DE3527335A1 - Verfahren zur mikrobiellen hydroxylierung von forskolin und seinen derivaten durch mortierella-staemme - Google Patents

Verfahren zur mikrobiellen hydroxylierung von forskolin und seinen derivaten durch mortierella-staemme

Info

Publication number
DE3527335A1
DE3527335A1 DE19853527335 DE3527335A DE3527335A1 DE 3527335 A1 DE3527335 A1 DE 3527335A1 DE 19853527335 DE19853527335 DE 19853527335 DE 3527335 A DE3527335 A DE 3527335A DE 3527335 A1 DE3527335 A1 DE 3527335A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
forskolin
mortierella
hydrogen
ddf
derivatives
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19853527335
Other languages
English (en)
Inventor
Werner Dr Aretz
Dirk Dr Boettger
Klaus Dr Sauber
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Priority to DE19853527335 priority Critical patent/DE3527335A1/de
Publication of DE3527335A1 publication Critical patent/DE3527335A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/92—Naphthopyrans; Hydrogenated naphthopyrans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Forskolin-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung mittels mikrobieller Umwandlung durch Mortierella-Stämme und die Verwendung der Substanzen als pharmazeutische Mittel, insbesondere als Medikamente zur Behandlung von Glaukom, Herzinsuffizienz, Hypertonie, Entzündung, Allergien, Bronchialerkrankungen und Erkrankungen des Immunsystems.
Forskolin und seine natürlich vorkommenden Analoge stellen eine Gruppe von Labdan-Terpenoiden dar, die aus der Pflanze Coleus forskolii (Briqu.) isoliert werden. Die Strukturformel von Forskolin und seinen natürlich vorkommenden, isolierten Analogen werden in der Formel I dargestellt.
Für Forskolin ist R1, R2 = OH, R′ = Ac, sowie R3 bis R7 und R″ = H
Bis heute sind folgende natürlich vorkommenden Forskolin- Analoge nachgewiesen worden:
1,9-Didesoxy-forskolin: R′ = Ac, sowie R1 bis R7 und R″ = H
9-Desoxy-forskolin: R1 = OH, R′ = Ac, sowie R2 bis R7 und R″ = H
1,9-Didesoxy-7-deacetyl-forskolin: R′, R″ und R1 bis R7 = H
1-Desoxy-forskolin: R2 = OH, R′ = Ac, sowie R′ und R1, R3 bis R7 = H
7-Deacetyl-forskolin: R1, R2 = OH, R′, R″, sowie R3 bis R7 = H
6-Acetyl-7-deacetyl-forskolin: R1 = OH, R″ = Ac, sowie R′ und R2 bis R7 = H
(Tetrahedron Lett. 19, 1669 (1977); J. Med. Chem. 26, 486 (1983)).
Forskolin ist eines der wichtigen Diterpene der Pflanze Coleus forskolii. Diese Substanz und seine Derivate können verwendet werden als wertvolle Arzneimittel bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen wie Glaukom, Hypertonie, Herzinsuffizienz, Entzündung, Allergien, Bronchokonstriktion und ganz allgemein von Erkrankungen, die durch Störungen der cAMP-Produktion und -Metabolismus hervorgerufen werden (Indisches Patent Nr. 1 43 875 und entsprechendes DE-OS 25 57 784, Indisches Patent Nr. 1 45 926, Indisches Patent Nr. 1 47 630 und entsprechende DE-OS 26 40 275; Med.Res. Revs. 3, 201-19 (1983)).
Ein Verfahren zur Isolierung des Hauptanteils von Forskolin aus Coleus forskohlii ist bereits beschrieben (s. Indische Patente Nr. 1 43 875 und 1 45 926, DE-OS 25 57 784). Bei diesem Verfahren werden außerdem Forskolin-Analoge gewonnen. Diese Analoge können verwendet werden als Zwischenprodukte zur Herstellung von Forskolin. Es sind bereits Methoden beschrieben worden, durch die die Analoge mit gleicher Oxidationsstufe wie Forskolin, z. B. 7-Deacetyl-Forskolin und 6-Acetyl-7-deacetylforskolin in Forskolin umgewandelt werden können (Indisches Patent 1 47 007, J.Chem. Perk. Trans. 1, 767 (1982)).
Es ist bereits ein Verfahren der mikrobiellen Umwandlung beschrieben worden, durch das die weniger hydroxylierten Forskolin-Analoge in Forskolin, 7-Deacetyl-Forskolin oder 6-Acetyl-7-deacetylforskolin, oder in solche Derivate umgewandelt werden, die sich durch bekannte chemische Methoden leicht in Forskolin umwandeln lassen (Deutsche Patentanmeldung P 35 02 685.5).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun ein Verfahren zur Hydroxylierung bzw. Oxidation von Labdan-Terpenoiden der Formel I worin R1 und R3 bis R7 Wasserstoff, R2 Wasserstoff oder Hydroxy, R′ die Acetylgruppe oder Wasserstoff und R′ Wasserstoff bedeuten, durch Mortierella-Stämme, insbesondere Mortierella alpina ATCC 8979, Mortierella alpina Peyron CBS 52872 und Mortierella isabellina ATCC 16007.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel I, worin R1 bis R7, R′ und R″ die oben genannten Bedeutungen haben, in einem üblichen Nährmedium definierter Zusammensetzung, das einen der genannten Mikroorganismen-Stämme enthält, fermentiert. Die Fermentation erfolgt mehrere Tage, bevorzugt 5 Tage lang bei einer Temperatur von 25-30°C, bevorzugt bei 28°C unter Schütteln.
Das Nährmedium enthält Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, gegebenenfalls auch anorganische Nährsalze sowie Spurenelemente.
Als Kohlenstoffquelle eignen sich z. B. Glucose, Stärke, Dextrin und Glycerin. Geeignete Stickstoffquellen sind z. B. Sojamehl, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Pepton und Casein. Als anorganische Nährsalze kommen z. B. Natriumchlorid, Magnesiumsulfat oder Calciumcarbonat, als Spurenelemente z. B. Eisen, Magnesium, Kupfer, Zink und Kobalt in Form geeigneter Salze in Frage.
Nach Abschluß der Umsetzung wird das Pilzmycel abfiltriert und das resultierende Kulturfiltrat mit organischen Lösungsmitteln wie Dichlormethan, Chloroform oder Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird zweckmäßig über Trocknungsmitteln wie Na2SO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird dann durch Trennungsverfahren wie beispielsweise Chromatographie und durch Kristallisation gereinigt.
Die hydroxylierung erfolgt bevorzugt in 1, 2, 3 und/oder 12-Stellung, die Oxidation zur Ketogruppe in 3-Stellung.
Allgemeine Verfahrensbeschreibung:
a) Stammhaltung und Anzucht
Sporensuspensionen der obengenannten Stämme werden auf Schrägröhrchen mit folgendem Nährmedium beimpft und 14 Tage bei 30°C bebrütet:
Stammhaltungsmedium:
Haferflocken 40 g/l
Agar 20 g/l
pH 7,2
Zur Anzucht in Flüssigkulturen werden von dem Stamm Sporensuspensionen durch Abschwemmen der Schrägröhrchen mit steriler NaCl 0,8% gewonnen und diese auf einen Titer von 2 × 107 Sporen/ml verdünnt. 1 ml dieser Suspension dienen als Inokulum von 50 ml Hauptkultur (in 100 ml Erlenmeyer-Kolben) folgender Zusammensetzung:
Glucose 10 g/l
Pepton 10 g/l
Hefeextrakt 2 g/l
Cornsteep fl. 2 ml
pH 5,5
Nach 24 Stunden bei 28°C und einer Schüttelfrequenz von 190 Upm erzielt man ein dichtes, mycelartiges Wachstum.
b) Biotransformation
Zur Biotransformation werden die 50 ml Hauptkultur in einen sterilen 300 ml-Erlenmeyer-Kolben überführt und 16 mg Substrat (in Methanol gelöst) zugesetzt. Anschließend wird die Suspension bei 28°C und 240 Upm 5 Tage geschüttelt. Der Fortgang der Biotransformation wird mittels DC (HPTLC- Platten, Methylenchlorid-Ethylacetat 3 : 1; Anis- aldehyd-Schwefelsäure als Nachweisreagenz) verfolgt. Nach Abschluß der Umsetzung wird das Pilzmycel abfiltriert, das resultierende Kulturfiltrat mit der gleichen Menge Dichlormethan extrahiert und der Extrakt im Vakuum eingedampft.
c) Transformationsprodukte (Strukturen siehe Tabelle 1)
I  1,9-Didesoxyforskolin (1) → 1α-HO-DDF (5) = 9-Desoxyforskolin)
(DDF)
→ 2α-HO DDF-(8)
→ 2β-HO-DDF (6)
→ 3β-HO-DDF (7)
→ 3-Keto-DDF (4)
→ 12-HO-DDF (14)
(→ 4-Hydroxymethyl-DDF)
II  1-Desoxyforskolin (3) → Forskolin (2)
III  7-dAc-DDF → 7-dAc-3β-HO-DDF
Eine Umlagerung der Acetylgruppe von C-7 nach C-6 kann für alle Forskolinanaloge durch Anheben der pH-Wertes über 6,5 erreicht werden.
Umsetzungsbeispiele mit Mortierella isabellina ATCC 16007
Beispiel 1
I Biotransformation von DDF Durchführung gemäß 1 b) 120 Std. Die Bildung von 3-Keto-DDF kann durch Konstanthalten der Glucosekonzentration bei 2% unterdrückt werden.
Beispiel 2
Eine nach Beispiel 1 durchgeführte Biotransformation von DDF ergab nach Extraktion 150 mg Substanz. Über eine Vorsäule von geringem Volumen wurde an 15 g Kieselgel (Merck, 15-40 µm; Labomatic-Säule) mit dem System Petrolether/Ethylacetat = 2/1 bei einem Fluß von 1,5 ml/min chromatographiert. Neben der eingesetzten Ausgangsverbindung wurden 6,6 mg M1, 5,2 mg M2, 16 mg 3-β-Hydroxy-DDF, 2 mg M4 und einige kleinere Substanzmengen erhalten (M5, M1.2).
Eine Nachreinigung über präparative DC liefert 1,5 mg reines M1, 2 mg M2, 1,5 mg M4, 1,5 mg M5 und 1 mg M1.2.
Die Rf-Werte auf Kieselgel-Methylenchlorid/Ethylacetat (2 / 1) sind:
M1  (0.77)
M1.2  (0.64)
M2  (0.47)
3β-OH-DDF (0.43)
M4  (0.3)
M5  (0.21)
Die Substanzen wurden einer 1H-NMR-Analyse unterzogen.
Durch authentische Vergleichssubstanzen konnten folgende Verbindungen zugeordnet werden:
M1.2 = 1α-HO-DDF L 772584
M2 = 2β-HO-DDF L 847598
M3.1 = 2α-HO-DDF L 847597
M1 wurde anhand des 1H-NMR- und Massenspektrums charakterisiert. Bei der Substanz handelt es sich um:
1,9-Didesoxy-3-keto-forskolin
1H-NMR (270 MHz, CDCl3, TMS) δ = 5.95 (dd, J = 18 Hz, J′ = 12 Hz; 14-H), 5.28 (d, J = 18 Hz; 15 t-H), 5.09 (d, J = 6 Hz; 7-H), 5.06 (d, J = 12 Hz; 15 c-H), 4.28 (m; 6α-H), 2.95-2.70 (m; COCH 2 und s; 9 α-H), 2.66 (AB, J = 18 Hz; 12-H), 2.29 (m; 5α-H), 2.22 (s; CH 3CO), 1.90-0.82 (m; 17 H darin: 1.62, 1.58, 1.41, 1.23 und 1.17, 5s; 5 CH 3).
MS m/z = 392 (M⁺), 377 (M⁺-CH3), 359 (M⁺-CH3-H2O), 332 (M⁺-AcOH), 317 (M⁺-CH3-AcOH), 249,95.

Claims (8)

1. Verfahren zur mikrobiellen Hydroxylierung oder Oxidation von Labdan-Terpenoiden der Formel I worin R1 und R3 bis R7 Wasserstoff, R2 Wasserstoff oder Hydroxy, R′ die Acetylgruppe oder Wasserstoff und R″ Wasserstoff bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man auf eine der genannten Verbindungen der Formel I als Substrat in einem üblichen Nährmedium einen Mikroorganismus- Stamm vom Genus Mortierella einwirken läßt und die gebildeten Verbindungen nach Beendigung der Fermentation aus der Kulturbrühe durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel und anschließende Chromatographie und/oder Kristallisation isoliert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Mortierella alpina ATCC 8979, Mortierella alpina Peyron CBS 52 872 oder Mortierella isabellina ATCC 16007 verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation 5 Tage bei 25-30°C unter Schütteln durchführt und das Kulturfiltrat mit Dichlormethan extrahiert.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei 28°C fermentiert.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxylierung in 1-, 2-, 3- und/oder 12-Stellung und die Oxidation in 3-Stellung erfolgt.
6. 1,9-Di-desoxy-3-keto-forskolin.
7. 1,9-Di-desoxy-12-hydroxy-forskolin.
8. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 6 oder 7.
DE19853527335 1985-07-31 1985-07-31 Verfahren zur mikrobiellen hydroxylierung von forskolin und seinen derivaten durch mortierella-staemme Withdrawn DE3527335A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853527335 DE3527335A1 (de) 1985-07-31 1985-07-31 Verfahren zur mikrobiellen hydroxylierung von forskolin und seinen derivaten durch mortierella-staemme

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853527335 DE3527335A1 (de) 1985-07-31 1985-07-31 Verfahren zur mikrobiellen hydroxylierung von forskolin und seinen derivaten durch mortierella-staemme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE3527335A1 true DE3527335A1 (de) 1987-02-05

Family

ID=6277207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19853527335 Withdrawn DE3527335A1 (de) 1985-07-31 1985-07-31 Verfahren zur mikrobiellen hydroxylierung von forskolin und seinen derivaten durch mortierella-staemme

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE3527335A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007046113A2 (en) * 2005-10-18 2007-04-26 Panacea Biotec Ltd. Novel pharmaceutical composition comprising alkaloid and process thereof

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007046113A2 (en) * 2005-10-18 2007-04-26 Panacea Biotec Ltd. Novel pharmaceutical composition comprising alkaloid and process thereof
WO2007046113A3 (en) * 2005-10-18 2007-07-26 Panacea Biotec Ltd Novel pharmaceutical composition comprising alkaloid and process thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60103995T2 (de) Perzychinin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als pharmazeutisches produkt
DE69018529T2 (de) Phospholipase A2-Inhibitor, Mikroorganismen, die diesen Inhibitor erzeugen und mehrere Verfahren zu seiner Herstellung.
DE3006215A1 (de) Verfahren zur herstellung von monacolin k
DE2552871A1 (de) Neue cyclopentendiole und deren acylester und verfahren zu ihrer herstellung
EP0189801B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Forskolinderivaten mittels mikrobieller Umwandlungen
DE4320023A1 (de) Holotyp-Stamm Aspergillus obscurus und Verfahren zur Herstellung von µ,£-Di-(hydroxy)-7-[1,2,6,7,8,8a-hexa-(hydro)-2,6-di-(methyl)-8-(2'-{methyl}-butyryloxy)-naphthalin-1-yl]-heptansäure-£-lacton{Mevinolin} und/oder µ,5-Di-(hydroxy)-7-[1,2,6,7,8,8a-hexa-(hydro)-2,6-di-(methyl)-8-(2'-{mehtyl}-butyryloxy)-naphthalin-1-yl]-heptansäure
EP0318849A2 (de) Manumycin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
EP0196628B1 (de) Ein neues Ansamycin-Antibiotikum, ein mikrobielles Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Arzneimittel
DE3112566C2 (de)
DE3114242A1 (de) Carbonsaeurederivate, verfahren zu ihrer herstellung und diese derivate enthaltende arzneimittel
DE69908569T2 (de) Verfahren zur herstellung von fexofenadin
DE3527335A1 (de) Verfahren zur mikrobiellen hydroxylierung von forskolin und seinen derivaten durch mortierella-staemme
DE3527336A1 (de) Verfahren zur mikrobiellen hydroxylierung von forskolin und seinen derivaten durch neurospora crassa
GB2111989A (en) New compounds having cholesterol-reducing activity
DE2022452A1 (de) Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums
DE2303495C2 (de) Herstellung von Ergosterin und seinen Estern
EP0143403B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Indanyl-Derivaten und deren Verwendung
DE69823866T2 (de) Substanz ft-0554 und verfahren zu ihrer herstellung
DE2921052C2 (de)
DE2450106C2 (de) Neue 1 α-Hydroxysteroide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel
DE3523082A1 (de) Verfahren zur herstellung von 2-(substituylphenyl)-propionsaeure durch mikroorganismen
DE2903997A1 (de) Verfahren zur herstellung von monorden und monordenderivaten
DE4225284A1 (de) Clonostachydiol und Helmidiol, neue Makrodiolide mit pharmakologischer Wirkung, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
DE2425582B2 (de) Verfahren zur herstellung von hydroxycyclopentenonderivaten
DE3526544A1 (de) 3(alpha),14(alpha)-dihydroxy-5ss-cholansaeure und deren derivate

Legal Events

Date Code Title Description
8130 Withdrawal