DE10053553A1 - Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen - Google Patents
Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von BiomolekülenInfo
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Abstract
Ofenbart wird eine Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen mit einem homogen an- und/oder durchströmbaren Trägermaterial mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial mit mindestens einer Biomolekül-Sonde erhältlich ist durch ein Verfahren, bei dem man DOLLAR A (1) das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, DOLLAR A durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel-Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden ist, und DOLLAR A (2) ein geeignetes Vernetzungsreagenz und mindestens eine Biomolekül-Sonde zugibt, wobei das Mantel-Molekül als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert und die mindestens eine Biomolekül-Sonde auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel-Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden wird. DOLLAR A Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen, Verfahren zum Anreichern von Biomolekülen, Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen sowie eine Zusammenstellung in Form eines Kits, enthaltend mindestens eine Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen, mindestens ein Hilfreagenz zum Nachweis von Biomolekülen und gegebenenfalls einen oder mehrere Auffangbehälter oder eine oder mehrere Saugvorrichtungen beschrieben.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Nachweis und zum
Anreichern von Biomolekülen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre
Verwendung sowie eine Zusammenstellung in Form eines Kits. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis von
Biomolekülen, die auch zum Anreichern von Biomolekülen einsetzbar ist.
Verschiedene Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen
sind bereits bekannt. Der Nachweis kann beispielsweise über die Gel-
Elektrophorese erfolgen. Sie ermöglicht die Auftrennung von Biomolekülen, wie
beispielsweise Nukleinsäuren im elektrischen Feld. Eine anschließende
Visualisierung kann mittels DNA-Farbstoff, wie beispielsweise Ethidiumbromid
oder Silbernitrat, Fluoreszenz- oder Radioaktivmarkierung erfolgen. Dieses
Verfahren ist sehr zeitintensiv und gerätelastig. Weiterhin sind die
Visualisierungsreagenzien i. a. toxisch und umweltbelastend, so daß eine
Versuchsdurchführung für ungeschultes Personal gefährlich und die
Abfallentsorgung problematisch ist. Der Einsatz eines UV-Illuminators ist bei
DNA-/RNA-Fluoreszenzfarbstoffen notwendig.
Ein weiteres bekanntes Verfahren beruht auf der PCR-/DNA-ELISA-
Technologie, bei welchem an Kunststoffoberflächen immobilisierte
Sondenmoleküle, wie DNA, RNA, cDNA oder Oligonukleotide, mit
komplementären Sequenzabschnitten eines spezifischen Amplifikats
hybridisieren. Die Immobilisierung kann durch kovalente Anbindung der
Sondenmoleküle an die Kunststoffoberfläche erfolgen, die dafür jedoch reaktive
Gruppen, wie NH2, COOH, OH, SH und SiO2-Gruppen, aufweisen muß. Diese
können durch eine Niederdruck-Plasmabehandlung im Vakuum eingeführt
werden. Dabei können dem Plasma direkt zugängliche Oberflächen modifiziert
werden. Oberflächen im Inneren eines Trägermaterials, wie sie beispielsweise in
Kunststoffritten vorliegen, können jedoch nur schwer modifiziert werden.
Mit Hilfe von Vernetzungsreagenzien, z. B. bi- und multifunktionellen
Crosslinkern, können aktive Biomoleküle mittels Crosslinker an Plasma
behandelte Kunststoffoberflächen kovalent gebunden werden. Nachteilig an
diesem Verfahren ist die eingeschränkte räumliche Beweglichkeit der
Sondenmoleküle, die zu einer geringeren Empfindlichkeit des Systems führen
kann. Weiterhin ist die Sonden-Belegungsdichte nicht bekannt.
Die Immobilisierung kann auch auf adsorptive Weise erfolgen, wie
beispielsweise in WO 97/49992 beschrieben. Nachteilig an diesem Verfahren
sind die vielen erforderlichen Arbeitsschritte, insbesondere Waschschritte und
Ausklopfen der Kavitäten, und der notwendige Einsatz eines Platereaders.
Weiterhin besteht die Gefahr, daß Sonden-Moleküle während der Beladung oder
der Versuchsdurchführung eluiert werden. Daher ist auch die Sonden-
Belegungsdichte dieser Systeme geringer. Ebenfalls nachteilig ist die nicht
zielgerichtete Orientierung der Sonde, die die Empfindlichkeit des
Nachweissystems einschränkt.
Ein bekanntes Verfahren zum Anreichern von Biomolekülen ist die magnetische
Separation. Dabei werden paramagnetische Partikel eingesetzt, an die die zu
trennenden Biomoleküle beispielsweise durch Wechselwirkung mit einem
Sondenmolekül spezifisch gebunden sind. Die gewünschten Biomoleküle werden
unter Verwendung eines Magnetfeldes abgetrennt. Nachteilig an diesem
Verfahren ist der erforderliche komplexe apparative Aufbau.
Eine weitere Möglichkeit zur Anreicherung von Biomolekülen bietet die
Affinitätschromatographie. Sie beruht auf der spezifischen und reversiblen
Adsorption eines Biomoleküls aus einer komplexen Mischung an einer
individuellen, matrixgebundenen Sonde. Die Elution des adsorbierten
Biomoleküls wird dann entweder durch kompetitive Verdrängung aus der
Bindung oder durch einen Konformationswechsel aufgrund einer Änderung der
Lösungsmittelumgebung erreicht, beispielsweise durch Variation des pH-Wertes
oder der Ionenstärke. In der Regel sind affinitätschromatograpische Verfahren
sehr zeitintensiv und für gelegentliche Anreicherungsversuche wenig geeignet.
In Anbetracht des hierin vorstehend zitierten und diskutierten Standes der Technik
lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung
anzugeben, welche die Detektion und die Anreicherung von Biomolekülen auf
einfache Art und Weise ermöglicht.
Insbesondere war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung
anzugeben, die einen schnellen Nachweis und eine schnelle Anreicherung von
Biomolekülen erlaubt.
Eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, eine Vorrichtung
zur Verfügung zu stellen, die aufgrund einer geringeren Anzahl von
Verfahrensschritten weniger kontaminationsanfällig ist.
Eine weitere Aufgabe ist darin zu erblicken, eine Vorrichtung bereitzustellen, die
auch bei kleinen Probenzahlen eine kostengünstige Anreicherung von
Biomolekülen ermöglicht.
Noch eine Aufgabe, welche der Erfindung zugrundeliegt, besteht darin, daß eine
Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen zu finden ist,
die auch einen schnellen und kostengünstigen Nachweis der abgetrennten
Biomoleküle ermöglicht.
Eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe war auch, ein Verfahren zur
Herstellung von Vorrichtungen zum Nachweis und zum Anreichern von
Biomolekülen anzugeben, welches einfach, schnell und kostengünstig
durchführbar ist.
Ein weitere Aufgabe der Erfindung war schließlich auch die Bereitstellung eines
Verfahrens zur Anreicherung von Biomolekülen, welches einfach, schnell und
kostengünstig durchführbar ist.
Darüber bestand eine Aufgabe darin, ein Verfahren zum Nachweis von
Biomolekülen anzugeben, das ebenfalls einfach, schnell und kostengünstig
durchführbar ist.
Diese und nicht näher genannte weitere Aufgaben, die sich jedoch wie
selbstverständlich oder in naheliegender Weise aus der einleitenden Erörterung
des Standes der Technik ergeben, beziehungsweise ableiten lassen, werden im
Hinblick auf die Vorrichtung im Rahmen der Erfindung durch eine Vorrichtung
zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen des Anspruchs 1 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis
und zum Anreichern von Biomolekülen werden in den auf Anspruch 1 direkt oder
indirekt rückbezogenen Ansprüchen unter Schutz gestellt.
Dadurch, daß man eine Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von
Biomolekülen mit einem homogen an- und/oder durchströmbaren Trägermaterial
mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde, zur Verfügung
stellt, wobei sich die Vorrichtung dadurch auszeichnet, daß das Trägermaterial
mit mindestens einer Biomolekül-Sonde erhältlich ist durch ein Verfahren, bei
dem man
- 1. das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel- Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden ist, und
- 2. ein geeignetes Vernetzungsreagenz und mindestens eine Biomolekül- Sonde zugibt, wobei das Mantel-Molekül als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert und die mindestens eine Biomolekül-Sonde auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel-Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden wird,
gelingt es auf nicht ohne weiteres vorhersehbare Weise eine Reihe von Vorteilen
zu erzielen. Hierzu gehören unter anderem:
- - Durch das umhüllende Mantel-Molekül werden auf der Oberfläche des Trägermaterials reaktive Gruppen für eine kovalente Bindung von Biomolekülen, wie Nukleinsäuren, Proteine, Polypeptide, Allergene, Zucker, Polysaccharide, Antigene, Antikörper etc. bereitgestellt.
- - Die flexible und variable Gestalt des umhüllenden Mantel-Moleküls erlaubt eine erhöhte räumliche Beweglichkeit der gekoppelten Biomolekül-Sonden und bietet somit verbesserte Hybridisierungs- und Bindungsmöglichkeiten von DNA-Sonde und Target-DNA-Molekül bzw. Antigen-Antikörper-Komplexen.
- - Erfindungsgemäß kann eine hohe Dichte von Biomolekül-Sonden auf dem Trägermaterial aufgebracht werden kann.
- - Ein weiterer Vorteil ist es, daß im Gegensatz zur Niederdruck- Plasmabehandlung des Trägermaterials nicht nur an der äußeren Oberfläche, sondern auch an Oberflächen im Inneren einer porösen Struktur Biomolekül-Sonden aufgebracht werden können.
- - Die Flüssigkeiten können vorzugsweise ausschließlich aufgrund der Schwerkraft durch die Vorrichtung fließen bzw. strömen. Somit erfordert eine Anreicherung der Biomoleküle keine Zwischenschritte, wie Entleeren und Ausklopfen der Kavitäten.
- - Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine Anreicherung von Biomolekülen und gegebenenfalls auch ihr Nachweis wesentlich schneller erreicht werden. Durch die zusätzliche Verwendung einer Saugvorrichtung kann die notwenige Zeit nochmals reduziert werden.
- - Die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen ist weniger kontaminationsanfällig als bisher bekannte Systeme.
- - Die Vorrichtung ist insbesondere für den Nachweis und das Anreichern von Biomolekülen in kleinen Probenstückzahlen geeignet.
- - Die Vorrichtung ermöglicht den Geräte unabhängigen Nachweis und das Anreichern von Biomolekülen. Es werden kein Washer oder Lesegerät (Plate-Reader) o. ä. benötigt. Die Ergebnisse von Nachweisreaktionen können optisch ausgelesen werden, es besteht jedoch auch die Möglichkeit, entsprechende technische Hilfsmittel einzusetzen.
- - Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung können auch Biomoleküle trotz stark denaturierender Verhältnisse in der Lösung, beispielsweise durch die Gegenwart von Harnstoff, angereichert werden.
- - Die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomollekülen erlaubt durch Variation der Inkubations- bzw. Verweilzeiten einer beliebigen Flüssigkeit auf der Vorrichtung die Durchführung von Reaktionen auf und in der Vorrichtung.
Der Aufbau der Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von
Biomolekülen weist ein homogen an- und/oder durchströmbares Trägermaterial
mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde auf. Die
Vorichtung kann sehr variabel gestaltet werden. Die erfindungsgemäße
Vorrichtung ist vorzugsweise ein Hohlkörper, in dessen Lumen eines oder
mehrere der erfindungsgemäßen Trägermaterialien angeordnet sind. Ein
homogenes Durchströmen des Hohlkörpers soll vorzugsweise gewährleistet sein.
Es ist ebenfalls bevorzugt, daß keine Randeffekte auftreten oder andere Bereiche
gebildet werden, in denen der Durchfluß schneller oder langsamer ist, als an
anderen Stellen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise eine
kleine, oben und unten offene Säule oder Tubus zum Einmalgebrauch.
Das in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltene Trägermaterial liegt in
Form eines Formkörpers, loser Schüttungen von Partikeln, in Form eines Gels,
einer Membran oder in Membranen eingebettet oder als Dispersion vor. Auch
Kombinationen von Trägermaterialien sind denkbar. Das Trägermaterial ist
vorzugsweise in der Lage, Mantel-Moleküle unspezifisch zu binden. Es muß für
ein Fluidum durchlässig sein. Das Trägermaterial weist vorzugsweise einen
mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 300 µm auf. Bei Schüttungen,
Dispersionen und gesinterten Materialien sind diese Poren die zwischen den
Partikeln vorhandenen Poren und nicht die Poren der Oberfläche eines Partikels
des in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltenen Trägermaterials. Das
Trägermaterial bindet vorzugsweise Mantel-Moleküle beim Fluß durch das
Trägermaterial unspezifisch.
Das in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltene Trägermaterial besteht
vorzugsweise aus gesintertem organischen oder anorganischen Material. Als
gesintertes organisches Material kommen insbesondere thermoplastische
Kunststoffe, vorzugsweise in Partikelform, in Frage. Dazu gehören zum
Beispiel Polyethylen und Polystyrol.
In einer weiteren Ausführungsform kann das in den erfindungsgemäßen
Vorrichtungen enthaltene Trägermaterial partikelförmig für lose Schüttungen
oder Gele, gelförmig oder als selbsttragender Formkörper, z. B. als Fritte,
vorliegen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist
das Trägermaterial eine Fritte aus gesintertem organischen oder anorganischen
Material, vorzugsweise aus thermoplastischen Kunststoffpartikeln, wie
Polyethylen oder Polystyrol.
In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform besteht das
in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltene Trägermaterial aus
geschäumten Kunststoffen, insbesondere solchen in retikulierter Form,
Hohlfasern, verstreckten Folien, Komposit- oder Mehrschichtenmaterialien mit
unterschiedlichen Eigenschaften für die Sorption, den Durchfluß oder die
Festigkeit und zur Vermeidung durchgängig großer Poren, keramischen
Materialien, Zeolithen, Metallen, Metalloxiden, Legierungen, Glas oder
Kohlenstoffmodifikationen oder Kombinationen davon in Mischungen oder
geschichteten Lagen.
Im allgemeinen kommen homogene, poröse Materialien, insbesondere solche
mit ausreichender nicht spezifischer Sorption von Mantel-Molekülen in Frage.
Dazu gehören zum Beispiel auch die in der Mikrofiltration, gegebenenfalls auch
Ultrafiltration und Tiefenfiltration eingesetzten Materialien und Membranen.
Das Trägermaterial kann als gesinterter Formkörper, hergestellt durch Sinterung
unter Wärme und/oder Druck mit oder ohne Bindemittel und/oder
Makroporenbildner, in dichten Schüttungen (Kieselgur, Sand, Anthrazit),
Schaumstoffen, Fasern und Hohlfasern, als Quer- oder Längsfasern, Vliese,
Wirrvliese, Mikrofilamenten, Fiberglas, etc. vorliegen. Neben den genannten
organischen Materialien kommen grundsätzlich auch andere Materialien und
Herstellprozesse in Frage, wie sie insbesondere in Ullmann Encyclopedia of
Industrial Chemistry, Vol. A16, ab Seite 224, in Eberhardt Staude, Membranen
und Membranprozesse, Verlag Chemie Weinheim 1992, ab Seite 8, und in
Siegfried Ripperger, Mikrofiltration mit Membranen, Verlag Chemie Weinheim
1992 ab Seite 15, genannt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das
Trägermaterial einheitlich in bezug auf seine Eigenschaften. Für die Kontrolle
der Einheitlichkeit des Trägermaterials kommen als meßbare Parameter
gleichmässiges Gewicht oder Dichte und/oder gleichmässige
Durchflußgeschwindigkeit in Betracht. Gewichts- und Durchflußschwankungen
deuten bei den Trägermaterialien auf entsprechende Schwankungen der
Parameter Porendurchmesser, gesamtes Porenvolumen und innere Oberfläche
hin, die neben anderen Parametern das Sorptionsverhalten des Trägermaterials
bestimmen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist das Trägermaterial homogen an-
und/oder durchströmbar, vorzugsweise für ein Fluidum homogen an- und/oder
durchströmbar. Ein homogen durchströmbares Trägermaterial wird bevorzugt.
Dabei ist erfindungsgemäß eine homogene Durchströmbarkeit des
Trägermaterials mit einer gleichförmigen Porenstruktur korreliert, besonders
bezüglich der adsorbierenden inneren Oberfläche, über die Fläche der
Trägermaterialien, aber auch über deren Querschnitt, d. h. in Richtung des
Durchflußes. Eine solche symmetrische, homogene Porenstruktur ist vorteilhaft.
Es ist jedoch auch möglich, asymmetrische Porenstrukturen zu verwenden, mit
in Durchflußrichtung gesehen z. B. zuerst kleineren Poren, um eine größere
innere Oberfläche zur Verfügung zu stellen, gefolgt von größeren Poren, damit
die Durchflußgeschwindigkeit nicht zu klein wird.
Durch Sintern werden Membranen mit niedriger Porosität (bis 40%, eventuell
bis 60%) und irregulärer Porenstruktur mit insgesamt sehr breiter
Porengrößenverteilung erhältlich.
Durch Verstrecken von Polymerfolien werden Membranen hoher Porosität bis
90% und relativ regulärer Porenstruktur mit einheitlicher Porengrößenverteilung
erhalten, wie sich beispielsweise aus Ullmann a. a. O., Seite 216, ergibt. Die
Membranen lassen sich nach dem Stand der Technik mittels an sich bekannter
Verfahren herstellen.
Das in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltene Trägermaterial kann in
einer bevorzugten Ausführungsform an der Oberfläche mit Biopolymeren, wie
Proteinen, beschichtet sein. Es kann ebenfalls, je nach Einsatzbereich, an der
Oberfläche hydrophobiert oder hydrophiliert sein.
Die Herstellung des in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltenen
Trägermaterials ist dem Fachmann bekannt. Sie geht davon aus, daß bestimmte
Siebfraktionen von sinterbaren Materialien gesintert werden. Die nicht während
des Sinterprozesses im Sinterverband eingebundenen Partikel werden danach aus
dem gesinterten Material entfernt.
Weiterhin ist die Entfernung störender Partikel wünschenswert. Diese
Entfernung führt zu Materialien, die einheitlicher sind und nur noch geringe
Unterschiede in ihren Eigenschaften aufweisen.
Im Falle anderer Trägermaterialien, wie geschäumten Kunststoffen,
insbesondere solchen in retikulierter Form, Hohlfasern, verstreckten Folien,
Komposit- oder Mehrschichtmaterialien, keramischen Materialien, Zeolithen,
Metallen, Metalloxiden, Legierungen, Glas oder Kohlenstoff werden auch
entweder Verfahrensschritte zur Entfernung von unpassenden Partikelgrößen
durchgeführt und/oder die Größe der Poren, insbesondere bei membranartigen
Materialien, durch an sich bekannte Verfahrensparameter gesteuert. Ziel kann es
sein, eine relativ enge Größenverteilung der Poren zu erreichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial mit möglichst
exakter geometrischer Form (z. B. Zylinder mit Querschnitt entsprechend dem
Querschnitt des Durchflußgefässes bei zylindrischen Durchflußgefäßen, z. B.
Quader mit entsprechendem Querschnitt bei Durchflußgefäßen mit rechteckigem
Querschnitt) in eine Hülse eingepaßt. Das Trägermaterial kann mittels im
Lumen des Hohlkörpers angeordneten Einrichtungen fixiert sein. Diese
Einrichtungen weisen vorzugsweise ein homogenes Durchströmverhalten für ein
Fluidum, insbesondere Lösungen mit Analyten auf.
Gemäß der vorliegenden Erfindung weist das in den Vorrichtungen enthaltene
Trägermaterial mindestens eine daran immobilisierte Biomolekül-Sonde auf.
Dabei ist das Trägermaterial mit mindestens einer Biomolekül-Sonde erhältlich
durch ein Verfahren bei dem man
- 1. das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel- Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden ist, und
- 2. ein geeignetes Vernetzungsreagenz und mindestens eine Biomolekül- Sonde zugibt, wobei das Mantel-Molekül als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert und die mindestens eine Biomolekül-Sonde auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel-Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden wird.
Das in den erfindungsgemäßen Vorrichtungen enthaltene umhüllende Mantel-
Molekül bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Gruppe von
Verbindungen, die in Lebewesen auftreten. Zu ihnen gehören unter anderem
Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Lipide, sowie ihre Grundbausteine,
wie Aminosäuren, Nucleobasen, Monosaccharide, Fettsäuren und Vitamine.
Weiterhin umfaßt der Begriff Biomoleküle auch Derivate der oben genannten
Biomoleküle sowie synthetische Polymere der Grundbausteine, wie
beispielsweise Polyaminosäuren, vorzugsweise Polylysin. Auch Mischungen
verschiedener Biomoleküle sind denkbar. Vorzugsweise handelt es sich um ein
Protein, insbesondere um ein Albumin. Ganz besonders bevorzugt ist das
Rinderserumalbumin.
Es ist bevorzugt, daß das umhüllende Biomolekül direkt an das Trägermaterial
unspezifisch gebunden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt das
umhüllende Mantel-Molekül eine Bindungsmatrix mit polaren Gruppen, wie
beispielsweise NH2, SH, SiO2, COOH und OH, zur Verfügung, die
Möglichkeiten zu spezifischen Wechselwirkungen, insbesondere mit
Biomolekül-Sonden bieten.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen weisen weiterhin mindestens eine
Biomolekül-Sonde auf. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnen
Biomolekül-Sonden, die Gruppe von Verbindungen, die mit Biomolekülen in
Wechselwirkungen treten. Die Biomolekül-Sonde ist insbesondere ausgewählt
aus der Gruppe der Enzyme, mit Enzymen in Wechselwirkung tretenden
Substraten, Antikörpern, Antigenen, wie hochmolekularen Substanzen oder
Pollen oder anderen Allergenen, Haptenen, Biotin oder Streptavidin,
Nukleinsäuren vom RNA- oder DNA Typ, insbesondere solche, die
hybridisierbar mit anderen Nukleinsäuren sind, Rezeptor oder Liganden eines
Rezeptors, Viren, Bakterien, Zellen, Zellorganellen, Blutkörperchen, Teilchen,
wie kolloidalen Teilchen von Metallen, Metalloxiden, Polymeren oder
Kombinationen der genannten Biomolekül-Sonden. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung werden Nukeinsäuren, Antikörper und Antigene als Biomolekül-
Sonden bevorzugt. Ganz besonders bevorzugte Biomolekül-Sonden sind
Oligonukleotide.
Erfindungsgemäß wird die mindestens eine Biomolekül-Sonde auf der
Oberfläche des umhüllenden Biomolekül-Mantels unspezifisch oder spezifisch
gebunden. Dabei ist eine kovalente Anbindung bevorzugt.
Die Modifizierung des Trägermaterials mit mindestens einer Biomolekül-Sonde
kann durch Beladen des Trägermaterials mit einem Mantel-Molekül und
anschließendem Vernetzen des Mantel-Moleküls mit üblichen Hilfsreagenzien in
der Gegenwart von Biomolekül-Sonden erreicht werden, ohne daß eine
vorherige Modifikation des Trägermaterials mit nicht spezifischem Material
erfolgt.
Die Beladung des Trägermaterials kann über das sogenannte Durchflußverfahren
oder im Batch-Verfahren erfolgen. Beim Durchfluß-Verfahren wird das
unspezifisch oder spezifisch anzubindende Mantel-Molekül gelöst und im
Durchfluß vorzugsweise bei vertikaler Fließrichtung vorzugsweise unter der
Wirkung der Schwerkraft über das zu beladende Trägermaterial gegeben.
Insbesondere hat es sich dabei bewährt, die Beladung in Beladungsgefäßen, wie
beispielsweise zylindrischen Hohlkörpern durchzuführen. Dabei ist das
Trägermaterial im Lumen des Hohlkörpers angeordnet, und zwar möglichst in
exakter Anpassung an die Wandungen. Dies kann zum einen dadurch geschehen,
daß entsprechend geformte Formkörper aus Trägermaterial angefertigt werden
und in das Lumen des Hohlkörpers hinein verbracht werden. Eine weitere
Alternative besteht darin, daß das Trägermaterial zwischen zwei Fritten, die
vorzugsweise keine Wechselwirkung mit dem anzubindenden Mantel-Molekül
und mit später durchfließenden Komponenten aufweisen sollten, anzuordnen.
Danach wird die Lösung mit dem anzubindenden Mantel-Molekül in den
Hohlkörper, der Einlaß- und Auslaßöffnung aufweist, gegeben, so daß im
Durchfluß beim Durchströmen der Lösung mit Mantel-Molekül dieses an der
Oberfläche des Trägermaterials unspezifisch adsorptiv gebunden wird.
In Anordnungen mit vertikalem Durchfluß unter Schwerkraft kann die
Beladungsmethode bei Trägermaterialien mit langsamem Durchfluß noch durch
Anlegen eines Unterdrucks am Auslaß des zylindrischen Hohlkörpers oder
Verwendung bestimmter Vorrichtungen, wie beispielsweise einer
Saugvorrichtung, sowie durch Einwirkung eines Überdrucks am Einlaßende des
zylindrischen Hohlkörpers beschleunigt werden. Dies wirkt sich gegebenenfalls
auch vorteilhaft auf die Gleichmäßigkeit der Beladung aus. Ebenso kann durch
Einbau bestimmter Einrichtungen, beispielsweise Fritten, oder Sog bzw.
Gegendruck, der Durchfluß durch den zylindrischen Hohlkörper verlangsamt
werden, um bei entsprechenden Materialien den Durchfluß zu homogenisieren,
insbesondere aber eine ausreichende Beladung zu erreichen, sowie bei höherer
Beladung auch eine Verringerung der Schwankung der Beladung. Dieselben
Maßnahmen können auch bei den Verfahrensschritten zur Anwendung kommen.
Gegebenenfalls wird das Trägermaterial ein oder mehrmals gewaschen.
Die Vernetzung des anzubindenden Mantel-Moleküls in Gegenwart der
mindestens einen Biomolekül-Sonde erfolgt in einem analogen Verfahrensschritt
durch Zugabe einer Lösung enthaltend das geeignete Vernetzungsreagenz und
die mindestens eine Biomolekül-Sonde.
Im Batch-Verfahren, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise
angewendet wird, wird das Trägermaterial in einem geeigneten Lösungsmittel
aufgenommen, so daß das Trägermaterial vollständig mit Lösungsmittel bedeckt
ist, und durch Zugabe von Mantel-Molekülen mit diesen beladen. In einer
bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine
phosphatgepufferte wäßrige Lösung (PBS) mit physiologischem pH verwendet.
Die Inkubation erfolgt vorteilhafterweise auf einem Überkopfschüttler für
mehrere Stunden. Dabei ist eine Inkubationszeit von 0,01-24 Stunden,
insbesondere von 3-16 Stunden bevorzugt.
Anschließend wird überstehendes Lösungsmittel dekantiert und ungefähr die
gleiche Menge geeignetes Lösungsmittel zugegeben. Diese Waschprozedur kann
mehrfach wiederholt werden. Vorteilhafterweise wird das gleiche Lösungsmittel
wie zur Beladung des Trägermaterials verwendet. Es ist ebenfalls günstig, azide
PBS (gepuffert auf pH = 4.8) als Lösungsmittel einzusetzen.
Zur Vernetzung und Einführung der mindestens einen Biomolekül-Sonde werden
Vernetzungsreagenzien und die mindestens eine Biomolekül-Sonde in geeigneter
Menge zugegeben. Die Inkubation erfolgt vorzugsweise wieder auf einen
Überkopfschüttler für mehrere Stunden. Dabei ist eine Inkubationszeit von 0,01
-24 Stunden, insbesondere von 3-16 Stunden bevorzugt.
Anschließend wird überstehendes Lösungsmittel dekantiert und ungefähr die
gleiche Menge geeignetes Lösungsmittel zugegeben. Diese Waschprozedur kann
mehrfach wiederholt werden. Vorteilhafterweise wird PBS (pH physiol.) als
Lösungsmittel eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden verbleibende aktive Gruppen des
Vernetzungsreagenzes mittels Mantel-Molekülen blockiert, vorzugsweise den
gleichen Mantel-Molekülen, die zur Herstellung des Mantel-Molekül-Umhüllung
verwendet wurden. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 0,01
-24 Stunden, vorzugsweise für 3-16 Stunden.
Der Formträger kann nach der Kopplung getrocknet werden, indem man ihn für
eine bestimmte Zeit, beispielsweise 4 Stunden, mit einer geeigneten Lösung
inkubiert und anschließend bei geeigneter Temperatur für bestimmte Zeit
trocknet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
wird Protein-Zuckerlösung zur Inkubation verwendet.
Die Wahl der geeigneten Temperatur ist für den Fachmann offensichtlich. Sie ist
so zu wählen, daß sich die charakteristischen Eigenschaften der Vorrichtung
nicht verändern, beispielsweise durch Denaturierung des Mantel-Moleküls oder
chemische Umwandlungen.
Geeignete Reagenzien für die Vernetzung der umhüllenden Mantel-Moleküle
sowie die Kopplung der Biomolekül-Sonden sind dem Fachmann bekannt. Sie
umfassen beispielsweise bifunktionelle Crosslinker, wie Carbodiimide oder
Glutaraldehyde, vorzugsweise solche, die Biomolekül-Sonden an das Mantel-
Molekül binden können. Im Rahmen vorliegenden Erfindung werden weiterhin
Vernetzungsreagenzien bevorzugt, die in der Lage sind, die mindestens eine
Biomolekül-Sonde kovalent an das Mantel-Molekül zu binden. Erfindungsgemäß
besonders bevorzugte Vernetzungsreagenz sind das 1-Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl)-carbodiimid hydrochlorid (EDC) und das
Sulfosuccinimidyl-6-[a-methyl-a-(2-pyridyl-dithio)toluamido]hexanoat (Sulfo-
LC-SMPT).
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen zum Anreichern von
Biomolekülen einzusetzenden Mengen an anzubindenden Mantel-Molekülen,
Vernetzungsreagenzien und Biomolekül-Sonden hängen von den gewünschten
Eigenschaften der Vorrichtung und dem geplanten Einsatzziel ab.
Nachfolgend wird die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Nachweis und zum
Anreichern von Biomolekülen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren
beispielhaft erläutert.
Fig. 1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Sie
weist eine Einlaßöffnung (1), ein Probenröhrchen (2), ein durchströmbares
Trägermaterial (3) und eine Auslaßöffnung (4) auf. Erfindungsgemäß trägt das
Trägermaterial eine an ihr immobilisierte Biomolekül-Sonde.
Fig. 2 zeigt eine besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Vorrichtung. Sie weist eine Einlaßöffnung (1), ein Probenröhrchen (2), ein an-
und/oder durchströmbares Trägermaterial (3) mit mindestens einer daran
immobilisierten Biomolekül-Sonde, ein saugfähiges Material (4) und eine
Auslaßöffnung (5) auf.
Das saugfähige Material (4) ist stromab vom Trägermaterial (3) angeordnet.
Dies bedeutet, daß das Fluid, welches das Trägermaterial (3) an- und
durchströmt zunächst das Trägermaterial (3) und danach das saugfähige Material
(4) kontaktiert.
Zugleich ist das saugfähige Material (4) zum Trägermaterial (3) beabstandet
angeordnet. Der Abstand wird dabei gezielt so gewählt, daß ein sich stromab
des Trägermaterials (3) ausbildender Flüssigkeitstropfen spätestens bei
maximaler Ausdehnung in direkten Kontakt mit dem Saugmaterial (4) treten
muß.
Fig. 3 gibt eine idealisierte Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform von
einem Trägermaterial mit mindestens einer Biomolekül-Sonde im Querschnitt
bzw. als Aufsicht wieder. Sie weist ein Trägermaterial (3), einzelne
Trägermaterial-Partikel (6), Mantel-Moleküle (7), Vernetzer (8), Biomolekül-
Sonden (9) in den Trägermaterial-Poren (10) auf.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur Anreicherung und zum Nachweis
von Biomolekülen verwendet werden. Der Begriff Biomoleküle ist - wie bereits
weiter vorne erwähnt - dem Fachmann bekannt und bezeichnet im Rahmen der
vorliegenden Erfindung die in Lebewesen auftretenden Moleküle. Zu ihnen
gehören unter anderem Proteine, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Lipide, sowie
ihre Grundbausteine, wie Aminosäuren, Nucleobasen, Monosaccharide,
Fettsäuren und Vitamine.
Bevorzugt werden Verfahren zur Anreicherung von Biomolekülen, die sich
dadurch auszeichnen, daß man
- 1. gegebenenfalls unter Anwendung von Unter- oder Überdruck oder Verwendung von die Durchflußgeschwindigkeit des Fluidums beeinflußenden Bauteilen eine Lösung, die das mindestens eine anzureicherende Biomolekül enthält, auf die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen aufbringt,
- 2. die Biomoleküle mit der Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen für eine geeignete Zeitspanne wechselwirken läßt, und
- 3. gegebenenfalls mit einer geeigneten Waschlösung nicht spezifisch gebundene Biomoleküle herunterwäscht.
Eine bevorzugte Zeitspanne zum Wechselwirken der Biomoleküle mit der
mindestens einen Biomolekül-Sonde liegt zwischen 1 bis 10 Minuten,
vorzugsweise zwischen 3 bis 5 Minuten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die
auf der Vorrichtung angereicherten Biomoleküle nachgewiesen oder unter
Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels eluiert. Ein geeignetes
Lösungsmittel in diesem Zusammenhang ist ein Lösungsmittel, welches in der
Lage ist, die Wechselwirkung zwischen der Biomolekül-Sonde und dem
angereicherten Biomolekül aufzubrechen. Vorzugsweise werden polare
Lösungsmittel verwendet, insbesondere wäßrige Lösungen. Es ist weiterhin
bevorzugt, daß die wäßrigen Lösungen Säuren, Basen, Salze, Detergentien,
Proteine, Zucker und Mischungen derselben enthalten. Durch anschließendes
Entfernen des Lösungsmittels sind die entsprechenden Biomoleküle in guter
Reinheit zugänglich.
Die Visualisierung der aufgetrennten Biomoleküle kann beispielsweise durch
dem Fachmann bekannte Verfahren, wie Enzym-Substratumsetzung, mittels
Chemoluminiszenz oder auf radioaktiven Wege erfolgen. Auch der Einsatz von
Online-Detektionssystemen basierend auf der Energietransfer-Technologie ist
insbesondere bei hohem Probenaufkommen vorteilhaft. Es arbeitet mit zwei
Fluorchromen und zwei Fluoreszenzwellenlängen (Exzitation/Emission). Diese
Geräte-intensiven Detektionssysteme sind jedoch in der Anschaffung sehr teuer
und daher für die gelegentliche Durchführung von Tests weniger geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt der
Nachweis der angereicherten Biomoleküle, insbesondere durch Visualisierung
direkt auf der Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern. Eine Elution der
angereicherten Biomoleküle ist dabei nicht erforderlich.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von
Biomolekülen bevorzugt, das sich dadurch auszeichnet, daß man
- 1. über das erfindungsgemäße Verfahren eine geeignete Menge eines nachzuweisenden Biomoleküls auf der erfindungsgemäßen Vorrichtung anreichert,
- 2. über das erfindungsgemäße Verfahren eine geeignete Menge eines Affinitäts-Biomoleküls auf der erfindungsgemäßen Vorrichtung anreichert und einen Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül-Komplex ausbildet, und gegebenenfalls
- 3. ein Nachweisreagenz für den Biomolekül-Antikörper-Komplex zugibt.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff Affinitäts-Biomolekül eine zu dem
nachzuweisenden, spezifisch gebundenen Biomolekül Verbindung, die in Lage
ist, mit dem nachzuweisenden, angereicherten Biomolekül spezifisch in
Wechselwirkung zu treten und auf diese Weise einen Biomolekül-Affinitäts-
Biomolekül-Komplex ausbildet. In diesem Zusammenhang werden
erfindungsgemäß Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken-
Bindungen, Coulomb-Wechselwirkungen und elektrostatitische
Wechselwirkungen bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt ist die Ausbildung einer oder
mehrerer kovalenter Bindungen zwischen dem angereichteren Biomolekül und
dem Affinitäts-Biomolekül.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Affinitäts-Biomoleküle bilden mit dem
angereicherten Biomolekül einen Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül-Komplex
aus, der vorzugsweise nicht während dem erfindungsgemäßen Verfahren zum
Nachweis von Biomolekülen eluiert wird, sondern auf der Vorrichtung zum
Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen verbleibt. Erfindungsgemäß
einsetzbare Affinitäts-Biomoleküle sind dem Fachmann bekannt. Sie werden
beispielsweise in der Affinitätschromatographie zum Nachweis von
Biomolekülen verwendet. Zu den im Rahmen der vorliegenden Erfindung
bevorzugten Affinitäts-Biomolekülen gehören Antikörper und Avidine,
insbesondere Streptavidin.
Gegebenenfalls ist das Affinitäts-Biomolekül modifiziert, um den Nachweis des
Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül-Komplexes zu erleichtern. Im Rahmen der
vorliegenden Erfindung ist der Einsatz von Peroxidase-gekoppelten Antikörpern
besonders vorteilhaft.
Falls nötig wird zum Nachweis des Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül-
Komplexes ein sogenanntes Nachweisreagenz zugegeben. Die Detektion kann
dabei über die dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden.
Das Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen kann deutlicher schneller als
bisher bekannte Verfahren durchgeführt werden. In einer bevorzugten
Ausführungsfom der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum
Anreichern von Biomolekülen in weniger als 30 Minuten durchgeführt. In einer
ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Saugvorrichtung
eingesetzt, so daß das Verfahren in weniger als 20 Minuten, vorzugsweise in
weniger als 15 Minuten durchgeführt werden kann. Dabei ist die Verwendung
einer Saugvorrichtung besonders vorteilhaft, die ein an- und/oder
durchströmbares Trägermaterial und ein saugfähiges Material aufweist, wobei das
saugfähige Material mit einem Abstand unterhalb des Trägermaterials angeordnet
ist, der kleiner als die maximal mögliche senkrechte Ausdehnung eines
vollständig ausgebildeten, an dem Trägermaterial anhaftenden
Flüssigkeitstropfens, vorzugsweise eine Wassertropfens ist. Eine derartige
Saugvorrichtung wird in der eingereichten Gebrauchsmusteranmeldung mit dem
Titel "Saugvorrichtung" beschrieben. Für weitere Details wird explizit auf die
Offenbarung dieser Gebrauchsmusteranmeldung verwiesen.
Die Temperatur, bei der die erfindungsgemäßen Vorrichtungen zum Anreichern
oder Nachweis von Biomolekülen verwendet werden, ist so zu wählen, daß
weder Veränderungen des Biomolekül-Mantels, der Biomolekül-Sonden oder der
anzureichernden bzw. nachzuweisenden Biomoleküle, wie beispielsweise
Denaturierung und chemische Zersetzungsreaktionen auftreten. Vorzugsweise
werden die erfindungsgemäßen Vorrichtungen bei Raumtemperatur angewendet.
Mögliche Einsatzgebiete der Vorrichtung sind dem Fachmann offensichtlich.
Dazu gehören unter anderem Verfahren zur DNA-Hybridisierung,
Immunoassays, Anreicherung von Molekülen organischer oder anorgischer
Natur, Bakterien, Viren, Human-, Pflanzen- und Tier- Zellen sowie die
Verwendung als Enzym-Substrat-Systeme.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch zur routinemäßigen Überprüfung
von Proben eingesetzt werden, die möglicherweise mit Viren oder Bakterien
belastet sind. So können beispielsweise Blutprodukte in Blutbanken auf HIV,
Hepatitis, Syphilis und dergleichen untersucht werden. Der Test eignet sich für
Antigene, bei denen ein positiver Befund relativ selten zu erwarten ist und
darüber hinaus auch überall dort, wo eine große Anzahl von Seren untersucht
werden muß.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfolgt vorteilhafterweise
in Kombination mit einer Saugvorrichtung, insbesondere mit einer
Saugvorrichtung gemäß der oben genannten Gebrauchsmusteranmeldung, wobei
die aufgetragenen Flüssigkeiten die Vorrichtung nicht verlassen und in einem
"waste"-Behälter aufgefangen werden, sondern mit einer Saugvorrichtung,
beispielsweise in Form eines Saugfilters aus Zellwatte/Zellstoff o. ä., die
unterhalb des porösen Filterscheibchens angeordnet wird, aufgesaugt werden.
Die Verwendung einer Saugvorrichtung, insbesondere einer Saugvorrichtung
gemäß der oben genannten Gebrauchsmusteranmeldung, bietet den Vorteil, daß
die Verfahren zum Anreichern oder zum Nachweis der Biomoleküle nochmals
deutlich schneller durchgeführt werden können. Weiterhin ist es vorteilhaft, daß
solche Vorrichtungssysteme noch weniger kontaminationsanfällig sind.
Somit wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem homogen
durchströmbaren Hohlkörper aufweisend in seinem Inneren ein Trägermaterial
mit mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde und den
entsprechenden Verfahren zum Nachweis und zum Anreichern von
Biomolekülen ein völlig neuartige Vorrichtung zur Verfügung gestellt, um
Jedermann ohne komplizierte und teure Maschinenkonfigurationen, das
Anreichern und Nachweisen von Biomolekülen zu ermöglichen.
Erfindungsgemäß beansprucht werden auch Zusammenstellungen in Kitform
enthaltend mindestens eine Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von
Biomolekülen gemäß der Erfindung, mindestens ein Hilfsreagenz zum Nachweis
von Biomolekülen und gegebenenfalls einen oder mehrere Auffangbehälter oder
eine Saugvorrichtung, vorzugsweise eine Saugvorrichtung gemäß der oben
genannten Gebrauchsmusteranmeldung.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen eingehender erläutert,
ohne daß die Erfindung auf dieses Beispiel beschränkt werden soll. Dabei
beschreiben Beispiel 1 bis 4 die Möglichkeiten zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Vorrichtung. Beispiele 5 bis 7 beziehen sich auf
verschiedene Möglichkeiten zur Denaturierung von Nukleinsäuren. Beispiel 8
zeigt eine Möglichkeit zur erfindungsgemäßen Anreicherung von Biomolekülen
auf. Beispiel 9 und 10 beschreiben eine Nachweismethode der an der
erfindungsgemäßen Vorrichtung spezifisch gebundenen Biomoleküle.
Runde Fritte aus Polyethylen, 5 mm Durchmesser, 5 mm Höhe, formgenau für
den Querschnitt eines Durchflußgefäßes, die durch Sintern aus
Polyethylenpulver mit enger Korngrößenverteilung durch Aussieben hergestellt
wurden (Korngröße unter 250 µm); Nenn-Porengröße 5-150 µm, Durchmesser
5 mm, Fassungsvermögen für Probenlösungen über eine am oberen Ende des
konischen Teils angesetzte, 5 mm hohe Fritte, ca. 0,8 ml; das Volumen des
Trägermaterials betrug 80 µl.
300 poröse Formträger aus Polyethylen werden in einer Glasflasche in 200 ml
absolutem Ethanol 30 Minuten mittels einer Vakuumpumpe bzw.
Wasserstrahlpumpe im Batch-Verfahren entgast.
Die Formträger werden in 75 ml PBS mit physiologischem pH aufgenommen
und es wird Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben, bis eine Endkonzentration
von 70 µg/ml erreicht ist. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler
für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand dekantiert (ca. 75 ml) und die
Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8× gewaschen und wieder dekantiert.
Daran anschließend werden ca. 75 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8)
zugegeben.
Zur Vernetzung und Einführung der Sonden werden 1-Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC)) mit einer
Endkonzentration von 1,3 mg/ml sowie 50 pmol/Fritte 5'-phosphoryliertes
Oligonukleotid (Biometra) zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem
Überkopfschüttler für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand dekantiert,
die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8× gewaschen und wieder
dekantiert.
Verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes werden mittels
Rinderserumalbumin (1%ige Lösung in PBS (pH physiol.)) blockiert. Die
Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden.
Die Formträger können nach der Kopplung getrocknet werden, indem man sie
für 4 Stunden in einer Protein-Zuckerlösung (1% BSA/10% Polysaccharid)
inkubiert und anschließend bei 42°C für 16 Stunden trocknet.
300 poröse Formträger aus Polyethylen (Fritten wie in Beispiel 1) werden
unbehandelt eingesetzt.
Die Formträger werden in 75 ml PBS mit physiologischem pH aufgenommen
und es wird Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben, bis eine Endkonzentration
von 70 µg/ml erreicht ist. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler
für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand dekantiert (ca. 75 ml) und die
Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8× gewaschen und wieder dekantiert.
Daran anschließend werden ca. 75 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8)
zugegeben.
Zur Vernetzung und Einführung der Sonden werden 1-Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC)) mit einer
Endkonzentration von 1,3 mg/ml sowie 50 µmol/Fritte 5'-phosphoryliertes
Oligonukleotid (Biometra) zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem
Überkopfschüttler für 16 Stunden. Anschließend wird der Überstand dekantiert,
die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8× gewaschen und wieder
dekantiert.
Verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes werden mittels
Rinderserumalbumin (1%ige Lösung in PBS (physiol.)) blockiert. Die
Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 16 Stunden.
Die Formträger können nach der Kopplung getrocknet werden, indem man sie
für 4 Stunden in einer Protein-Zuckerlösung (1% BSA/10% Polysaccharid)
inkubiert und anschließend bei 42°C für 16 Stunden trocknet.
200 poröse Formträger aus Polyethylen (Fritten wie in Beispiel 1) werden in
einer Glasflasche in 200 ml absolutem Ethanol 30 Minuten mittels einer
Vakuumpumpe bzw. Wasserstrahlpumpe im Batch-Verfahren entgast. Die
porösen Formträger werden 8× mit PBS (pH 7,8) gewaschen und äquilibriert.
Die Formträgen werden im Kühlschrank aufbewahrt.
Die Formträger werden in 75 ml PBS mit physiologischem pH aufgenommen
und es wird Rinderserumalbumin (BSA) zugegeben, bis eine Endkonzentration
von 70 µg/ml erreicht ist. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler
für 8 Stunden, die Aufbewahrung in einem Kühlschrank. Anschließend wird der
Überstand dekantiert (ca. 75 ml) und die Formträger werden mit PBS (pH
physiol.) 8× gewaschen und wieder dekantiert. Daran anschließend werden ca.
75 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) zugegeben, der Überstand dekantiert
und nochmals ca. 75 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8) zugegeben.
Zur Vernetzung und Einführung der Sonden werden 1 mg Sulfo-LC-SMPT in 4 ml
PBS (pH 4,8) sowie 50 µmol/Fritte 5'-phosphoryliertes Oligonukleotid
(Biometra) zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für
16 Stunden. Anschließend wird der Überstand mit einer Wasserstrahlpumpe
abgesaugt, die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8× gewaschen und
wieder dekantiert.
Die Formträger werden 75 ml in PBS (pH 7,8) aufgenommen und der
Überstand wird dekantiert.
Verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes werden mittels
Rinderserumalbumin (1%ige Lösung in PBS (physiol.)) blockiert. Die
Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 4 Stunden.
Anschließend wird der Überstand mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt, die
Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8× gewaschen und wieder dekantiert.
Die Formträger werden in 75 ml PBS aufgenommen.
50 poröse Formträger aus Polyethylen (Fritten wie in Beispiel 1) werden in
einer Glasflasche in 200 ml absolutem Ethanol 30 Minuten mittels einer
Vakuumpumpe bzw. Wasserstrahlpumpe im Batch-Verfahren entgast. Die
porösen Formträger werden 8× mit PBS (pH 7,8) gewaschen und äquilibriert.
Die Formträgen werden im Kühlschrank aufbewahrt.
Die Formträger werden in 25 ml PBS mit physiologischem pH aufgenommen
und es werden 0,5 ml Polylysin-Lösung (0,1%; Sigma-Adrich) zugegeben. Die
Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 4 Stunden, die
Aufbewahrung in einem Kühlschrank. Anschließend wird der Überstand
dekantiert (ca. 25 ml) und die Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8×
gewaschen und wieder dekantiert. Daran anschließend werden ca. 25 ml azide
PBS (gepuffert auf PH = 4.8) zugegeben. Nach 10 Minuten wird der Überstand
dekantiert und nochmals ca. 23 ml azide PBS (gepuffert auf pH = 4.8)
zugegeben.
Zur Vernetzung und Einführung der Sonden werden 32,5 mg EDC in 2 ml PBS
(pH 4,8) sowie 50 µmol/Fritte 5'-phosphoryliertes Oligonukleotid (Biometra)
zugegeben. Die Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 4 Stunden.
Anschließend wird der Überstand mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt, die
Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8× gewaschen und wieder dekantiert.
Die Formträger werden 25 ml in PBS (pH 7,8) aufgenommen und der
Überstand wird dekantiert.
Verbleibende aktive Gruppen des Vernetzungsreagenzes werden mittels
Rinderserumalbumin (1%ige Lösung in PBS (physiol.)) blockiert. Die
Inkubation erfolgt auf einem Überkopfschüttler für 4 Stunden.
Anschließend wird der Überstand mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt, die
Formträger werden mit PBS (pH physiol.) 8× gewaschen und wieder dekantiert.
Die Formträger werden in 75 ml PBS aufgenommen.
10 µl des biotinyl. PCR-Amplifikates werden mit 90 µl einer 8 M
Harnstoff/Wasser-Lösung versetzt und 5 Minuten in einem separaten
Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur denaturiert/inkubiert. Anschließend kann
der Ansatz direkt auf die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von
Biomolekülen gegeben werden, in welcher das mit der spezifischen Sonde
(Oligonukleotid) ummantelte Trägermaterial eingelassen ist (⇒ Beispiel 8).
10 µl des biotinyl. PCR-Amplifikates werden mit 30 µl einer 0,2 N NaOH-
Lösung versetzt und 5 Minuten in einem separatem Reaktionsgefäß bei
Raumtemperatur denaturiert. Anschließend werden 30 µl einer 1 M TRIS-HCl-
Lösung (pH = 7.5) hinzugegeben und der Ansatz unmittelbar auf die
Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen gegeben, in
welcher das mit der spezifischen Sonde (Oligonukleotid) ummantelte
Trägermaterial eingelassen ist (⇒ Beispiel 8).
Zu 10 µl des biotinyl. PCR-Amplifikates werden 90 µl [PBS/0.05% Tween® 20
(pH physiol.) plus 300 mM NaCl] pipettiert und zusammen 5 Minuten bei 95°C
(Heizblock) inkubiert. Anschließend kann der Ansatz direkt auf die Vorrichtung
zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen gegeben werden, in
welcher das mit der spezifischen Sonde (Oligonukleotid) ummantelte
Trägermaterial eingelassen ist (⇒ Beispiel 8).
Das denaturierte biotinyl. Amplifikat verbleibt 3-5 Minuten bei Raumtemperatur
auf der Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen und
kann in der Zeit mit der komplementären Sonde hybridisieren. Danach wird mit
einem Waschpuffer (PBS pH (physiol.) 2 × 50 µl nicht spezifisch gebundenes
Amplifikat heruntergewaschen.
100 µl eines anti-Biotin-Antikörpers (Horse-Radish-Peroxidase; 1 : 1000 in
Waschpuffer verdünnt) werden auf die spezifisch gebundene Vorrichtung zum
Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen (Beispiel 8) gegeben und 5
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nachfolgend wird mit PBS (pH 9,23;
aus PBS (physiol.) +0,5% Tween® 20) 2 × 500 µl nicht gebundener Antikörper
heruntergewaschen.
20 µl präzipitierendes Substrat TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) werden
auf die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen aus
Beispiel 9 gegeben. Nach 2 Minuten wird die Reaktion mit 600 µl
bidestilliertem Wasser, die auf die Säule gegeben werden, gestoppt. Man
beobachtet eine Blaufärbung. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle
1 zusammengefaßt.
Claims (10)
1. Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen mit
einem homogen an- und/oder durchströmbaren Trägermaterial mit
mindestens einer daran immobilisierten Biomolekül-Sonde, dadurch
gekennzeichnet, daß das Trägermaterial mit mindestens einer
Biomolekül-Sonde erhältlich ist durch ein Verfahren, bei dem man
- 1. das Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel-Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden ist, und
- 2. ein geeignetes Vernetzungsreagenz und mindestens eine Biomolekül-Sonde zugibt, wobei das Mantel-Molekül als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert und die mindestens eine Biomolekül-Sonde auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel- Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden wird.
2. Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen
gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial
einen mittleren Porendurchmesser von 0,1 bis 300 µm aufweist.
3. Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen
gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß das Trägermaterial eine Fritte aus gesintertem organischen oder
anorganischen Material, vorzugsweise aus thermoplastischen
Kunststoffpartikeln, wie Polyethylen oder Polystyrol ist.
4. Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen
gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß die mindestens eine Biomolekül-Sonde aus Molekülen,
Molekülgruppen oder Teilchen mit affinen Eigenschaften zu anderen
Substanzen besteht.
5. Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen
gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß das umhüllende Mantel-Molekül ein Protein, vorzugsweise
Rinderserumalbumin ist.
6. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zum Nachweis und zum
Anreichern von Biomolekülen gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man
- 1. ein Trägermaterial mit einem Mantel-Molekül anströmend, durchströmend oder im Batch-Verfahren belädt, wobei das Mantel-Molekül entweder direkt an das Trägermaterial unspezifisch oder mittelbar an mindestens eine an das Trägermaterial gebundene Komponente seinerseits unspezifisch oder spezifisch gebunden ist, und
- 2. ein geeignetes Vernetzungsreagenz und mindestens eine Biomolekül-Sonde zugibt, wobei das Mantel-Molekül als Umhüllung um das Trägermaterial fixiert und die mindestens eine Biomolekül-Sonde auf der Oberfläche des umhüllenden Mantel- Moleküls unspezifisch oder spezifisch gebunden wird.
7. Verfahren zur Anreicherung von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- 1. gegebenenfalls unter Anwendung von Unter- oder Überdruck oder Verwendung von die Durchflußgeschwindigkeit des Fludiums beeinflußenden Bauteilen eine Lösung, die das mindestens eine anzureicherende Biomolekül enthält, auf die Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen gemäß mindestens einem Ansprüche 1 bis 5 aufbringt,
- 2. die Biomoleküle mit der Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen für eine geeignete Zeitspanne wechselwirken läßt, und
- 3. gegebenenfalls mit einer geeigneten Waschlösung nicht spezifisch gebundene Biomoleküle herunterwäscht.
8. Verfahren zur Nachweis von Biomolekülen, dadurch gekennzeichnet, daß
man
- 1. gemäß Anspruch 7 eine geeignete Menge eines nachzuweisenden Biomoleküls auf der Vorrichtung gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 anreichert,
- 2. gemäß Anspruch 7 eine geeignete Menge eines Affinitäts- Biomoleküls auf der Vorrichtung anreichert und einen Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül-Komplex ausbildet, und gegebenenfalls
- 3. ein Nachweisreagenz für den Biomolekül-Affinitäts-Biomolekül- Komplex zugibt.
9. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen gemäß Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß man den Nachweis innerhalb von weniger als 30
Minuten durchführt.
10. Zusammenstellung in Form eines Kits enthaltend mindestens eine
Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen
gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, mindestens ein
Hilfsreagenz zum Nachweis von Biomolekülen und gegebenenfalls einen
oder mehrere Auffangbehälter oder eine oder mehrere
Saugvorrichtungen.
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DE10053553A DE10053553C2 (de) | 2000-10-28 | 2000-10-28 | Vorrichtung zum Nachweis und zum Anreichern von Biomolekülen |
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DE (1) | DE10053553C2 (de) |
Cited By (4)
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