DD283155A5 - Verfahren zur herstellung des mykotoxins alternariolmonomethylether (ame) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Mykotoxins Alternariolmonomethylether mit Hilfe eines geeigneten Alternaria alternata-Stammes. Alternariolmonomethylether wird als Standardsubstanz fuer analytische und toxikologische Untersuchungen in Einrichtungen der Human- und Veterinaermedizin, der Landwirtschaft und der Nahrungsgueterindustrie genutzt. Es ist das Ziel des Verfahrens, Alternariolmonomethylether in hohen Ausbeuten durch die Kultivierung von Alternaria alternata IFP/A 380 und in hoher Reinheit zu isolieren. Es werden die Kultivierung des Alternaria-Stammes auf einem Reismedium sowie eine effektive chromatografische Reinigung des Mykotoxins beschrieben.{Mykotoxin; Alternariolmonomethylether; mikrobiologisches Verfahren; Alternaria alternata IFP/A 380; Kultivierung; Reismedium; chromatografische Reinigung; Ausbeute; Reinheit; Standardsubstanz; Analytik; Toxikologie}

Description

Charakteristik des bekannten Standes der Tc shnlk

Für das die Erfindung betreffende mikrobiologische Verfahren unter Verwendung des hinterlegten Alternaria-Stammes konnten keine technischen Lösungen ermiUelt werden. In der Fachliteratur (SCHADE, J.E., und KING, A. D.: J. Food Prot.47 [1984], 978-995) werden der Nachweis vo» Alternariolmonomethylether mit den üblichen chemischen Extraktions- und Reinigungsverfahren sowie eine Isolierung von Alternariolmonomethylether mittels nicht näher charakterisierter Alternaria-Stämme und ohne Angabe über AusLeute und Reinheit des isolierten Mykotoxins beschrieben.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein mikrobiologisches Verfahren für die Herstellung des Mykotoxins AME mittels Alternaria alternata IFP/A380 in hoher Ausbeute und Reinheit zu schaffen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mit Hilfe eines hochproduktiven Alternaria aIu :nata-Stammes das Mykotoxin AME herzusteilen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Pilzstamm Alternaria alternata IFP/A380 auf angefeuchtetem Reis bei 25⁰C 28 Tage bei strenger Dunkelheit kultiviert wird. Die Isolation von AME erfolgt durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel wie Met'ianol oder Chloroform. Der Rohextrakt wird anschließend säulenchromatografisch an Kieselgel gereinigt. AME kristallisiert aus Toluol/Tetrahydrofuran aus, wird umkristallisiert und liegt in Form farbloser Nadeln vor.

Die notwendige Reinheit als Standardsubstanz von S99% wird am Hochdruck-Flüssigkeitschromatografen überprüft.

Die Ausbeute an AME mit einer Reinheit vc.nrt99% beträgt 340-450mg/kg Substrat.

Das nach dem beschriebenen Verfahrer, gewonnene Alternariolmonomethylether der Formel

OCH₃

ist durch folgende physikalisch-chemische Daten charakterisiert:

a) Molekulargewicht: 272

b) Aussehen: farblose Nadeln

c) Schmelzpunkt: 268°C-271⁰C(dec)

d) Löslichkeit: unlöslich in Wasser

schlecht löslich in Benzene, Hexan

gut löslich in Aceton, Methanol, Tetrahydrofuran

e) UV-VIS-Spektrum A_max nm: 335-342,301,290,257,230 (Methanol): e(Ethylacetat): 46774

f) dünnschichtchromatografische Daten Adsorbent: KieselgJ

Dotektion unter kurz- und langwelligem UV-Licht zeigt AME eine blaue Fluoraszenz

Lösungsmittel: Toluol + Ethylacetat + Ameisensäure -3 + 1 RrWert: 0,66-0,70 Chloroform + Methanol 95 + 5 RrWert: 0,51-0,55

Der zur Produktic η von AME verwendete Alternaria alternata-Stamm IFP/A380 wurde im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jona (ZIMET) unter Bezeichnung IMET 43907 hinterlegt.

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel erläutert werden.

Je 5g Reis werben mit 5ml Leitungswasser angefeuchtet und in lOO-ml-Erlenmeyer'.olben an drei aufeinandorfolgenden Tagen im Dampfloch sterilisiert. Jeder Kolben wird mit einer Sporensuspension einer 7 T'jge alten Einsporkultur von Alternaria alternate IFP/A380, die auf Kortoffel-Dextrose-Agar angezogen wurde, beimpft. Die Kolben werden bei 25°C 28 Tage in völliger Dunkelheit inkubiert und täglich einmal per Hand geschüttelt.

Das Reis-Myzel-Gemisch wird mechanisch zerkleinert und je Kolben mit 50ml Methanol extrahiert und dann abfiltriert. Das Filtrat wird mit dem doppelten Volumen einer 20%igen wäßrigen (NH^jSCVLösung versetzt und zweimal mit Chloroform extrahiert.

Die vereinigton Chloroformextrakte werden über Na₂SO₄ getrocknet und anschließend bis zur Trockne eingeengt.

Für die säulenchromatografische Reinigung wird das verwendete Kieselgel 60 (0,063-0,2rnm) mit Oxalsäure präpariert (5g Oxalsäure/95g Kieseigel). 500-1000mg Rohextrakt werdon an 20g aktiviertem Kieselgel in einer 300mm χ 23mm Säule gereinigt. Als Elutionsmittel wird ein Stufengradient von Toluol + Tetrahydrofuran von 95 + 5 über 85 + 15,50 + 50zu0 + 100 zu je 100 ml eingesetzt. Es werden Fraktionen zu je 15ml gesammelt und dünnschichtchromatografisch auf AME untersucht.

AME kristallisiert in Toluol + Tetrahydrofuran 95 + 5 bei 4°C als farblose Nadeln aus und wird aus demselben Lösungsmittelgemisch umkristallisiert.

Der Schmelzpunkt wurde bei 268°C-269°C (dec) bestimmt, der Reinheitsgrad wird hochdruckflüssigkeitschromatografisch bei einer Wellenlänge yon 340 nm ermittelt.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung des Mykotoxins Alternariolmonomethylether, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Alternarh alternata IFP/A 380 auf einem festen Nährmedium, bestehend aus Reis und Wasser, bei 25⁰C und ii völliger Dunkelheit während eines Zeitraumes von 28 Tagen kultiviert, dabei täglich einmal geschüttelt wird und das gebildete Mykotoxin Alternariolmonomethylether aus dem Reis-Myzel-Gemisch extrahiert, nachfolgend mit den üblichen Methoden konzentriert, säulenchromografisch gereinigt und auskristallisiert wird.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahr ι zur Herstellung des Mykotoxins AME, das als Standardsubstanz für analytische Untersuchungen mykotoxinverdächtiger Nahrungs- und Futtermittel und für toxikologische Untersuchungen benötigt wird.