JP6492073B2 - 光シート顕微鏡検査用の装置 - Google Patents
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Description
光シート顕微鏡検査法の主適用例の1つは、数100μmから数mmまでのサイズを有する中程度の大きさの生体の画像形成であり、通常、これらの生体はアガロースゲルに埋め込まれ、このアガロースゲルはさらにガラス毛細管内に存在する。ガラス毛細管は上方または下方から水の満たされた試料室に入れられ、試料は毛細管からその一部が押し出される。アガロース内の試料は光シートにより照明され、光シートに対して垂直であり、したがって光シート光学系に対しても垂直である検出対物レンズにより蛍光がカメラに結像される。この光シート顕微鏡検査法は3つの大きな欠点を有する。第1に、被検試料が比較的大きく、試料が発生生物学から由来することである。さらに試料プレパラートと試料室の寸法のため、光シートが比較的厚く、そのため達成可能な軸方向の解像度が制限されていることである。加えて、試料プレパラートの調整が面倒であり、蛍光顕微鏡検査法で個別の細胞を検査する際に通常であるような標準的試料プレパラートおよび標準的試料ホルダに対して互換性がないことである。
以下、本発明を、例えば本発明の特徴も開示する添付図面に基づいてさらに詳細に説明する。
照明対物レンズ6と検出対物レンズ8は、もはや媒質2と直接接触していないから、異なる試料を有する2つの試料容器の交換の際にもはや汚染は発生し得ない。しかし最も簡単な場合には、1つの層、すなわち空気から成ることのできる分離層システムによって、光が境界面を貫通するため、収差、とりわけ球面収差とコマ収差が発生する。斜めに光が貫通する場合には主に非点収差とコマ収差であり、より小さいが比較的に高次にもあるこの収差を低減または完全に回避するために、種々の措置が可能である。
さらに収差を可及的に小さく維持するために、カバー12の厚さを、いずれの場合でも可及的に薄く選択すると有利であり、ここでは容器底部として構成されたカバー12に対しては数百μmの厚さで十分であり、試料容器1に対する蓋として用いられ、フォイルとして構成されたカバー12に対しては数μmで十分である。
2 媒質
3 試料
4 試料テーブル
5 光源
6 照明対物レンズ
7 光軸
8 検出対物レンズ
9 光軸
10 検出器
11 境界面/第1の大きな面
12 カバー
13 境界面/第2の大きな面
14、15 軸上にないレンズ
16、17 変形可能なミラー
18 レンズ
19 変形可能なミラー
20、21 ビームスプリッタ
22 第1の成分
23 第2の成分
Claims (13)
- 光シート顕微鏡検査用の装置であって、
媒質(2)内に存在する試料(3)を収容するための試料容器(1)であって、該試料容器(1)は平坦な基準面を基準にして位置決めされている、前記試料容器(1)と、
該試料(3)を光シートにより照明するための照明対物レンズ(6)を備える照明光学系であって、該照明対物レンズ(6)の光軸(7)と該光シートとは、該基準面の法線とゼロ以外の照明角βを成す平面内にある、前記照明光学系と、
検出対物レンズ(8)を備える検出光学系であって、該検出対物レンズの光軸(9)は、該基準面の法線とゼロ以外の検出角δを成す、前記検出光学系とを備える光シート顕微鏡検査用の装置において、
所定の厚さを有し、かつ所定の材料から成る1つまたは複数の層を有する分離層システムであって、該試料(3)の存在する該媒質(2)を該照明対物レンズ(6)および該検出対物レンズ(8)から空間的に分離するための分離層システムを備え、
該分離層システムは、基準面に対して平行に位置決めされ、かつ照明および検出のための該照明対物レンズ(6)および該検出対物レンズ(8)に対して少なくとも接近できる領域内において該媒質(2)と接触する境界面(11)を有し、
前記照明対物レンズ(6)の開口数NABは、前記検出対物レンズ(8)の開口数NADよりも小さく、照明角βは検出角δよりも大きく、
前記照明対物レンズ(6)と前記検出対物レンズ(8)は前記試料容器(1)の上方に配置されており、前記試料容器(1)は、その深さを基準にして前記試料容器(1)の上方4分の1の箇所に前記試料(3)を位置決めするための手段を有することを特徴とする光シート顕微鏡検査用の装置。 - 照明光学系および検出光学系のうちの少なくとも一方は、照明光および検出すべき光のうちの少なくとも一方が、前記分離層システムの境界面(11、13)を斜めに貫通することにより発生する収差を低減するための補正手段を含むことを特徴とする請求項1に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 前記補正手段は、補正レンズおよび補正素子のうちの少なくとも一方を、前記照明対物レンズ(6)および前記検出対物レンズ(8)のうちの少なくとも一方内に含むことを特徴とする請求項2に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 前記補正レンズは、シリンダレンズとして、または光軸(7、9)に対して傾斜したレンズおよび軸上に配置されていないレンズ(14、15)のうちの少なくとも一方として構成されており、前記補正素子は、非球面またはフリーフォーム面を備える素子として構成されていることを特徴とする請求項3に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 前記補正手段は、照明光および検出光のうちの少なくとも一方の位相面を操作するための、照明ビームパスおよび検出ビームパスのうちの少なくとも一方に配置された適合型光学素子を含むことを特徴とする請求項2に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 光シート顕微鏡検査用の装置であって、
媒質(2)内に存在する試料(3)を収容するための試料容器(1)であって、該試料容器(1)は平坦な基準面を基準にして位置決めされている、前記試料容器(1)と、
該試料(3)を光シートにより照明するための照明対物レンズ(6)を備える照明光学系であって、該照明対物レンズ(6)の光軸(7)と該光シートとは、該基準面の法線とゼロ以外の照明角βを成す平面内にある、前記照明光学系と、
検出対物レンズ(8)を備える検出光学系であって、該検出対物レンズの光軸(9)は、該基準面の法線とゼロ以外の検出角δを成す、前記検出光学系とを備える光シート顕微鏡検査用の装置において、
所定の厚さを有し、かつ所定の材料から成る1つまたは複数の層を有する分離層システムであって、該試料(3)の存在する該媒質(2)を該照明対物レンズ(6)および該検出対物レンズ(8)から空間的に分離するための分離層システムを備え、
該分離層システムは、基準面に対して平行に位置決めされ、かつ照明および検出のための該照明対物レンズ(6)および該検出対物レンズ(8)に対して少なくとも接近できる領域内において該媒質(2)と接触する境界面(11)を有し、
前記照明対物レンズ(6)の開口数NA B は、前記検出対物レンズ(8)の開口数NA D よりも小さく、照明角βは検出角δよりも大きく、
前記分離層システムは、所定の材料から作製され、かつ所定の厚さを有し、前記試料容器(1)を閉鎖するプレート状またはフォイル状のカバー(12)を備え、
該プレート状またはフォイル状のカバー(12)の第1の大きな面は前記媒質(2)と、照明および検出のための前記照明対物レンズ(6)および前記検出対物レンズ(8)に少なくとも接近できる領域内ではほぼ完全に接触しており、
該カバーの第2の大きな面は、ガス、または分離層システムのさらなるコンポーネントとしての浸漬媒質と、照明および検出のための前記照明対物レンズ(6)および前記検出対物レンズ(8)に少なくとも接近できる領域内で接触しており、
前記カバー(12)のための材料は、前記試料(3)の存在する前記媒質(2)の屈折率から5%未満だけ異なる屈折率を有することを特徴とする光シート顕微鏡検査用の装置。 - 前記試料(3)の存在する前記媒質(2)は水であり、前記カバー(12)のための材料は、PTFE、CYTOP(登録商標)、FEP、Teflon(登録商標)AFまたは過フルオロジオキソラン・ポリマーである、請求項6に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 前記カバー(12)はアモルファスポリマーから成り、該アモルファスポリマーのガラス転移温度は、冷えた状態ではポリマーが前記試料(3)の存在する前記媒質(2)の屈折率を有するように調整されている、ことを特徴とする請求項6または7に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 前記カバー(12)のための材料は、第1の成分(22)と第2の成分(23)とから成るナノ構造化された材料であり、
該第1の成分(22)の屈折率は前記媒質(2)の屈折率よりも小さく、該第2の成分(23)の屈折率は前記媒質(2)の屈折率よりも大きく、
該第1の成分(22)から成る領域の平均構造サイズは、照明に使用され検出すべき光の光波長よりも小さい平均直径を有することを特徴とする請求項6に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。 - 前記照明対物レンズ(6)と前記検出対物レンズ(8)は前記試料容器(1)の下方に配置されている、請求項6から9のいずれか1項に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 照明角βと検出角δの和は、90°であることを特徴とする請求項1に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 前記適合型光学素子は、変形可能なミラー(16、17)、空間的光変調器、または位相プレートを含むことを特徴とする請求項5に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
- 前記ガスは、空気であることを特徴とする請求項6に記載の光シート顕微鏡検査用の装置。
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