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Die
vorliegende Erfindung betrifft Adsorptionsmembranen, umfassend mikroporöse Polymermembranen,
in welche Adsorbensteilchen eingelagert sind. Ferner betrifft die
vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembranen
sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembranen in
Vorrichtungen.
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In
der Vergangenheit wurde eine Vielzahl von analytischen Verfahren
entwickelt, die es erforderlich machen, verschiedenste Substanzen,
wie beispielsweise Lösungsmittel,
niedermolekulare Ionen und Verunreinigungen, aus Makromoleküle enthaltenden
Lösungen
wie beispielsweise Peptidlösungen
zu entfernen, um für
die entsprechende Analyse ausreichend aufkonzentrierte und aufgereinigte
Proben zu erhalten. Aufgrund der Empfindlichkeit dieser analytischen
Verfahren können
schon geringe Mengen an vorgenannten Nebenbestandteilen in einer
zu analysierenden Probe eine deutliche Verschlechterung des Analysenergebnisses
zur Folge haben.
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Eine
Möglichkeit,
die vorstehend beschriebene Trennung durchzuführen, ist die Adsorption. Dabei werden
Komponenten eines Fluids, die Einzelmoleküle, Assoziate oder Partikel
darstellen können,
an der Oberfläche
eines mit dem Fluid in Kontakt stehenden Festkörpers gebunden. Ein zur Adsorption
befähigter Festkörper wird „Adsorbens", die zu adsorbierende
Komponente „Adsorbend" genannt. Die Adsorption
kann technisch zur „adsorptiven
Stofftrennung" eingesetzt
werden, die in „Adsorber" genannten Vorrichtungen
ausgeführt
wird. Ein Adsorbens mit einem hohen Anteil an groben, durchlaufenden
Poren wird auch als „Perfusionsmatrix" bezeichnet.
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Der
Adsorbend wird als „Zielsubstanz" bezeichnet, wenn
seine Gewinnung aus dem Fluid beabsichtigt ist, und als „Kontaminant", wenn er aus diesem
entfernt werden soll. Im ersten Fall muss die Adsorption umkehrbar
sein, und der Adsorption folgt als zweiter Verfahrensschritt unter
geänderten
Bedingungen (Zusammensetzung und/oder Temperatur des Fluids) die „Flution" des Adsorbenden.
Eine Zielsubstanz kann als einzige Komponente im Fluid enthalten
sein, so dass die Stofftrennung in einer bloßen Anreicherung besteht, oder es
liegen mehrere Komponenten vor, die getrennt werden sollen. In diesem
Fall muss zumindest einer der beiden Verfahrensschritte „selektiv" sein, also für die zu
trennenden Komponenten in unterschiedlichem Ausmaß erfolgen.
Wenn es sich beim Fluid um eine Flüssigkeit handelt, wird die
adsorptive Stofftrennung unter Ausklammerung der Gaschromatographie
auch als „Chromatographie" und das Fluid als „Medium" bezeichnet. Die
im Gleichgewicht gebundene Masse des Adsorbenden, bezogen auf die
Masseneinheit des Adsorbens, wird „statische Kapazität" genannt. Deren Abhängigkeit
von der Konzentration des Adsorbenden im Fluid wird durch die Adsorptionsisotherme
beschrieben. Mit entscheidend für
die Kapazität
eines Adsorbens ist seine spezifische Oberfläche, weshalb Adsorbenten vorzugsweise
eine hohe Porosität
aufweisen. Man unterscheidet zwischen "äußerer spezifischer
Oberfläche", dem geometrischen
Oberflächen-Massenverhältnis, und
der „inneren
spezifischen Oberfläche", dem Porenoberflächen-Massenverhältnis. Voraussetzung
für die
Bindungsverfügbarkeit
der inneren Oberfläche
ist ihre sterische Zugänglichkeit
für den
Adsorbenden, also dessen „Ausschlußgrenze", welche für die Chromatographie
beispielsweise durch die Molmasse globulärer Proteine, die in die Poren
gerade nicht mehr eindringen können,
charakterisiert wird.
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Die
Fähigkeit
zur Adsorption kann einem Feststoff inhärent sein, wie z. B. im Falle
von Aktivkohle und Hydroxylapatit, oder durch „adsorptive Modifizierung" eines „Basismaterials", eines vorzugsweise
adsorptiv inerten Feststoffs geeigneter Morphologie, erreicht werden,
die darin besteht, dass an oberflächlichen „Ankergruppen" des Basismaterials
chemische Einheiten kovalent gebunden werden, welche als „Liganden" bezeichnet werden
und welche vorzugsweise zur selektiven Bindung befähigt sind.
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Bei
den als Basismaterialien in Frage kommenden porösen Feststoffen unterscheidet
man zwischen „Aerogelen" und „Xerogelen", wobei sich erstere
durch eine starre Struktur, die auch durchlaufende Poren aufweisen
kann, und meist hohe mechanische Festigkeit auszeichnen, wie sie
insbesondere durch einen kristallinen Aufbau begünstigt wird bzw. werden und
deren Porengrößen messtechnisch
u. a. nach der BET–Methode
direkt zugänglich
sind, während
die Xerogele meist aus vernetzten Ketten eines im Medium ursprünglich löslichen
Polymers bestehen.
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Die
Auswahl an partikularen Basismaterialien mit Teilchengrößen zwischen
etwa 1 μm
und mehreren mm ist groß und
umfasst Silicagele (Siliciumdioxidgele), poröses Glas, Cellulose sowie organische
Polymere auf Methacrylat- und Styrolbasis als klassische Aerogele,
die Aerogelen nahe kommenden und insbesondere Agarosegele, sowie
Dextran-, Polyacrylamid- und weitere synthetische Polymergele als
klassische Xerogele. Hinzu kommen Verbundgele in mehreren Kombinationen,
bei denen in die Poren eines Aerogels ein Xerogel eingelagert ist.
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Werden
solche Basismaterialien zur Herstellung eines Adsorbens verwendet,
ergeben sich jedoch eine Reihe von Nachteilen:
- 1.
Die Beschickung eines Adsorbers mit dem entsprechenden Adsorbens
ist aufwendig, da jede Ungleichmäßigkeit,
Kanalbildung und dergleichen vermieden werden muss. Hinzu kommen
unvermeidliche, nachteilige Randeffekte zwischen Adsorbens und Adsorbergehäuse.
- 2. Es besteht ein Antagonismus zwischen Druckabfall und Transportkinetik
in der Weise, dass letztere durch abnehmende Partikelgrößen begünstigt,
gleichzeitig aber der Druckabfall erhöht wird. Teilchen bis herab
zu 1 μm
Durchmesser, gegebenenfalls auch in nicht-poröser Form, werden deshalb vor
allem für
analytische Trennungen in der so genannten „HPLC" (High Performance Liquid Chromatography)
verwendet. Für
Anwendungen im Prozessmaßstab
ist es dagegen erforderlich, relativ große Partikel einzusetzen, um den
Druckabfall in Grenzen zu halten. Die in diesem Fall ungünstige Transportkinetik
kann durch den Einsatz partikulärer
Perfusionsmatrices nur graduell verbessert werden. Hinzu kommt,
dass ein niedriger Druckabfall nur mit annähernd monodispersen, sphärischen
Partikeln erreicht werden kann, deren Herstellung aber gegenüber der
irregulär
geformten Partikel mit wesentlich höheren Kosten verbunden ist.
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Dementsprechend
ist versucht worden, vorstehende Nachteile durch nicht-partikuläre Adsorbentien zu
vermeiden. Dabei haben die nicht-partikulären Adsorbentien vorwiegend
in Form von kompakten Körpern, die
stets Perfusionsmatrices darstellen, und von flächigen Konfigurationen Eingang
in die Praxis gefunden. Ein kompaktes Adsorbens ist im
US-Patent Nr. 6048457 beschrieben,
die in Pipettenspitzen in situ hergestellte Adsorbenskörper zum
Gegenstand hat, die aus in einer porösen Polymermatrix eingebetteten
Partikeln eines Adsorbens bestehen. Jedoch bietet das Herstellungsverfahren
ebensowenig „scale
up"-Möglichkeiten
wie das von Svec (T. B. Tennikova et al, Journal of Chromatography,
555, (1991), Seiten 97 bis 107) vorgeschlagene, welches auf der
Polymerisation ethylenisch ungesättigter
Monomerer zu Gebilden geeigneter Form und Porosität beruht,
und dessen Grenzen durch die bei größeren Einheiten unmögliche Abfuhr
der Reaktionswärme gesetzt
sind.
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Flächige Adsorbentien
weisen Dicken von etwa 10 bis 1000 μm auf und können zu Adsorbern gewünschter
Dimensionen verarbeitet werden. Wenn sie Perfusionsmatrices darstellen,
werden sie „Adsorptionsmembranen" genannt. Als Basismaterialien
kommen die herkömmlichen „Filtrationsmembranen" in Frage, die flächige Aerogele
mit mittleren Porengrößen von
etwa 0,05 bis 10 μm
darstellen und als „asymmetrisch" bezeichnet werden,
wenn sie über
die Dicke einen Porengrößengradienten
aufweisen, hingegen als „symmetrisch" bezeichnet werden,
wenn über
die Dicke kein Porengrößengradient
vorliegt. Die Filtrationsmembranen können unterschiedliche Formen
aufweisen, wie z. B. Flachmembranen, Hohlfaden- bzw. Hohlfasermembranen
oder Rohrmembranen. Filtrationsmembranen haben aber für die adsorptive
Modifizierung folgende Nachteile:
- 1. Die meisten
zur Herstellung geeigneten Polymere, wie z. B. Polysulfone, Po lyvinylchlorid
(PVC) etc. weisen keine ausreichende Dichte an geeigneten Ankergruppen
und mehr oder weniger ausgeprägte
Tendenz zur unspezifischen Adsorption auf.
- 2. Im Porengrößenbereich,
der eine hohe hydraulische Permeabilität gewährleistet, weisen sie eine
zur Erzielung hoher Kapazitäten
unzureichende spezifische Oberfläche
auf.
- 3. Die chemische Umsetzung von Bahnmaterialien bedingt in der
technischen Durchführung
mechanisch aufwendige Apparate und die Anwendung großer Volumina
an Reaktionsmedien.
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Unter
der Bezeichnung „Acti-Disc" (Handelsmarke der
Fa. FMC Corporation, Philadelphia und später der Fa. Arbor Technologies,
Inc., Ann Arbor, Michigan) sind Adsorptionsmembranen im Handel,
die nach der Firmendruckschrift B405 der Firma Arbor aus der im
US-Patent Nr. 3862030 beschriebenen
Membran hergestellt sind. Diese besteht aus einem synthetischen
Polymer und weist über
ihre Dicke ungleichmäßig im Größenbereich
von 0,01 bis 100 μm
variierende Poren auf, in denen sich Partikel befinden. Nach Art
der Tiefenfilter ist sie für
Partikel, die kleiner sind als die größten Poren, undurchlässig, so
dass sie sogar als Sterilfilter geeignet sein soll. Daraus folgt,
dass sie bei der Anwendung in der Membranchromatographie durch die
in realen Medien stets vorhandenen partikulären Verunreinigungen früher oder
später
verblockt werden, was auch durch Umkehrung der Strömungsrichtung
(„Rückspülung") nicht rückgängig gemacht
werden kann. Zu dem sind die in der Membran befindlichen, gemäß erwähnter Firmendruckschrift
adsorptiv modifizierten Kieselgelpartikel nicht porös, was eine
niedrige Adsorptionskapazität
bedingt. Hinsichtlich des Herstellungsverfahrens wird in der Firmendruckschrift
unter anderem auf das
US-Patent
Nr. 4102746 verwiesen, worin die adsorptive Modifizierung
der Partikel nachträglich,
also bereits in der Membranbahn befindlich, durchgeführt wird,
was, wie auch beim vorgenannten Produkt, die bereits erwähnten Nachteile
von chemischen Umsetzungen an Membranbahnen mit sich bringt.
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Partikel
enthaltende Membranen werden auch vielfältig im medizinischen Bereich
eingesetzt. So werden im
US-Patent
Nr. 4373519 Dextranpartikel enthaltende PTFE-Membranen als Wundverschluss
vorgeschlagen, die jedoch mangels Adsorptionsvermögens als
Adsorptionsmembranen ungeeignet sind. In der Anmeldung US-A-2002/0 066 699 wird
eine Membran, bestehend aus einer polymeren Matrix und darin immobilisierten
adsorptiven Partikeln beschrieben, die beidseitig eine in unregelmäßigen Abständen mit Öffnungen versehene,
selektiv permeable Haut aufweist und zur Entfernung organischer
Verbindungen aus einer biologischen Flüssigkeit befähigt ist.
Die Haut soll bei der vorgesehenen Anwendung der Membran, der statischen Adsorption
von Chemikalien aus Blut, das Eindringen von dessen geformten Bestandteilen
in die Membranmatrix verhindern. Bei Adsorptionsmembranen ist das
Vorhandensein einer Haut, insbesondere wenn sie größere Öffnungen
aufweist, nachteilig, da in den Bereichen, in denen die Haut auftritt,
die hydraulische Permeabilität
herabgesetzt ist, im Bereich der Öffnungen dagegen nicht. Die
Folge davon sind über
die Membranfläche
uneinheitliche Strömungsgeschwindigkeiten
durch die Membran, was dazu führt,
dass in Bereichen hoher hydraulischer Permeabilität die Adsorptionskapazität vorzeitig
erschöpft
wird und ein Durchbruch des Adsorbenden eintritt, bevor die Kapazität der gesamten
Membran erschöpft
ist. Im
US-Patent Nr. 4728432 werden adsorptive
Partikel enthaltende Membranen für
den Einsatz in einem Adsorber nach dem Prinzip der tangentialen
Stofftrennung beschrieben. In den bevorzugten Ausführungsformen
enthält
die Membran einen Support mit Netzstruktur und 40–45% freier
Fläche,
der sie aus den gleichen Gründen
wie die Vorgenannte als Adsorptionsmembran ungeeignet macht.
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Es
ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Adsorptionsmembranen
bereitzustellen, die eine hohe Trennleistung bezüglich aufzureinigender und/oder
aufzukonzentrierender Proben aufweisen, wobei die vorgenannten Probleme
vermieden werden sollen. Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung
bestehen in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung
der Adsorptionsmembranen und der Verwendung der Adsorptionsmembranen
in Vorrichtungen.
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Diese
Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungs formen
gelöst.
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Insbesondere
wird eine keine Haut aufweisende Adsorptionsmembran mit einer Dicke
von 50 bis 500 μm
bereitgestellt, umfassend eine mikroporöse Polymermembran mit symmetrischer
Porenstruktur, wobei die Poren einen maximalen Porendurchmesser
von 0,1 bis 10 μm
aufweisen und in den Poren Adsorbensteilchen eingelagert sind, die über den
gesamten Querschnitt der Membran gleichmäßig angeordnet sind und 10
bis 80% des Porenvolumens ausfüllen,
wobei die Adsorbensteilchen einen Durchmesser aufweisen, der 5 bis
80% kleiner als der maximale Porendurchmesser ist, und wobei die
Adsorbensteilchen entweder eine sphärische oder irreguläre Form
aufweisen.
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Die
erfindungsgemäße Adsorptionsmembran
weist eine Dicke von 50 bis 500 μm
auf, bevorzugt von 100 bis 250 μm
und am meisten bevorzugt von 125 bis 180 μm. Des weiteren weist die erfindungsgemäße Adsorptionsmembran
eine symmetrische Porenstruktur auf, es liegt somit kein Porengrößengradient über die Dicke
der Membran vor. Der maximale Porendurchmesser beträgt dabei
von 0,1 bis 10 μm,
mehr bevorzugt von 0,2 bis 5 μm,
am meisten bevorzugt von 1 bis 5 μm,
wobei dieser nach der BET-Methode oder durch elektonenmikroskopische
Vermessung bestimmt werden kann.
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Die
in den Poren der mikroporösen
Polymermembran eingelagerten Adsorbensteilchen weisen einen Durchmesser
auf, der 5 bis 80%, bevorzugt 10 bis 60% und am meisten bevorzugt
20 bis 30% kleiner als der maximale Porendurchmesser ist. Dabei
können
die in der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
enthaltenen Adsorbensteilchen entweder monodispers sein, also alle
im wesentlichen dieselbe Größe aufweisen,
oder eine kontinuierliche Partikelgrößenverteilung (von 0 bis zu
den angegebenen Werten) aufweisen. Die Form der Partikel kann entweder
sphärisch
oder irregulär
sein.
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Die
Adsorbensteilchen sind in der von der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
umfaßten
mikroporösen
Polymermembran im wesentlichen gleichmäßig angeordnet, wie beispielsweise
in 2 für
den Fall monodiperser sphärischer
Partikel gezeigt. Dementsprechend ergibt sich im Querschnitt der
erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
im wesentlichen keine lokale Anhäufung
von Adsorbensteilchen, sondern eine gleichmäßige Aufteilung der Adsorbensteilchen
in den Poren über
den gesamten Membranbereich, wobei die Dichte der Adsorbensteilchen
in der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
vom Volumenanteil der Partikel in der mikroporösen Polymermembran abhängig ist.
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Die
in der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
enthaltenen Adsorbensteilchen können
inhärent adsorptiv
sein, wie beispielsweise im Falle von Aktivkohle und Hydroxylapatit,
oder durch adsorptive Modifizierung eines nicht-porösen oder
porösen
Basismaterials, eines vorzugsweise adsorptiv inerten Feststoffs
geeigneter Morphologie, erreicht werden, die darin besteht, dass
an oberflächlichen
Ankergruppen des letzteren als Liganden bezeichnete chemische Einheiten
kovalent gebunden werden, die zur vorzugsweise selektiven Bindung
befähigt
sind.
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Die
Auswahl an partikulären
Basismaterialien für
die Adsorbensteilchen der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran umfasst
beispielsweise Silicagele, poröses
Glas, Cellulose sowie organische Polymere auf Methacrylat- und Styrolbasis
als klassische Aerogele, die Aerogelen nahe kommenden und insbesondere
Agarosegele, sowie Dextran-, Polyacrylamid- und weitere synthetische
Polymergele als klassische Xerogele. Hinzu kommen Verbundgele in
entsprechenden Kombinationen, bei denen in die Poren eines Aerogels
ein Xerogel eingelagert ist.
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Besonders
bevorzugt als Adsorbensteilchen der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
sind poröse
Silicateilchen, die mit Kohlenwasserstoffliganden mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen,
insbesondere C18-Liganden modifiziert sind,
sowie Agaroseteilchen, die mit Liganden, welche zur spezifischen
Wechselwirkung mit Biomolekülen
befähigt
sind, modifiziert sind. Beispielhaft können als mit den bzw. dem Adsorbenden
wechselwirkende Liganden Ionenaustauscher, Chelatbildner und Schwermetallchelate,
thiophile, hydrophobe Liganden verschiedener Kettenlängen und
Konfigurationen, Reversed Phase-Systeme, Farbstoffliganden, Affinitätsliganden,
Aminosäu ren,
Coenzyme, Cofaktoren, wie FAD, und deren Analoga, Substrate und
deren Analoga, endokrine und exokrine Substanzen, wie Hormone und
hormonähnlich
wirkende Wirkstoffe, Effektoren und deren Analoga, Enzym-Substrate,
Enzym-Inhibitoren
und deren Analoga, Fettsäuren,
Fettsäurederivate,
konjugierte Fettsäuren
und deren Analoga, Nukleinsäuren,
wie DNA, RNA und deren Analoga und Derivate (einzel-, doppel- und/oder
mehrsträngig),
sowie Peptidnukleinsäuren
und deren Derivate, Monomere und deren Analoga und Derivate, Oligo-
bis Polymere und deren Analoga und Derivate, hochmolekulare Kohlenhydrate,
die linear oder verzweigt, nicht-substituiert oder substituiert
sein können,
polymere Glycokonjugate, wie Heparin, Amylose, Zellulose, Chitin,
Chitosan, als auch deren Mono- und Oligomere und Derivate und Analoga
davon, Lignin und dessen Derivate und Analoga, andere biologisch-chemische
Liganden, wie Oligo- und Polypeptide, z. B. Proteine, wie Protein
A, Cytochrom c, IgG und Ferritin, und ihre Oligomere, Multimere,
Untereinheiten sowie Teile davon, insbesondere Lectine, Antikörper, Fusionsproteine,
Haptene, Enzyme und Untereinheiten sowie Teile davon, Strukturproteine,
Rezeptoren und Effektoren sowie Teile davon, des weiteren Xenobiotika, Pharmazeutika
und pharmazeutische Wirkstoffe, Alkaloide, Antibiotika, Biomimetika
usw. genannt werden.
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Von
den vorgenannten Liganden, welche an Agarose gebunden sind, ist
Protein A bevorzugt.
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In
der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
umfaßt
die mikroporöse
Polymermembran mindestens ein Polymer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Polysulfon, Polyethersulfon, Celluloseacetat, Celluloseacetatbutyrat,
Acrylnitril/PVC-Copolymer,
Polyvinylidenfluorid, Polystyrol, Polystyrol/Acrynitril-Copolymer,
Polyolefinen und Polyamiden.
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Des
weiteren beträgt
der Gewichtsanteil der Adsorbensteilchen in der erfindungsgemäßen Membran 1
bis 70%, bevorzugt 10 bis 60% und am meisten bevorzugt 40 bis 50%.
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Weiterhin
sollen vorzugsweise zwischen 10 und 80%, mehr bevorzugt zwischen
20 und 60% und am meisten bevorzugt zwischen 30 und 40% des Porenvolumens
der von der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
umfassten mikroporösen
Polymermembran mit Adsorbensteilchen gefüllt sein.
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Die
erfindungsgemäßen Adsorptionsmembranen
weisen somit sowohl relativ grobe durchlaufende Poren, die hohe
hydraulische Permeabilitäten
ermöglichen,
als auch feinporige Bereiche auf, die sich in eingeschlossenen,
partikulären,
porösen
Adsorbentien befinden, und durch die hohe Kapazitäten gewährleistet werden.
Die verwendeten partikulären
Adsorbentien können
erfindungsgemäß zur Verbesserung
der kinetischen Eigenschaften Perfusionsmatrices darstellen und/oder
sehr geringe Größe aufweisen,
was ebenso wenig ihre hydraulische Permeabilität zu beeinträchtigen
vermag, wie eine irreguläre
Partikelform, die die bereits erwähnten wirtschaftlichen Vorteile
bietet.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung
der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran,
umfassend eine mikroporöse
Polymermembran mit symmetrischer Porenstruktur, wobei in den Poren
Adsorbensteilchen eingelagert sind, die über den gesamten Querschnitt
der Membran gleichmäßig angeordnet
sind und entweder eine sphärische
oder irreguläre
Form aufweisen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
- (a) Herstellen einer Polymer-Gießlösung,
- (b) Einbringen von Adsorbensteilchen in die Polymer-Gießlösung,
- (c) Bringen der erhaltenen Lösung
in eine Membranform,
- (d) Einbringen der geformten Lösung in ein Fällbad zur
Durchführung
einer kontrollierten Phasenumkehrung unter Ausbildung einer porösen, teilchengefüllten Membran
und
- (e) Entfernen des restlichen Lösungsmittels.
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Bei
der Verwendung von modifizierten Adsorbensteilchen wie beispielsweise
porösen
Silicateilchen mit Kohlenwasserstoffliganden mit 2 bis 24 Kohlenstoffatomen
oder Agaroseteilchen, welche mit Biomolekülen modifiziert sind, erfolgt
die entsprechende Modifizierung vorzugsweise vor der Einbringung
der entsprechenden Adsor bensteilchen in die Polymer-Gießlösung in
Schritt (b) des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens.
Dadurch kann vorteilhaft eine Modifizierung an bereits fertigen
Membranmaterialien vermieden werden, die unter anderem beispielsweise
den Einsatz mechanisch aufwendiger Vorrichtungen und großer Volumina
an Reaktionsmedien mit sich bringt und zu inhomogenen Ergebnissen
führt. Überraschenderweise
führt zudem
die Eintragung bereits modifizierter Adsorbensteilchen in die Polymer-Gießlösung bzw. die
weitere Verarbeitung der so erhaltenen, Adsorbensteilchen enthaltenden
Gießlösung im
erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran nicht
zu Nachteilen wie beispielsweise einer teilweisen Wiederabspaltung
oder Zersetzung der Liganden der modifizierten Adsorbensteilchen.
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Darüberhinaus
können
im erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran vorteilhaft
Maßnahmen
getroffen werden, damit die Kontaktmöglichkeit zwischen der Adsorbensteilchenoberfläche in einer
fertigen erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
und der zu behandelnden, beispielsweise einen Adsorbenden enthaltenden
Flüssigkeit
im Zuge der Einbettung der Adsorbensteilchen in die Membran nicht
beeinträchtigt
wird. Das wäre
insbesondere dann der Fall, wenn wesentliche Teile der Adsorbensteilchenoberfläche oder
ihres Porenvolumens durch den polymeren Träger blockiert würden. Dies
kann vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren dadurch ausgeschlossen
werden, dass in jenen Stadien des Herstellungsprozesses, in denen
die Polymermoleküle
frei beweglich sind, Anziehungskräfte zwischen diesen und den
Adsorbensteilchen ausgeschlossen werden, was vorzugsweise dadurch
erreicht wird, dass die Polymermoleküle und die Adsorbensteilchen
gleichsinnige elektrische Ladungen aufweisen.
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In
dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran erfolgt
die kontrollierte Phasenumkehrung durch die gezielte Einstellung
des Verhältnisses
von Fällungsmittel und
Lösungsmittel
für das
verwendete Polymer, wobei Wasser ein übliches Fällungsmittel darstellt. Dadurch wird
vermieden, daß bei
Verwendung eines reinen Fällungsmittels
wie beispielsweise Wasser eine plötzliche Phasenumkehr eintritt,
wodurch sich eine Haut auf der entstehenden Membran bildet, welche
keine oder wenige, sehr kleine Poren aufweist, und eine darunterliegende
asymmetrische Porenstruktur in der entsprechenden Membran ausgebildet
wird. Dementsprechend weist eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellte Adsorptionsmembran keine Haut auf und besitzt zudem
eine symmetrische Porenstruktur, wie es beispielsweise in den 2 und 3 dargestellt
ist.
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Des
weiteren stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Adsorptionsmembran
in einer Adsorbervorrichtung bereit, umfassend ein Gehäuse, das
ein Volumen festlegt, wobei das Gehäuse ein erstes offenes Ende
und ein zweites, vom ersten offenen Ende beabstandetes offenes Ende
aufweist und in einem Abschnitt des Volumens zwischen den beiden
Enden eine erfindungsgemäße Adsorptionsmembran
angeordnet ist. Das Gehäuse
der Adsorbervorrichtung kann dabei jede Form annehmen. Die erfindungsgemäße Adsorptionsmembran
kann entsprechend beispielsweise passend zugeschnitten werden.
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Die
Adsorptionsmembran kann in der erfindungsgemäßen Verwendung in der Adsorbervorrichtung auch
unmittelbar an einem der beiden Enden des Gehäuses jeglicher Form angeordnet
sein. Eine solche und vorgenannte Adsorbervorrichtung kann in der
erfindungsgemäßen Verwendung
ein Gehäuse
aufweisen, das beispielsweise so ausgebildet ist, daß es in
ein anderes Gefäß wie beispielsweise
ein Zentrifugenröhrchen
eingebracht werden kann.
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Darüberhinaus
können
in der erfindungsgemäßen Verwendung
beliebig viele Adsorbervorrichtungen der vorgenannten Art nebeneinander
angeordnet sein, beispielsweise in Form einer Mehrfach-Mikrotiterplatte.
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Die
Figuren zeigen:
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1 zeigt
eine rasterelektronische Aufnahme von in Beispiel 10 verwendeten
Siliciumdioxidteilchen, welche beispielsweise als Adsorbensteilchen
in der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran
eingesetzt werden können.
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2 zeigt
eine rasterelektronische Aufnahme eines Querschnitts durch eine
erfindungsgemäße Adsorptionsmembran.
Diese weist eine symmetrische Porenstruktur auf, wobei die Adsorbensteilchen über den gesamten
Querschnitt der Membran im wesentlichen gleichmäßig angeordnet sind.
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3 zeigt
eine rasterelektronische Aufsicht einer erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran.
Diese weist keine Haut, sondern eine im wesentlichen homogene Porenstruktur
auf.
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Wie
anhand der 2 und 3 ersichtlich,
wird durch die kontrollierte Phasenumkehrung in dem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Herstellung der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran durch
die gezielte Einstellung des Verhältnisses von Fällungsmittel
und Lösungsmittel
für das
verwendete Polymer vermieden, daß bei Verwendung eines reinen
Fällungsmittels
wie beispielsweise Wasser eine plötzliche Phasenumkehr eintritt,
wodurch sich eine Haut auf der entstehenden Membran bildet, welche
keine oder wenige, sehr kleine Poren aufweist, und eine darunterliegende
asymmetrische Porenstruktur in der entsprechenden Membran ausgebildet
wird. Dementsprechend weist eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellte erfindungsgemäße Adsorptionsmembran
keine Haut auf (siehe 3) und besitzt zudem eine symmetrische
Porenstruktur (siehe 2). Darüberhinaus sind die in den Poren
eingelagerten Adsorbensteilchen über
den gesamten Querschnitt der erfindungsgemäßen Adsorptionsmembran gleichmäßig angeordnet
und im wesentlichen frei zugänglich,
was eine hohe Trenneffizienz gewährleistet.
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Die 4 bis 6 zeigen
Massenspektren von Ausgangsproben und erfindungsgemäß aufgereinigten
und/oder aufkonzentrierten Proben.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden, nicht-einschränkenden
Beispiele weiter erläutert.
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Beispiele
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Verwendete Abkürzungen:
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- ACN
- Acetonitril
- BCA
- Bicinchoninsäure
- BUDGE
- Butandioldiglycidether
- CDI
- Carboxydiimid
- Cyt c
- Cytochrom c
- FAD
- Flavin-Adenosin-Dinukleotid
- fm
- Femtomol
- HCl
- Salzsaure
- IgG
- Immunglobulin G
- Kpi
- Kaliumphosphat-Puffer
- MALDI
- Matrix Assisted Laser
Desorption Ionisation
- MW
- Molekulargewicht
- NaCl
- Natriumchlorid
- NaCNBH3
- Natriumcyanoborhydrid
- NaOH
- Natriumhydroxid
- PBS
- Phosphate buffered
saline
- pg
- Picogramm
- pm
- Picomol
- SKF
- Schwerkraftfiltration
- TFA
- Trifluoressigsäure
- TOF MS
- Time Of Flight Mass
Spectroscopy
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Es
wurde, soweit nicht anders angegeben, in allen Beispielen entionisiertes
bzw. vollentsalztes Wasser verwendet. Alle Zentrifugationsschritte
wurden, soweit nicht anders angegeben, in einer Zentrifuge K2S der Fa.
Hettich mit einem Ausschwingrotor bei 3000 rpm für 5 min bei 22°C durchgeführt.
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Das
Schütteln
erfolgte, soweit nicht anders angegeben, in allen Beispielen auf
einer Schüttelplattform Typ
DSG 304 der Fa. Heidolph bei ca. 400 rpm bei Umgebungstemperatur.
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Beispiel 1:
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Herstellung von irregulär geformten
Agaroseteilchen
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4
g im Handel erhältliche
Agarose der Fa. SIGMA Deisenhofen, Bestellnummer A-6013, Chargennummer
22K 0081, wurden in 100 ml Wasser suspendiert und im siedenden Wasserbad
gelöst.
Die Lösung
wurde auf einer Stahlplatte zu einer 5 mm dicken Schicht ausgegossen.
Nach dem Abkühlen
und Erstarren wurde die Platte in 4 Teile geteilt. Zu den Teilen
wurde in einer Glasschale 200 ml einer Lösung von 15% BUDGE und 10%
1 N NaOH in Wasser zugegeben und bei Umgebungstemperatur für 5 h mit
50 Umdrehungen geschüttelt. Die
Platten wurden mit fließendem
Leitungswasser für
3 h gewassert, dann in Wasser bei 4°C aufbewahrt. Zum Nachweis der
Stabilisierung der Agarose durch Vernetzung wurden ca. 5 g in einem
Reagenzglas mit 5 ml Wasser 10 min gekocht. Dabei behielt das Stück seine
Form, d. h. die Agarose ging nicht in Lösung.
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Die
Platten wurden in ca. 2 cm große
Stücke
zerteilt und in eine Glasflasche zusammen mit 200 ml Wasser überführt. Die
Stücke
wurden mit einem Homogenisator Marke Ultraturrax der Fa. Janke und
Kunkel Typ T25 bei höchster
Einstellung (ca. 24000 Umdrehungen pro Minute) für 30 min unter Wasserkühlung behandelt.
Das entstandene Gel wurde in 80 ml Falcon Röhrchen gefüllt und in einer Laborzentrifuge
für 5 min bei
Umgebungstemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und
zu den Röhrchen
die gleiche Menge Wassser zugesetzt, das Gel wieder aufgeschlämmt und
bei 1000 rpm für
5 min bei Umgebungstemperatur zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde
noch 2 mal wiederholt. Die gewonnenen Überstände wurden vereinigt, in 10
ml Einmal-Plastikzentrifugenröhrchen
gefüllt
und in einer Laborzentrifuge bei 3000 rpm für 10 min bei Umgebungstemperatur
zentrifugiert. Der Überstand
wurde dekantiert und zu den Sedimenten in den Röhrchen die gleiche Menge Wassser
zugesetzt, das Gel wieder aufgeschlämmt, vereinigt und wie oben
zentrifugiert.
-
Es
wurden so ca. 25 ml Gel erhalten. Die gesamte Prozedur wurde mindestens
dreimal wiederholt und die entstandenen Gele vereinigt. Ein Tropfen
dieses Gels wurde in eine Neubauer Zählkammer gefüllt und
bei 40-facher Vergrößerung unter
dem Mikroskop visuell inspiziert. Es fanden sich überwiegend
Partikel im Größenbereich
von 5 bis 25 μm,
daneben waren einige größere Partikel
vorhanden.
-
Beispiel 2:
-
Herstellung eines CDI-aktivierten Gels
-
10
ml gepacktes sedimentiertes Gel aus Beispiel 1 wurden je zweimal
mit einer 25, 50 und 75%igen Lösung
von Aceton in Wasser behandelt, dann zweimal mit wasserfreiem Aceton
aufgeschlämmt
und nach 5 min zentrifugiert. 1 g Carbonyldiimidazol der Fa. Fluka,
Buchs, Schweiz, Best. Nr. 21860, Chargennr. 36208 1187 (CDI), wurde
in ca. 15 ml Aceton gelöst
und zu dem Gel gegeben. Dieses Gemisch wurde bei RT 1 Stunde bei
400 rpm geschüttelt,
anschließend
zentrifugiert, und noch zweimal mit Aceton gewaschen und zentrifugiert.
Das aktivierte Gel wurde bei 4°C
in wasserfreiem Aceton gelagert.
-
Beispiel 3:
-
Herstellung eines Aldehyd-aktivierten
Gels
-
Ca.
14 g feuchtes sedimentiertes Gel aus Beispiel 1 werden mit 14 ml
Wasser und 0,5 g Na-meta-Perjodat der Fa. Merck Darmstadt, Best.
Nr. 106596, Chargennr. K23404696 726, versetzt und bei Umgebungstemperatur
geschüttelt.
Nach 2 h wurden dem Gel 50 ml Wasser zugesetzt und zentrifugiert.
Der Überstand wurde
dekantiert und dem Gel weitere 65 ml Wasser zugesetzt und das Gel
aufgeschlämmt.
Nach 10 mm wurde abzentrifugiert. Zu 1 ml Schiff's Reagenz der Fa. Merck Darmstadt, Best.
Nr. 109034, Chargennr. 840296703, wurden 0,1 ml des gepackten Gels
gegeben und bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Nach 30 mm
hatte sich das Gel lila gefärbt,
was auf vorhandene Aldehydgruppen hinweist.
-
Beispiel 4:
-
Überführung der
aktivierten Gele in die Gießlösung zur
Herstellung von Polyethersulfon-Membranen
-
Je
3 ml der Gele aus Beispiel 2 und 3 wurden mit 10 ml der Gießlösung versetzt
und bei Umgebungstemperatur für
2 Stunden geschüttelt.
Nach Zentrifugation bei 3000 rpm für 10 min wurde der Überstand
dekantiert und zu dem CDI-aktivierten Gel 50 ml Aceton, zu dem Aldehyd-aktivierten
Gel 50 ml Wasser gegeben. Nach Aufschlämmen und Stehenlassen für 10 min
wurde wie oben zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde weitere 4 mal
wiederholt. Es wurden je eine Lösung
der Proteine Cytochrom c und Ferritin eine Lösung von 10 mg/ml in Wasser
hergestellt. Davon wurden je 0,5 ml in kleine Reagenzgläser vorgelegt.
Dazu wurden jeweils 200 μl gepacktes
Gel aus den Beispielen 2 und 3 gegeben. Gleichzeitig wurden 200 μl Aliquots
der Gele aus Beispiel 2 und 3, die nicht mit Gießlösung behandelt worden waren,
zu den Proteinlösungen
gegeben. Die Mischungen wurden für
17 Stunden bei Umgebungstemperatur stehen gelassen. Danach wurde
abzentrifugiert, mit 2 ml Wasser gewaschen und zentrifugiert. Dieser
Vorgang wurde 4 mal wiederholt. Bei einer visuellen Inspektion der
Farbtiefe der Gele ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen
den Gelen, welche in Kontkt mit der Gießlösung waren, und denen, welche
nicht in Kontakt mit der Gießlösung gewesen
waren. Dementsprechend hat die Gießlösung keinen nachteiligen Effekt
auf die chemische Bindungsfähigkeit
der eingesetzten Gele.
-
Beispiel 5:
-
Kupplung von Proteinen an CDI-aktivierte
Gele
-
Je
2–3 ml
des gepackten Gels aus Beispiel 2 wurde mit 5°C kaltem Wasser unter Zentrifugieren
gewaschen und in Reagenzgläser
gefüllt.
Unmittelbar danach wurden 3 bis 5 ml der folgenden Substanzen in einer
Konzentration von je 10 mg/ml in Was ser zugesetzt: Cyt c, Best.
Nr. C-2506, Chargennr. 110K7049, und FAD, Best. Nr. F-6625, Chargennr.
30K0628, beide von der Fa. SIGMA Deisenhofen, und Ferritin der Fa.
SERVA Heidelberg, Best. Nr. 21318, Control D. Die Gemische wurden
bei Umgebungstemperatur für
17 Stunden geschüttelt.
Die Gele werden 3 mal mit Wasser gewaschen und. zentrifugiert. Anschließend wurde
4 mal mit einer Lösung
von 1 M NaCl in 0,01 M Kpi, pH 7,0 gewaschen. Die Überstände waren
dann ungefärbt.
Dagegen zeigte sich eine deutliche Anfärbung der Gele durch das chemisch
gebundene Cyt c, FAD und Ferritin.
-
Beispiel 6:
-
Kupplung von Protein A an Aldehyd-aktivierte
Gele
-
Zu
25 ml Aldehyd-aktiviertem Gel aus Beispiel 3 wurden 100 mg Protein
A der Fa. RepliGen, Charge RNO20759, gelöst in 2 ml PBS und 8 ml 1 M
Kpi pH = 8,0, gegeben und das Gemisch 3 h bei RT geschüttelt. Dann
wurden die Überstände 15 min
abzentrifugiert, das Gel mit 1 M NaCl in 10 mM Kpi pH = 7,0 gewaschen, 30
mg NaCNBH3 zugegeben und 10 min geschüttelt. Danach
wurde das Gel in je 25 ml der folgenden Lösungen für 5 min geschüttelt.
1
M NaCl in 10 mM Kpi pH 7;
1 mM HCl in vollentsalztem bzw. entionisiertem
Wasser (VE-Wasser);
1 M NaCl in 10 mM Kpi pH 7;
100 mM
Glycin/HCl pH 2,8;
1 M NaCl in 10 mM Kpi pH 7;
1 mM NaOH
in VE-Wasser; 1 M NaCl in 10 mM Kpi pH 7.
-
Zwischen
jeder Behandlung wurde 15 min abzentrifugiert. Das Gel wurde danach
bei 4°C
in 1 M NaCl gelagert.
-
Nachweis der Kupplung von Protein A am
Gel und Nachweis der Bindung von IgG am gekuppelten Protein A:
-
BOA-Test:
-
Ca.
50 mg sedimentiertes Gel wurden in ein Reagenzglas eingewogen und
mit 2 ml BCA-Reagenz der Fa. PIERCE Chemicals Rockford III. USA
für 1 h
bei Umgebungstemperatur geschüttelt.
Dabei entsteht durch die Reduktion der im Reagenz enthaltenen Kupferionen
zusammen mit der Bicinchoninsäure
ein gefärbter Komplex,
dessen Intensität
der vorhandenen Proteinmenge proportional ist. Das Gel wurde nach
einer Reaktionszeit von 60 min für
10 min zentrifugiert und der Überstand
bei einer Wellenlänge
von E 562 nm in einem Spektralphotometer vermessen. Anhand einer
Standardlösung
von Protein A in PBS mit bekannter Konzentration wurde die ursprünglich auf
dem Gel befindliche Menge Protein bestimmt.
-
Bindung von IgG:
-
1
g sedimentiertes Gel wurde 2 mal mit 2 ml PBS gewaschen, mit 2 ml
humanem Plasma, welches 1:20 mit PBS verdünnt worden war, ca. 25 min
geschüttelt,
danach wurde 4 mal mit 2 ml PBS gewaschen und dann das gebundene
IgG mit 2 ml einer Lösung
von 0,1 M Glycin/HCl pH = 2,8 für
15 min eluiert, der Überstand wurde
in einem Spektralphotometer bei 280 nm gegen das Elutionsmittel
vermessen. Dabei erzeugt eine Lösung
von 1 mg/ml IgG eine Extinktion bei 280 nm von 1,1 bei 1 cm Schichtdicke.
-
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst: Tabelle 1: Kupplungseffizienz für Protein
A und Bindungskapazität
für IgG
des erfindungsgemäßen Gels
aus Beispiel 6.
| Probe Gel | BOA-Test | Bindung
IgG |
| E
592 nm | μg/ml Gel | ml | E
280 nm | μg/ml Gel |
| Einwaage
52,4
mg | 0,311 | 533 | 1,8 | 0,208 | 340 |
-
Beispiel 7:
-
Überführung eines
Aldehyd-aktivierten Gels in eine nichtwässrige Phase
-
25
ml Gel aus Beispiel 6 wurden 15 min zentrifugiert und mit PBS für 5 min
gewaschen. Das Gel wurde zentrifugiert und mit 25 ml 25% 2-Pyrrolidon
in PBS für
15 min geschüttelt,
zentrifugiert und mit 50% 2-Pyrrolidon in PBS für 15 min geschüttelt, zentrifugiert
und mit 100% 2-Pyrrolidon für
15 min geschüttelt
und zentrifugiert. Dieser letzte Schritt wurde wiederholt, das Gel
wurde bei 4°C
gelagert.
-
Beispiel 8:
-
Herstellung einer mit Protein A gekuppelte
Agarose als Füllstoff
enthaltenden mikroporösen
Polyethersulfon-Membran
-
Es
wurde eine Gießlösung folgender
Zusammensetzung hergestellt: 81,8% 2-Pyrrolidon, 11,5% Polyethersulfon E6020,
4,7% Wasser und 2% Glycerin (86,5%) wurden bei 50°C für 8 h unter
Rühren
gelöst.
Es wurde eine Mischung aus 90% dieser Lösung und 10% der Protein A
umgesetzten Agarose aus Beispiel 6 bei 30°C 30 min mit einem Propellerrührer bei
600 rpm hergestellt. Desweiteren wurde diese Gießlösung für 24 Stunden in einem Vakuum
von 150 mbar entgast. Diese entgaste Gießlösung wurde in einem wässrigen
Fällbad
zu einer mikroporösen
Membran mit einer Dicke von 150 μm
mittels einer Ziehvorrichtung geformt. Nach Erhalt von ca. 1000
cm2 einer mikroporösen Struktur wurde das Membranstück mit PBS
gewaschen und bei 4°C
in PBS gelagert.
-
Beispiel 9:
-
Bindung von IgG an einer erfindungsgemäßen, Füllstoff
enthaltenden Membran
-
6
Filterronden aus Beispiel 8 mit 25 mm Durchmesser wurden in einen
Filtrationsvor satz Best. Nr. 16517 der Fa. Sartorius (hier mit PCV
bezeichnet) eingebaut und die folgenden Lösungen mittels einer aufgesteckten
10 ml Einweg-Spritze durch Schwerkraftfiltration (hier mit SKF abgekürzt) durch
die Membranen filtriert: 10 ml 1 × PBS; 10 ml humanes Plasma
1:20 in PBS verdünnt;
10 ml PBS.
-
Das
gebundene IgG wurde mit 3 ml einer Lösung von 0,1 M Glycin/HCl pH
= 2,8 eluiert.
-
10
cm2 bzw. 20 cm2 der
Membran aus Beispiel 8 wurden in einer Petrischale mit jeweils 10
ml der folgenden Lösungen
für die
angegebenen Zeiten geschüttelt:
15 min mit 10 ml PBS; 1,5 h mit 10 ml humanem Plasma 1:20 in PBS,
2 mal 15 min mit 10 ml PBS. Die Elution erfolgte durch Schütteln für 2 h in
3 ml 0,1 M Glycin/HCl pH = 2,8.
-
Diese
Versuchsanordnung wird im weiteren als Schütteltest bezeichnet.
-
Die Überstände aus
beiden Versuchen wurden in einem Spektralphotometer bei 280 nm gegen
das Elutionsmittel vermessen. Dabei erzeugt eine Lösung von
1 mg/ml IgG eine Extinktion bei 280 nm von 1,1 bei 1 cm Schichtdicke.
-
Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2
| Probe | Bindung
IgG |
| ml | E
280 nm | μg/cm2 |
| SKF
in PCV | 2,9 | 0,129 | 18 |
| 6-lagig
18,6
cm2 | 4 | 0,095 | 19 |
| Schütteltest
10
cm2 | 3 | 0,031 | 9 |
| Schütteltest
20
cm2 | 3 | 0,033 | 5 |
-
Die
Ergebnisse zeigen eine Bindung von IgG an die erfindungsgemäße Membran.
-
Beispiel 10:
-
Herstellung einer mit hydrophoben Liganden
beladenen, Silica-Partikel als Füllstoff
enthaltenden mikroporösen
Polyethersulfon-Membran
-
Es
wurde eine Gießlösung folgender
Zusammensetzung hergestellt: 81,8% 2-Pyrrolidon, 11,5% Polyethersulfon E6020,
4,7% Wasser und 2% Glycerin (86,5%) wurden bei 50°C für 8 h unter
Rühren
gelöst.
Es wurde eine Mischung aus 90% dieser Lösung und 10% eines mit C18-Liganden versehenen Kieselsäurematerials
der Fa. Merck Darmstadt, Best. Nr.: 1.116177, Charge 1448077 234,
bei 30°C
30 min mit einem Propellerrührer
bei 600 rpm hergestellt. Des weiteren wurde diese Gießlösung für 24 Stunden
in einem Vakuum von 150 mbar entgast. Diese entgaste Gießlösung wurde
in einem wässrigen
Fällbad
zu einer mikroporösen
Membran mit einer Dicke von 150 μm
mittels einer Ziehvorrichtung geformt. Nach Erhalt von ca. 1000
cm2 einer mikroporösen Struktur wurde das Membranstück mit PBS
gewaschen und bei 4°C
in PBS gelagert.
-
Beispiel 11:
-
Herstellung von Zentrifugaleinheiten mit
der erfindungsgemäßen Membran
aus Beispiel 10
-
In
Zentrifugaleinheiten, welche als Versuchsprodukte unter der Bezeichnung
Microspin Columns von der Fa. Vivascience AG, Hannover entwickelt
werden, wurden Filterronden mit 3 mm Durchmesser einer erfindungsgemäßen Membran
aus Beispiel 10 eingebaut und durch einen passenden Einsatz gesichert.
Die Einheiten hatten eine effektive Filterfläche von 3,1 mm2.
Die Einheiten werden im weiteren RP-18 Microspins genannt.
-
Beispiel 12
-
Aufkonzentrierung von bioaktiven Peptiden
mit RP-18 Microspins
-
Folgende
bioaktive Peptide wurden von der Fa. SIGMA Deisenhofen bezogen:
Bradykinin
Fragment 1–7,
Best. Nr. B-1651, Ch. 41K13641
Angiotensin II Fragment 1–7, Best.
Nr. A-9202, Ch. 21 K5122
Angiotensin II, Best. Nr. A-9525,
Ch. 31K51144
-
Sie
sind tabellarisch in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Molekulargewichte und verwendete
Mengen der verwendeten bioaktiven Peptide.
| Bezeichnung | MW | Gesam | tmenge | 1:10 | |
| Bradykinin
Fragment
1–7 | 757
Da* | 12
pg | 16
pmol | 1.2
pg | 1.6
pmol |
| Angiotensin
II
Fragment 1–7 | 899
Da | 9
pg | 10
pmol | 0.9
pg | 1.0
pmol |
| Angiotensin
II | 1046
Da | 10
pg | 10
pmol | 1.0
pg | 1.0
pmol |
-
Eine
Lösung
von Bradykinin Fragment 1–7
(1600 fmol/μl),
Angiotensin II Fragment 1–7
(1000 fmol/μl) und
Angiotensin 11 (1000 fmol/μl)
in 0,1% TFA in entionisiertem Wasser wurde angesetzt, hier unverdünnte Ausgangslösung genannt.
Weiterhin wurde eine 1:10 Verdünnung
der obigen Lösung
der Peptide in 0,1% TFA hergestellt, hier 1:10 verdünnte Ausgangslösung genannt.
Diese beiden Gemische stellten die Ausgangslösungen für die nachfolgenden Versuche
dar. 2 μl
dieser Lösungen
wurden auf das MALDI Target pipettiert und bei Umgebungstemperatur
getrocknet (Dried Droplet Method).
-
In
RP-18 Microspins wurden 100 μl
100% Acetonitril pipettiert und die eingebaute Membranen durch Zentrifugation
für 1 Minute
bei 2000 rpm gewaschen. Der Durch lauf wurde verworfen.
-
Die
Membranen wurde mit 100 μl
0,1% wässrigen
TFA Lösung
durch Zentrifugation für
1 Minute bei 2000 rpm equilibriert. Der Durchlauf wurde verworfen
und der Schritt wiederholt.
-
Je
10 μl der
unverdünnten
Ausganglösung
und der 1:10 verdünnten
Ausgangslösung
wurden direkt auf die Membranen pipettiert und 1 Minute bei 2000
rpm zentrifugiert. Der Durchlauf wurde auf das MALDI Target pipettiert
und 5 Minuten bei Umgebungstemperatur getrocknet.
-
Die
Membranen wurde mit 20 μl
0,1% TFA durch Zentrifugation für
1 Minute bei 2000 rpm gewaschen. Der Durchlauf wurde verworfen und
der Schritt wiederholt. Anschließend wurden die Membranen durch
Zentrifugation bei 13000 rpm für
1 min getrocknet. Je 4 μl
eine Lösung
von 10 mg/ml α-Cyan-4-Hydroxyzimtsäure in 50%
ACN und 0.1% TFA wurden auf die Membran pipettiert und anschließend für 1 min
bei 2000 rpm und anschließend
1 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Dadurch wurden die von der Membran
zurückgehaltenen
Peptide entsalzt, aufkonzentriert und eluiert.
-
Folgende
Proben wurde auf MALDI Targets pipettiert und 5 Minuten bei Umgebungstemperatur
getrocknet:
- 1 Die unverdünnte Ausgangslösung (2 μl)
- 2 Die 1:10 verdünnte
Ausgangslösung
(2 μl)
- 3 Der Durchlauf der Beladung der unverdünnten Ausgangslösung (2 μl)
- 4 Das gesamte Eluat der unverdünnten Ausgangslösung (4 μl)
- 5 Das gesamte Eluat der 1:10 verdünnten Ausgangslösung (4 μl)
-
Die
Proben wurden anschließend
mit einem Analytical III MALDI TOF MS Gerät der Fa. Kratos/Shimadzu vermessen.
Die Bedienung solcher Geräte
ist dem Fachmann bekannt und stellt somit den Stand der Technik
dar.
-
Die
erhaltenen Spektren sind in den 4 bis 6 gezeigt.
-
Dabei
zeigt 4 das Spektrum der unverdünnten Ausgangslösung. Die
Signale sind den folgenden Peptiden zuzuordnen: Bradykinin Fragment
1–7 =
756 m/z, Angiotensin II Fragment 1–7 = 898 m/z und Angiotensin
II = 1045 m/z.
-
Mit
der 1:10 verdünnten
Ausgangslösung
konnten keine Signale detektiert und damit kein auswertbares Spektrum
erhalten werden.
-
5 zeigt
das Spektrum der bioaktiven Peptide nach Konzentrierung und Entsalzung
durch RP-18 Microspins der Fa. Vivascience AG nach der Flution.
Die drei eingesetzen Peptide können
auf Grund ihrer Massenzahl eindeutig identifiziert werden. Im Durchlauf
konnten keine Peptide nachgewiesen werden. Dementsprechend wurde
die Gesamtheit der angebotenen Menge an bioaktiven Peptiden von
der Membran zurückgehalten.
-
6 zeigt
das Spektrum der bioaktiven Peptide der 1:10 verdünnten Ausgangslösung nach
Konzentrierung und Entsalzung durch RP-18 Microspins der Fa. Vivascience
AG nach der Flution. Die drei eingesetzen Peptide können im
Gegensatz zur direkten Analyse der entsprechenden Ausgangslösung, wie
vorstehend beschrieben, aufgrund ihrer Massenzahl eindeutig identifiziert
werden. Im Durchlauf konnten keine Peptide nachgewiesen werden.
Dementsprechend wurde die Gesamtheit der angebotenen Menge an bioaktiven
Peptiden von der Membran zurückgehalten.
-
Es
konnte somit gezeigt werden, dass mit Hilfe der Probenvorbereitung
mit RP-18 Microspins bioaktive Peptide konzentriert werden können. Diese
waren im Gegensatz zur direkten MALDI Analyse der 1:10 verdünnten Ausgangslösung nach
Behandlung mit den RP-18 Microspins erfolgreich detektierbar.