DE102017204325A1 - Anordnung, Mikroskop und Verfahren zur TIRF-Mikroskopie - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung (1) zur TIRF-Mikroskopie, umfassend eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv (2) zur Beleuchtung einer auf einem Probenträger (7) in einem Probenbereich einer Probenebene (4) befindlichen Probe (5) über einen Beleuchtungsstrahlengang, wobei die optische Achse (A1) des Beleuchtungsobjektivs (2) mit der Normalen (B) der Probenebene (4), hinsichtlich welcher der Probenträger (7) ausgerichtet ist, einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel (α1) einschließt. Eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv (3) in einem Detektionsstrahlengang schließt zwischen dessen optischer Achse (A2) und der Normalen (B) der Probenebene (4) einen von Null verschiedenen Detektionswinkel (a2) ein.Erfindungsgemäß ist zwischen dem Probenträger (7) und den Objektiven (2, 3) ein Übergangselement (10) vorhanden, das sowohl in dem Beleuchtungsstrahlengang (BS) als auch in dem Detektionsstrahlengang (DS) angeordnet ist. Das Übergangselement (10) ist zur Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des Durchtritts von zu detektierender Strahlung und/oder von Strahlung zur Beleuchtung der Probe (5) durch Medien unterschiedlicher Brechungsindizes entstehen, ausgebildet. Der Beleuchtungsstrahlengang ist unter einem zur Erzeugung einer Totalreflexion der Beleuchtungsstrahlung (BS) an der Probenebene (4) geeigneten Beleuchtungswinkel (α1) in den Probenbereich der Probenebene (4) gerichtet.Die Erfindung betrifft außerdem ein Mikroskop (0) mit der Anordnung (1) sowie ein Verfahren zur TIRF-Mikroskopie.

Description

• Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Totalreflexionsmikroskopie (TIRF-Mikroskopie), insbesondere der TIRF-Lichtblattmikroskopie, gemäß dem Oberbegriff des unabhängigen Anspruchs 1. Die Erfindung betrifft ferner eine Verwendung der Anordnung, ein Mikroskop sowie ein Verfahren zur TIRF-Mikroskopie.
• Bei der Totalreflexionsmikroskopie, auch als TIRF-Mikroskopie (total internal reflection fluorescence microscopy) bezeichnet, werden evaneszente Felder erzeugt und eingesetzt, um beispielsweise Strukturen und Vorgänge an der Oberfläche und den oberflächennahen Schichten einer Probe zu beobachten. Dazu wird eine evaneszente Beleuchtung, auch als TIRF-Feld, als evaneszente Welle oder als evaneszentes Feld bezeichnet, in mindestens einen Bereich der Probe eingekoppelt. Zur Erzeugung eines evaneszenten Feldes wird der Umstand ausgenutzt, dass trotz einer auftretenden Totalreflexion von Beleuchtungsstrahlung (Licht) an einer Grenzfläche Licht über die Grenzfläche hinaus in das Medium jenseits der Grenzfläche, beispielsweise in die Probe, eindringt und dort schnell abklingt. Es kann zum Beispiel das evaneszente Feld eines optischen Wellenleiters oder das evaneszente Feld resultierend aus der Totalreflexion an einer optischen Grenzfläche, wie zum Beispiel einem Deckglas, genutzt werden.
• Enthält die Probe Moleküle, die durch das Licht (Beleuchtungsstrahlung) des evaneszenten Feldes zur Emission einer Detektionsstrahlung anregbar sind, beispielsweise zur Fluoreszenz, können im Bereich des evaneszenten Feldes diese Moleküle zur Emission der Detektionsstrahlung angeregt werden. Die Detektionsstrahlung kann mittels geeigneter Detektoren erfasst und ausgewertet werden.
• Ein Aufbau eines Mikroskops 0 für die Lichtblattmikroskopie (SPIM-Aufbau; Single Plane Illumination Microscopy; 1a und 1b) gemäß dem Stand der Technik umfasst ein Beleuchtungsobjektiv 2 mit einer ersten optischen Achse A1 und ein Detektionsobjektiv 3 mit einer zweiten optischen Achse A2 (nachfolgend auch als SPIM-Objektive bezeichnet), die jeweils unter einem Winkel α1 beziehungsweise α2 von 45° zu einer Probenebene 4 und einem rechten Winkel zueinander von oben auf die Probenebene 4 gerichtet sind (siehe 1a). Dieser Ansatz bietet den Vorteil einer hohen Auflösung in axialer Richtung, da mittels des Beleuchtungsobjektivs 2 ein dünnes Lichtblatt 6 (siehe auch 1b) in einer Bildebene BE erzeugt werden kann. Aufgrund der höheren Auflösung können kleinere Proben 5 untersucht werden. Zusätzlich wird die störende Hintergrundfluoreszenz deutlich reduziert und damit das Signal/Hintergrund-Verhältnis verbessert. Das Lichtblatt 6 erstreckt sich in den 1a und 1b entlang der Bildebene BE in die Ebene der Zeichnungen hinein, der Leser sieht also eine Stirnseite des Lichtblatts 6.
• Eine in der Probenebene 4, die auch als Bezugsebene genutzt wird, in einem dafür vorgesehenen Probenbereich angeordnete Probe 5 befindet sich zum Beispiel auf dem Boden einer als Petrischale ausgebildeten Probenhalterung 7. Die Probenhalterung 7 ist mit einem Medium 8, beispielsweise Wasser, gefüllt und die beiden SPIM-Objektive 2, 3 sind während der Anwendung der Lichtblattmikroskopie in das Medium 8 eingetaucht (nicht gezeigt). Die Probenebene 4 erstreckt sich in einer durch die X-Achse X und die Y-Achse Y eines kartesischen Koordinatensystems (leicht perspektivisch dargestellt) aufgespannten Ebene X-Y. Die erste optische Achse A1 und die zweite optische Achse A2 verlaufen in einer durch die Y-Achse Y und die Z-Achse Z des kartesischen Koordinatensystems aufgespannten Ebene Y-Z.
• Um eine einfachere Probenpräparation in Standard-Probenbehältern wie z. B. Multiwellplatten zu ermöglichen, kann die 45°-Konfiguration zwar beibehalten werden, aber die beiden SPIM-Objektive 2, 3, insbesondere deren optische Achsen A1, A2, sind in einer inversen Anordnung von unten durch den transparenten Boden der Probenhalterung 7 in die Probenebene 4 gerichtet. Die 1b zeigt schematisch ein Mikroskop 0 mit einer inversen Anordnung von Beleuchtungsobjektiv 2 und Detektionsobjektiv 3 gemäß dem Stand der Technik, bei dem das Beleuchtungsobjektiv 2 und das Detektionsobjektiv 3 unterhalb der Probenebene 4 angeordnet sind. Die Winkel α1 und α2 betragen wieder je 45°.
• In dieser Anordnung müssen die durch die relativ zu den optischen Achsen A1 und A2 geneigte und in Form beispielsweise eines Deckglases vorhandene Probenhalterung 7 hervorgerufenen Aberrationen durch spezielle optische Elemente korrigiert werden. Durch den Boden der Probenhalterung 7 wird die in der Probenebene 4 angeordnete Probe 5 beleuchtet und eine angeregte Fluoreszenz der Probe 5 detektiert. Es können Probenhalter 7, wie z. B. Multiwellplatten, Petrischalen und/oder Objektträger genutzt und eine Kontamination der Proben 5, insbesondere beim High-Throughput-Screening, vermieden werden.
• Aus der DE 10 2013 112 600 A1 ist ein Virtuelles Relay bekannt, das zur Korrektur von Fehlern dient, die bei einem schiefen Durchgang der Strahlen durch einen Objektträger entstehen. Da das Virtuelle Relay eine hohe Numerische Apertur > 1,2 aufweist, können durch geringe Abweichung innerhalb des optischen Systems, die von Experiment zu Experiment verschieden sein können, ausgeprägte Abbildungsfehler auftreten. Die Abweichungen können u.a. auf der Varianz der Deckglasdicke, Temperaturänderungen, Brechzahlunterschiede, Verkippung des Deckglases oder Keilfehlern des Deckglases beruhen.
• Eine weitere Möglichkeit zur Korrektur von Aberrationen eines Mikroskops, die durch ein Deckglas bedingt sind, ist aus der Publikation von McGorty et al. (2015: Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens; OPTICS EXPRESS 23: 16142 - 16153) bekannt. Das inverse SPIM-Mikroskop weist ein Wasserprisma auf, durch dessen Wirkung Aberrationen teilweise kompensiert werden, die infolge des schrägen Durchgangs des Detektionslichts durch das Deckglas auftreten.
• Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Anordnung und ein neues Mikroskop sowie deren Verwendung zur TIRF-Mikroskopie anzugeben.
• Die Aufgabe wird durch eine Anordnung zur TIRF-Mikroskopie gemäß dem Anspruch 1 gelöst. Hinsichtlich des Mikroskops und der Verwendung zur TIRF-Mikroskopie wird die Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 7 beziehungsweise 8 gelöst. Hinsichtlich des Verfahrens ist die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 9 gelöst. Vorteilhafte Ausführungen und Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
• Die Anordnung umfasst eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv zur Beleuchtung einer auf einem Probenträger in einem Probenbereich befindlichen Probe über einen Beleuchtungsstrahlengang, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs mit der Normalen einer Bezugsebene, hinsichtlich welcher der Probenträger ausgerichtet ist, einen von Null verschiedenen Winkel (Beleuchtungswinkel) einschließt. Weiterhin ist eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv in einem Detektionsstrahlengang vorhanden. Die optische Achse des Detektionsobjektivs schließt mit der Normalen der Bezugsebene einen von Null verschiedenen Winkel (Detektionswinkel) ein.
• Erfindungsgemäß ist zwischen dem Probenträger und den beiden Objektiven ein Übergangselement vorhanden, das sowohl in dem Beleuchtungsstrahlengang als auch in dem Detektionsstrahlengang angeordnet ist. Das Übergangselement ist zur Korrektur von Aberrationen ausgebildet, die aufgrund des Durchtritts von zu detektierender Strahlung, insbesondere von Licht, beziehungsweise von Strahlung zur Beleuchtung der Probe durch Medien unterschiedlicher Brechungsindizes entstehen. Der Beleuchtungsstrahlengang ist unter einem zur Erzeugung einer Totalreflexion der Beleuchtungsstrahlung an der Probenebene geeigneten Beleuchtungswinkel in den Probenbereich der Probenebene gerichtet.
• Die Normale der Bezugsebene und die optischen Achsen des Beleuchtungsobjektivs und des Detektionsobjektivs liegen vorteilhaft in derselben Ebene. In weiteren möglichen Ausführungen liegen die Normale der Bezugsebene und die optischen Achsen des Beleuchtungsobjektivs in einer Ebene, während die optische Achse des Detektionsobjektivs nicht in dieser Ebene liegt.
• Der Beleuchtungsstrahlengang ist auch zur Erzeugung einer Totalreflexion der Beleuchtungsstrahlung an der Probenebene geeignet, wenn sich die Beleuchtungsstrahlung leicht divergierend ausbreitet und totalreflektiert wird oder wenigstens Anteile der Beleuchtungsstrahlung an der Probenebene totalreflektiert werden.
• In der Probenebene, die auch als Bezugsebene bezeichnet wird, ist die Probe in einem dafür vorgesehenen Bereich, den Probenbereich, angeordnet oder kann dort angeordnet werden.
• Die TIRF-Beleuchtung kann, falls nicht ausdrücklich anders beschrieben, punktförmig, linienförmig, ringförmig, flächig oder über eine Beleuchtungsfläche mit frei wählbarer Form erfolgen.
• Da die Erfindung vorteilhaft auf derzeit bereits verfügbaren Anordnungen beziehungsweise Mikroskopen aufbaut, können in dem Beleuchtungsstrahlengang und/oder in dem Detektionsstrahlengang Beleuchtungskorrekturelemente beziehungsweise Detektionskorrekturelemente wie etwa Alvarezplatten vorhanden sein. Diese Beleuchtungskorrekturelemente und/oder Detektionskorrekturelemente werden nachfolgend zur Vereinfachung der Beschreibung auch Korrekturelement beziehungsweise Korrekturelemente genannt, wenn sich die Beschreibung auf ein Beleuchtungskorrekturelement oder auf ein Detektionskorrekturelement, oder auf beide, bezieht.
• Vorhandene Korrekturelemente sind während der Verwendung der Anordnung und/oder des Mikroskops zur TIRF-Mikroskopie entweder aus den jeweiligen Strahlengängen entfernt, beispielsweise ausgeschwenkt oder ausgerückt, oder optisch inaktiviert, z.B. in eine Nullstellung überführt.
• In vorteilhaften Ausführungen der Anordnung ist zwischen dem Übergangselement und dem Probenträger ein Immersionsmedium vorhanden, dessen optischer Brechungsindex gleich dem optischen Brechungsindex des Übergangselements und/oder des Probenträgers ist. Ein solches Immersionsmedium führt dazu, dass nachteilige Wirkungen eines Übergangs der Beleuchtungsstrahlung und einer auftretenden Detektionsstrahlung durch Medien unterschiedlicher Brechungsindizes reduziert oder vermieden werden. Damit werden auftretende Aberrationen aufgrund des schrägen Durchgangs von Beleuchtungsstrahlung und Detektionsstrahlung, insbesondere durch den Probenträger, vermieden oder zumindest erheblich reduziert. Aberrationen beim Übergang von Beleuchtungsstrahlung und/oder Detektionsstrahlung zwischen einer der Probe zugewandten Seitenfläche des Probenträgers und der Probe sind unbeachtlich, da ein Bild der Probe aufgrund der geringen Eindringtiefe eines evaneszenten Feldes einer TIRF-Beleuchtung nahe dem Übergang von Probenträger und Probe aufgenommen wird.
• Beispielsweise können das Übergangselement und der Probenträger aus Glas bestehen. Das Immersionsmedium weist einen Brechungsindex auf, insbesondere unter üblichen Verwendungsbedingungen der Anordnung, beispielsweise bei Temperaturen zwischen 15 und 35 C, die dem Brechungsindex von Glas entspricht. Dabei werden Abweichungen der Brechungsindizes von nicht mehr als 0,1, vorzugsweise von nicht mehr als 0,05, voneinander als einander gleich verstanden.
• Das Immersionsmedium mit einem optischen Brechungsindex gleich dem Brechungsindex von Übergangselement und/oder Probenträger ist beispielsweise ein Öl, ein Ölgemisch, ein ölhaltiges Gemisch oder eine geeignete Flüssigkeit mit den entsprechenden optischen Eigenschaften und einer hinreichenden Transparenz für die Beleuchtungsstrahlung und die Detektionsstrahlung.
• Das Übergangselement ist in einer möglichen Ausführungsform eine Meniskuslinse, wobei zwischen dieser und dem Probenträger ein wie vorstehend beschriebenes Immersionsmedium vorhanden ist.
• Eine Meniskuslinse ist eine Linse, die zwei nach derselben Seite gekrümmte Linsenflächen besitzt. Vorteilhaft weisen die beiden Linsenflächen denselben Mittelpunkt auf. Die beiden Linsenflächen der Meniskuslinse können sich in unterschiedlichen Medien, beispielsweise Immersionsmedien und/oder Luft, mit jeweils unterschiedlichem Brechungsindex befinden. Die Meniskuslinse hat gegenüber einem Virtuellen Relay den Vorteil, dass sie einfacher und kostengünstiger herzustellen ist.
• In weiteren Ausführungen ist das Übergangselement als ein Virtuelles Relay oder eine Immersionskammer ausgebildet. Die Immersionskammer wird zur Verwendung der Anordnung zur TIRF-Mikroskopie mit dem Immersionsmedium gefüllt.
• Unter einem Virtuellen Relay versteht man eine Linse, die ein vergrößertes virtuelles Bild der Probe auf der Probenseite erzeugt. Mit einem Mikroskopobjektiv wird dieses Bild auf eine Kamera abgebildet. Zusätzlich haben eine oder beide Seiten des Virtuellen Relays eine asphärische Form, wodurch die Aberrationen des schiefen Deckglasdurchgangs kompensiert werden können.
• Das Virtuelle Relay ist derart ausgebildet, dass eine Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des schrägen Durchgangs von Beleuchtungsstrahlung und/oder Detektionsstrahlung auftreten, durch eine entsprechende Gestaltung der Innenseite des Virtuellen Relays erfolgt. Die Innenseite ist die dem Probenträger zugewandte Fläche oder Seitenfläche des Virtuellen Relays.
• Zur Verwendung der Anordnung mit einer Meniskuslinse oder mit einem Virtuellen Relay als Übergangselement können die Objektive als Trockenobjektive ausgebildet sein.
• Bei einer Verwendung der Immersionskammer als Übergangselement sind die Objektive als Immersionsobjektive ausgebildet.
• Die Anordnung kann ein Trennschichtsystem mit mindestens einer Schicht aus einem vorgegebenen Material mit vorgegebener Dicke aufweisen. Die mindestens eine Schicht, beispielsweise ein Deckglas, trennt ein Medium, in welchem sich die Probe befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv und dem Detektionsobjektiv oder von der Meniskuslinse oder von dem virtuellen Relay. Das Trennschichtsystem steht mit einer parallel zur Bezugsebene ausgerichteten Grundfläche zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv für Beleuchtung beziehungsweise Detektion zugänglichen Bereich mit dem Medium und/oder mit einem Immersionsmedium in Kontakt. Das Medium und das Immersionsmedium sind durch das Trennschichtsystem voneinander separiert.
• Um eine Anordnung zur TIRF-Lichtblattmikroskopie zu realisieren, ist eine zur Beleuchtung verwendete Strahlung (Beleuchtungsstrahlung) zu einem Lichtblatt geformt und in den Probenbereich gerichtet. In alternativen Ausführungen wird das Lichtblatt mittels der Beleuchtungsstrahlung in dem Probenbereich erzeugt, indem beispielsweise ein Strahlenbündel der Beleuchtungsstrahlung in der Ebene bewegt wird (dynamisches Lichtblatt).
• In einer vorteilhaften Ausführung liegen die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und das Lichtblatt in einer Ebene, die mit der Normalen der Bezugsebene einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel einschließt. Eine Normale des Lichtblatts, das sich in einer Ebene (Bildebene) erstreckt, verläuft vorzugsweise in einer durch die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die Normale der Bezugsebene aufgespannten Ebene. Die optische Achse des Detektionsobjektivs verläuft vorteilhaft ebenfalls in dieser Ebene. Diese Ausführung lässt eine flache Bauart zu. Die Ebene des Lichtblatts durchdringt daher die Bezugsebene und die Normale des Lichtblatts durchstößt die Bezugsebene.
• In einer weiteren möglichen Ausführung liegt die Normale der Bezugsebene in derselben Ebene wie die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und das Lichtblatt beziehungsweise die Bildebene. Die Normale des Lichtblatts verläuft orthogonal zur derjenigen Ebene, in der die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs, die Normale der Bezugsebene und das Lichtblatt beziehungsweise die Bildebene liegen. Die optische Achse des Detektionsobjektivs ist auf die Ebene gerichtet, um Bilddaten aus der Bildebene zu erfassen.
• Die erfindungsgemäße Anordnung ist insbesondere in einem inversen Lichtblattmikroskop mit schrägem Durchgang der Beleuchtungs- und Detektionsstrahlung durch eine Probenhalterung beispielsweise in Form eines Deckglases oder einer optisch transparenten Schicht wie dem Boden einer Petrischale verwendbar. Die Anordnung ist vorteilhaft zur Abbildung von Bereichen der Probe mittels TIRF-Mikroskopie, beispielsweise TIRF-Lichtblattmikroskopie, verwendbar. Die Anordnung kann dabei Teil eines Mikroskops sein.
• Um die TIRF-Mikroskopie auszuführen wird eine Beleuchtungsstrahlung zur Beleuchtung einer auf einem Probenträger in einem Probenbereich einer Probenebene befindlichen Probe über einen Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe gerichtet. Dabei schließt die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs mit der Normalen der Probenebene, hinsichtlich welcher der Probenträger ausgerichtet ist, einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel ein. Eine Detektionsstrahlung wird entlang eines Detektionsstrahlengangs erfasst, dessen optische Achse mit der Normalen der Probenebene einen von Null verschiedenen Detektionswinkel einschließt. Die Beleuchtungsstrahlung und die Detektionsstrahlung werden durch ein sowohl in dem Beleuchtungsstrahlengang als auch in dem Detektionsstrahlengang angeordneten Übergangselement eingestrahlt beziehungsweise erfasst, wobei das Übergangselement zur Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des Durchtritts von zu detektierender Strahlung und/oder von Strahlung zur Beleuchtung der Probe durch Medien unterschiedlicher Brechungsindizes entstehen, ausgebildet ist. Der Beleuchtungsstrahlengang wird unter einem zur Erzeugung einer Totalreflexion der Beleuchtungsstrahlung an der Probenebene geeigneten Beleuchtungswinkel in den Probenbereich der Probenebene gerichtet. Die Auswahl des Beleuchtungswinkels kann aufgrund einer Berechnung oder durch eine sukzessive Einstellung verschiedener Beleuchtungswinkel und der mit den jeweiligen Beleuchtungswinkeln erreichten Wirkungen erfolgen. Bei einer Berechnung werden vorteilhaft die optischen Daten verwendeter Objektive, des Übergangselements sowie vorhandener oder auszuwählender Immersionsmedien sowie des Probenträgers und gegebenenfalls der Probe berücksichtigt und beispielsweise in die Berechnung aufgenommen.
• Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Abbildungen näher erläutert. Dabei zeigen:
• 1a eine schematische Darstellung einer Anordnung eines Lichtblattmikroskops gemäß dem Stand der Technik,
• 1b eine schematische Darstellung einer inversen Anordnung eines Lichtblattmikroskops gemäß dem Stand der Technik,
• 2 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Anordnung eines TIRF-Lichtblattmikroskops,
• 3 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Anordnung eines TIRF-Lichtblattmikroskops,
• 4 eine schematische Darstellung der Öffnungswinkel eines Beleuchtungsobjektivs mit einer Numerischen Apertur von 0,4 und eines Detektionsobjektivs mit einer Numerischen Apertur von 1,0 einer erfindungsgemäßen Anordnung eines TIRF-Lichtblattmikroskops und
• 5 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Anordnung eines TIRF-Lichtblattmikroskops.
• Die Darstellung der Ausführungsbeispiele erfolgt schematisch. Gleiche technische Elemente sind mit den gleichen Bezugszeichen versehen.
• Die 1a und 1b wurden bereits im einleitenden Teil der Beschreibung näher erläutert.
• Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele sind beispielhaft anhand inverser Mikroskope 0 dargestellt und können in weiteren Ausführungen auch als aufrechte Mikroskope 0 ausgebildet sein.
• Als wesentliche Elemente einer erfindungsgemäßen Anordnung zur Mikroskopie, insbesondere zur Lichtblattmikroskopie, sind neben dem schräg zur Proben- oder Bezugsebene 4 ausgerichteten Beleuchtungsobjektiv 2 und dem ebenfalls schräg zur Bezugsebene 4 ausgerichteten Detektionsobjektiv 3 ein gemeinsam genutztes Übergangselement 10 (2) vorhanden.
• Ein Ausführungsbeispiel eines zur TIRF-Lichtblattmikroskopie ausgebildeten Anordnung 1 eines inversen Mikroskops 0 (nur angedeutet dargestellt) mit Korrekturelementen 2KE, 3KE und eines Übergangselements 10 in Form einer Meniskuslinse 10.1 ist in 2 dargestellt. Die Winkel α1 und α2 zwischen einer senkrecht auf der Bezugsebene 4 stehenden Normalen B und der ersten optischen Achse A1 beziehungsweise der zweiten optischen Achse A2 betragen 60° beziehungsweise 30° (siehe 4)°. Als adaptive Korrekturelemente 2KE, 3KE sind jeweils zwei Alvarezplatten eines Alvarez-Manipulators 12 in dem Strahlengang der Beleuchtungsstrahlung BS und in dem Strahlengang der Detektionsstrahlung DS angeordnet. Die Korrekturelemente 2KE, 3KE sind bei Verwendung der Anordnung 1 zur TIRF-Lichtblattmikroskopie aus den jeweiligen Strahlengängen entfernt. Die Meniskuslinse 10.1 unterstützt den Übergang der Beleuchtungsstrahlung BS von Luft in ein Immersionsmedium 18 und in das Medium 8 sowie den Übergang der Detektionsstrahlung DS von dem Medium 8 in das Immersionsmedium 18 und in die Luft. Das Immersionsmedium 18 weist einen optischen Brechungsindex auf, der gleich der optischen Brechungsindizes der Meniskuslinse 10.1 und des Probenträgers 7 ist.
• Die Probenhalterung 7 ist auf dem Probentisch 11 gehalten. Der Probentisch 11 selbst ist in einer durch die X-Achse X und die Y-Achse Y aufgespannten X-Y-Ebene mittels nicht näher dargestellter Antriebe gesteuert verstellbar.
• Das Beleuchtungsobjektiv 2 und das Detektionsobjektiv 3 sind jeweils mittels eines Objektivantriebs 14, der hier als ein Piezoantrieb ausgebildet ist, entlang der ersten optischen Achse A1 beziehungsweise entlang der zweiten optischen Achse A2 gesteuert verstellbar.
• Die Beleuchtungsstrahlung BS wird durch ein Lasermodul 15 bereitgestellt und mittels einer Strahlformungseinheit 16 geformt. Die Strahlformungseinheit 16 ist beispielsweise eine Optik, mittels der die bereitgestellte Beleuchtungsstrahlung BS geformt, beispielsweise kollimiert, wird.
• Der Strahlformungseinheit 16 nachgeordnet ist ein Scanner 17 vorhanden, mittels dem die geformte Beleuchtungsstrahlung BS gesteuert in zwei Richtungen ablenkbar ist.
• Nach dem Scanner 17 ist das Beleuchtungsobjektiv 2 auf der ersten optischen Achse A1 angeordnet. Die von dem Scanner 17 abgelenkte Beleuchtungsstrahlung BS gelangt zu dem Beleuchtungsobjektiv 2 und wird durch dieses geformt und/oder fokussiert. Das Lichtblatt 6 wird durch eine entsprechende Ablenkung der Beleuchtungsstrahlung BS mittels des Scanners 17 in einem Probenbereich erzeugt, in dem sich die Probe 5 befindet.
• Die von der Probe 5 und aus dem Probenbereich kommende Detektionsstrahlung DS ist entlang der zweiten optischen Achse A2 auf einen Detektor 19 gerichtet und durch diesen erfassbar.
• Zur Ansteuerung des Probentischs 11, der Objektivantriebe 14, der Korrekturelemente 2KE, 3KE, des Lasermoduls 15, der Strahlformung 16, des Scanners 17 und/oder des Detektors 19 ist eine Steuereinheit 13 vorhanden, die mit den anzusteuernden Elementen in einer zur Datenübertragung geeigneten Verbindung steht (nur angedeutet gezeigt).
• In weiteren Ausführungen ist die Steuereinheit 13 zusätzlich zur Erfassung, Speicherung und/oder zur Auswertung von Messwerten konfiguriert. Mittels der Steuereinheit 13 können weitere Elemente sowie Einheiten des Mikroskops 0 ansteuerbar sein und/oder Messwerte von diesen erhalten und ausgewertet werden.
• Es werden im Folgenden zur Beschreibung zwei Koordinatensysteme mit zueinander orthogonalen Achsen genutzt. Das erste Koordinatensystem ist das Koordinatensystem der gesamten Anordnung mit einer X-Achse X, einer Y-Achse Y und einer Z-Achse Z. Idealerweise ist die Probenhalterung 7, insbesondere deren Boden, parallel zu einer durch die X-Achse X und die Y-Achse Y aufgespannte X-Y-Ebene ausgerichtet. Das zweite Koordinatensystem ist das Koordinatensystem des Detektors 19 mit der X-Achse X, einer y-Achse y' und einer z-Achse z'. Eine Abbildung beispielsweise eines Bildes aus der Bildebene BE auf dem Detektor 19 besitzt die Koordinaten X und y'. Die X-Achse X ist in beiden Koordinatensystemen orthogonal zur Zeichenebene der Figuren gerichtet. Die beiden anderen Achsen Y und y' beziehungsweise Z und z', können durch eine Rotation um die X-Achse X ineinander überführt werden.
• Der Boden der Probenhalterung 7 stellt ein Trennschichtsystem mit mindestens einer Schicht aus einem vorgegebenen Material mit vorgegebener Dicke dar, welche ein Medium 8, in dem sich die Probe 5 befindet, von dem Beleuchtungsobjektiv 2, dem Detektionsobjektiv 3 und von der Meniskuslinse 10.1 trennt. Das Trennschichtsystem steht mit einer parallel zur Probenebene 4 ausgerichteten Grundfläche zumindest in dem für das Beleuchtungsobjektiv 2 und für das Detektionsobjektiv 3 für die Beleuchtung beziehungsweise die Detektion zugänglichen Bereich mit dem Immersionsmedium 18 in Kontakt.
• In weiteren möglichen Ausführungen des Mikroskops 0 und/oder der Anordnung 1 mit Beleuchtungskorrekturelement 2KE und/oder Detektionskorrekturelement 3KE sind diese derart eingestellt, dass durch diese keine optische Korrekturwirkung verursacht wird.
• In einem zweiten Ausführungsbeispiel der Anordnung 1, sind keine Beleuchtungskorrekturelemente 2KE und keine Detektionskorrekturelement 3KE vorhanden (3).
• Das Übergangselement 10 ist als ein Virtuelles Relay 10.2 ausgebildet. Dieses ist so gestaltet, dass eine Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des schrägen Durchgangs von Beleuchtungsstrahlung BS und/oder Detektionsstrahlung DS auftreten, durch eine entsprechende Gestaltung der Innenseite des Virtuellen Relays 10.2 erfolgt. Die Innenseite ist die dem Probenträger 7 zugewandte Fläche oder Seitenfläche des Virtuellen Relays 10.2.
• Zur Veranschaulichung der Beleuchtungsverhältnisse sind in der 4 der Öffnungswinkel eines Beleuchtungsobjektivs 2 mit einer ersten Numerischen Apertur NA1 von 0,4 und eines Detektionsobjektivs 3 mit einer zweiten Numerischen Apertur NA2 von 1,0 einer erfindungsgemäßen Anordnung 1 eines Mikroskops 0 dargestellt.
• Dabei überdeckt eine durch das Beleuchtungsobjektiv 2 abgestrahlte Beleuchtungsstrahlung BS einen Winkelbereich von -40° bis -80°. Die erste optische Achse A1 des Beleuchtungsobjektivs 2 ist unter einem Beleuchtungswinkel α1 von -60° auf die Probenebene 4 gerichtet.
• Die Numerische Apertur NA2 des Detektionsobjektivs 3 beträgt 1,0. Dessen optische Achse A2 verläuft unter einem Detektionswinkel α2 von 30°. Die Detektionsstrahlung DS überdeckt einen Winkelbereich von -19°bis -79°.
• Unter der beispielhaften Annahme, dass die Probe 5 einen Brechungsindex von n₁ = 1,33 und das Immersionsmedium 18 einen Brechungsindex von n₂ = 1,50 aufweist, erhält man für den Winkel ϑ der Totalreflexion: $$\mathrm{\vartheta }={\text{sin}}^{-1}\left({\text{n}}_1{\text{/n}}_2\right)=62°$$

  
• Es steht daher ein Winkelbereich von -62° bis -80° für eine TIRF-Beleuchtung mittels des Beleuchtungsobjektivs 2 zur Verfügung. Die negativen Vorzeichen ergeben sich aus der in der 4 gewählten Winkelbezeichnungen ausgehend von der senkrecht gezeigten Normalen B bei 0°.
• Ein unter einem Beleuchtungswinkel α1 von -62°auf die als Grenzfläche wirkende und der Probe 5 zugewandten Seitenfläche der Probenhalterung 7 gerichteter Beleuchtungsstrahl wird an der Grenzfläche totalreflektiert, wobei sich ein evaneszentes Feld 9 (schematisch und überdimensioniert dargestellt) in die Probe 5 ausbreitet. Wird durch das evaneszente Feld 9 in der Probe 5 eine detektierbare Strahlung, beispielsweise Fluoreszenzstrahlung, angeregt, kann diese als Detektionsstrahlung DS erfasst werden.
• In einer dritten Ausführung der erfindungsgemäßen Anordnung 1 ist das Übergangselement 10 in Form einer Immersionskammer 10.3 ausgebildet (5). Die Objektive 2, 3 sind als Immersionsobjektive ausgebildet. Das Übergangselement 10 im eigentlichen Sinne ist durch eine obere Wand der Immersionskammer 10.3 gebildet. Zur Entfaltung der Korrekturwirkung ist die Immersionskammer 10.3 mit einem Immersionsmedium 18 gefüllt, dessen Brechungsindex wie oben beschrieben gleich dem Brechungsindex des Probenträgers 7 und der Objektive 2, 3 ist.
• Bezugszeichenliste

0

Mikroskop

1

Anordnung

2

Beleuchtungsobjektiv

2KE

Beleuchtungskorrekturelement

3

Detektionsobjektiv

3KE

Detektionskorrekturelement

4

Probenebene (= Bezugsebene)

5

Probe

6

Lichtblatt

7

Probenhalterung

8

Medium

9

evaneszentes Feld

10

Übergangselement

10.1

Meniskuslinse

10.2

Virtuelles Relay

10.3

Immersionskammer

11

Probentisch

12

Alvarez-Manipulator

13

Steuereinheit

14

Objektivantrieb

15

Lasermodul

16

Strahlformung

17

X-Y-Scanner

18

Immersionsmedium

19

Detektor

A1

erste optische Achse (optische Achse des Beleuchtungsobjektivs 2)

A2

zweite optische Achse (optische Achse des Detektionsobjektivs 3)

α1

Winkel / Beleuchtungswinkel

α2

Winkel / Detektionswinkel

ϑ

Winkel der Totalreflektion

B

Normale

BE

Bildebene

BS

Beleuchtungsstrahlung

DS

Detektionsstrahlung

NA1

erste Numerische Apertur

NA2

zweite Numerische Apertur

• ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
• Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
• Zitierte Patentliteratur
• DE 102013112600 A1 [0008]

Claims (9)

1. Anordnung (1) zurTIRF-Mikroskopie, umfassend - eine Beleuchtungsoptik mit einem Beleuchtungsobjektiv (2) zur Beleuchtung einer auf einem Probenträger (7) in einem Probenbereich einer Probenebene (4) befindlichen Probe (5) über einen Beleuchtungsstrahlengang, wobei die optische Achse (A1) des Beleuchtungsobjektivs (2) mit der Normalen (B) der Probenebene (4), hinsichtlich welcher der Probenträger (7)ausgerichtet ist, einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel (α1) einschließt, -eine Detektionsoptik mit einem Detektionsobjektiv (3) in einem Detektionsstrahlengang, dessen optische Achse (A2) mit der Normalen (B) der Probenebene (4) einen von Null verschiedenen Detektionswinkel (a2) einschließt, dadurch gekennzeichnet, dass - zwischen dem Probenträger (7) und den Objektiven (2, 3) ein Übergangselement (10) vorhanden ist, das sowohl in dem Beleuchtungsstrahlengang als auch in dem Detektionsstrahlengang angeordnet ist; - das Übergangselement (10) zur Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des Durchtritts von zu detektierender Strahlung und/oder von Strahlung zur Beleuchtung der Probe (5) durch Medien unterschiedlicher Brechungsindizes entstehen, ausgebildet ist und - der Beleuchtungsstrahlengang unter einem zur Erzeugung einer Totalreflexion der Beleuchtungsstrahlung (BS) an der Probenebene (4) geeigneten Beleuchtungswinkel (α1) in den Probenbereich der Probenebene (4) gerichtet ist.
2. Anordnung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Übergangselement (10) und dem Probenträger (7) ein Immersionsmedium (18) vorhanden ist, dessen Brechungsindex gleich dem Brechungsindex des Übergangselements (10) und/oder des Probenträgers (7) ist.
3. Anordnung (1) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Übergangselement (10) eine Meniskuslinse (10.1) ist.
4. Anordnung (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Übergangselement (10) ein Virtuelles Relay (10.2) oder eine Immersionskammer (10.3) ist.
5. Anordnung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine zur Beleuchtung verwendete Strahlung zu einem Lichtblatt (6) geformt und in den Probenbereich gerichtet ist.
6. Anordnung (1) nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Achse (A1) des Beleuchtungsobjektivs (2) und das Lichtblatt (6) in einer Ebene liegen, die mit der Normalen (B) der Probenebene (4) einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel (α1) einschließt.
7. Mikroskop (0) umfassend eine Anordnung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
8. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Mikroskops (0) nach Anspruch 7 zur Abbildung von Bereichen der Probe (5) mittels TIRF-Mikroskopie.
9. Verfahren zurTIRF-Mikroskopie, bei dem - eine Beleuchtungsstrahlung (BS) zur Beleuchtung einer auf einem Probenträger (7) in einem Probenbereich einer Probenebene (4) befindlichen Probe (5) über einen Beleuchtungsstrahlengang auf die Probe (5) gerichtet wird, wobei die optische Achse (A1) des Beleuchtungsobjektivs (2) mit der Normalen (B) der Probenebene (4), hinsichtlich welcher der Probenträger (7) ausgerichtet ist, einen von Null verschiedenen Beleuchtungswinkel (α1) einschließt, - eine Detektionsstrahlung (DS) entlang eines Detektionsstrahlengangs erfasst wird, dessen optische Achse (A2) mit der Normalen (B) der Probenebene (4) einen von Null verschiedenen Detektionswinkel (a2) einschließt, - die Beleuchtungsstrahlung (BS) und die Detektionsstrahlung (DS) durch ein sowohl in dem Beleuchtungsstrahlengang als auch in dem Detektionsstrahlengang angeordneten Übergangselement (10) hindurch eingestrahlt beziehungsweise erfasst werden, wobei das Übergangselement (10) zur Korrektur von Aberrationen, die aufgrund des Durchtritts von zu detektierender Strahlung und/oder von Strahlung zur Beleuchtung der Probe (5) durch Medien unterschiedlicher Brechungsindizes entstehen, ausgebildet ist und - der Beleuchtungsstrahlengang unter einem zur Erzeugung einer Totalreflexion der Beleuchtungsstrahlung (BS) an der Probenebene (4) geeigneten Beleuchtungswinkel (α1) in den Probenbereich der Probenebene (4) gerichtet wird.

Images