在于

-所述观察辐照(9)的波长选自200至2000nm的波长范围，

-所述纳米多孔材料具有开放孔隙率，

-所述平均孔径在0.5nm至100nm的数值范围中，

-所述纳米多孔材料的每单位体积的孔(2)数目和/或平均孔径沿着所述样品定界元件(1)的至少一个范围改变，使得在所述样品定界元件(1)中形成孔梯度(11)，并且

-所述孔梯度(11)具有其中不存在孔隙率的至少一个梯度部分，使得通过所述样品定界元件(1)实现所述样品定界元件(1)的一个侧表面(1.1，1.2)上的样品介质(3)与所述样品定界元件(1)的相对的侧表面(1.1，1.2)上的浸没介质(4)的分离，

-从所述样品定界元件(1)的两个相互相对的侧表面(1.1，1.2)出发来形成相应的孔梯度(11)，其中关于所述材料的每单位体积的孔(2)的数目和/或所述平均孔径以相互相对的形式形成所述孔梯度(11)。

2.根据权利要求1所述的样品定界元件(1)，其特征在于，所述平均孔径在1nm至10nm的数值范围中。

3.根据前述权利要求中任一项所述的样品定界元件(1)，其特征在于，用具有已知光学性质的凝固或液体介质填充所述孔(2)，其中在所述样品定界元件(1)中保持所述凝固或液体介质。

4.根据权利要求1或2所述的样品定界元件(1)，其特征在于，所述纳米多孔材料是玻璃、塑料或塑料混合物。

5.一种显微术方法，包括以下步骤：

-提供如权利要求1或2所述的样品定界元件(1)，

-提供样品(3)，

-用所述样品定界元件(1)覆盖所述样品(3)，

-用浸没介质(4)和/或用样品介质(3)填充如权利要求1或2所述的样品定界元件(1)的孔(2)，

-用浸没介质(4)湿润所述样品定界元件(1)，

-用所述浸没介质(4)接触浸没式物镜(5)，以及

-通过检测穿过所述浸没式物镜(5)并穿过所述样品定界元件(1)的观察辐照(9)的至少一束来观察所述样品(3)。

6.根据权利要求5所述的显微术方法，其特征在于，将包埋在包埋介质(15)中的样品(3)提供为样品(3)。

7.一种用于进行如权利要求5所述的方法的显微镜(6)，所述显微镜包括用于安装样品载玻片(7)的样品载玻片安装件(8)，

其特征在于

-存在提供有如权利要求1至4中任一项所述的样品定界元件(1)的样品载玻片(7)，

-浸没介质互换设备(18)，其中所述浸没介质互换设备(18)包括

-浸没介质给送器(20)，所述浸没介质给送器(20)将浸没介质(4)给送到如权利要求1至4中任一项所述的样品定界元件(1)，

-泵单元(19)，所述泵单元(19)控制所述浸没介质(4)的从供应容器通过所述浸没介质给送器(20)去往样品定界元件(1)的输送，以及

-控制单元(21)，所述控制单元(21)用于驱动所述泵单元(19)。

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