DD283155A5 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF MYCOTOXIN ALTERNOLIOL MONOMETHYL ETHER (AME) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung des Mykotoxins Alternariolmonomethylether mit Hilfe eines geeigneten Alternaria alternata-Stammes. Alternariolmonomethylether wird als Standardsubstanz fuer analytische und toxikologische Untersuchungen in Einrichtungen der Human- und Veterinaermedizin, der Landwirtschaft und der Nahrungsgueterindustrie genutzt. Es ist das Ziel des Verfahrens, Alternariolmonomethylether in hohen Ausbeuten durch die Kultivierung von Alternaria alternata IFP/A 380 und in hoher Reinheit zu isolieren. Es werden die Kultivierung des Alternaria-Stammes auf einem Reismedium sowie eine effektive chromatografische Reinigung des Mykotoxins beschrieben.{Mykotoxin; Alternariolmonomethylether; mikrobiologisches Verfahren; Alternaria alternata IFP/A 380; Kultivierung; Reismedium; chromatografische Reinigung; Ausbeute; Reinheit; Standardsubstanz; Analytik; Toxikologie}The invention relates to a microbiological process for the production of the mycotoxin Alternariolmonomethylether using a suitable Alternaria alternata strain. Alternariol monomethyl ether is used as a standard substance for analytical and toxicological examinations in human and veterinary medicine, agriculture and the food industry. It is the aim of the process to isolate alternariol monomethyl ether in high yields by cultivating Alternaria alternata IFP / A 380 and in high purity. It describes the cultivation of the Alternaria strain on a rice medium and the effective chromatographic purification of the mycotoxin. {Mycotoxin; Alternariolmonomethylether; microbiological process; Alternaria alternata IFP / A 380; Cultivation; Rice medium; chromatographic purification; Yield; Purity; Standard substance; analytics; Toxicology}

Description

Charakteristik des bekannten Standes der Tc shnlkCharacteristics of the known state of the Tc shnlk

Für das die Erfindung betreffende mikrobiologische Verfahren unter Verwendung des hinterlegten Alternaria-Stammes konnten keine technischen Lösungen ermiUelt werden. In der Fachliteratur (SCHADE, J.E., und KING, A. D.: J. Food Prot.47 [1984], 978-995) werden der Nachweis vo» Alternariolmonomethylether mit den üblichen chemischen Extraktions- und Reinigungsverfahren sowie eine Isolierung von Alternariolmonomethylether mittels nicht näher charakterisierter Alternaria-Stämme und ohne Angabe über AusLeute und Reinheit des isolierten Mykotoxins beschrieben.For the microbiological process of the invention using the deposited Alternaria strain, no technical solutions could be found. In the literature (SCHADE, JE, and KING, AD: J. Food Prot.47 [1984], 978-995), the detection of "alternariol monomethyl ether with the usual chemical extraction and purification methods and isolation of Alternariolmonomethylether by means not further characterized Alternaria strains and without indication of AusLeute and purity of the isolated mycotoxin described.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein mikrobiologisches Verfahren für die Herstellung des Mykotoxins AME mittels Alternaria alternata IFP/A380 in hoher Ausbeute und Reinheit zu schaffen.The invention aims to provide a microbiological process for the production of the mycotoxin AME by means of Alternaria alternata IFP / A380 in high yield and purity.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mit Hilfe eines hochproduktiven Alternaria aIu :nata-Stammes das Mykotoxin AME herzusteilen.The object of the invention is to produce the mycotoxin AME with the aid of a highly productive Alternaria aIu: nata strain.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Pilzstamm Alternaria alternata IFP/A380 auf angefeuchtetem Reis bei 25⁰C 28 Tage bei strenger Dunkelheit kultiviert wird. Die Isolation von AME erfolgt durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel wie Met'ianol oder Chloroform. Der Rohextrakt wird anschließend säulenchromatografisch an Kieselgel gereinigt. AME kristallisiert aus Toluol/Tetrahydrofuran aus, wird umkristallisiert und liegt in Form farbloser Nadeln vor.According to the invention the object is achieved in that the fungus strain Alternaria alternata IFP / A380 is cultured on humidified rice at 25 ⁰ C for 28 days in severe darkness. The isolation of AME is carried out by extraction with a suitable solvent such as met'ianol or chloroform. The crude extract is then purified by column chromatography on silica gel. AME crystallizes from toluene / tetrahydrofuran, is recrystallized and is in the form of colorless needles.

Die notwendige Reinheit als Standardsubstanz von S99% wird am Hochdruck-Flüssigkeitschromatografen überprüft.The necessary purity as a standard substance of S99% is checked on the high-pressure liquid chromatograph.

Die Ausbeute an AME mit einer Reinheit vc.nrt99% beträgt 340-450mg/kg Substrat.The yield of AME with a purity vc.nrt99% is 340-450 mg / kg substrate.

Das nach dem beschriebenen Verfahrer, gewonnene Alternariolmonomethylether der FormelThe according to the described method, obtained Alternariolmonomethylether the formula

OCH₃ OCH ₃

ist durch folgende physikalisch-chemische Daten charakterisiert:is characterized by the following physico-chemical data:

a) Molekulargewicht: 272a) Molecular weight: 272

b) Aussehen: farblose Nadelnb) Appearance: colorless needles

c) Schmelzpunkt: 268°C-271⁰C(dec)c) melting point: 268 ° C-271 ⁰ C (dec)

d) Löslichkeit: unlöslich in Wasserd) Solubility: insoluble in water

schlecht löslich in Benzene, Hexanpoorly soluble in benzene, hexane

gut löslich in Aceton, Methanol, Tetrahydrofuranreadily soluble in acetone, methanol, tetrahydrofuran

e) UV-VIS-Spektrum A_max nm: 335-342,301,290,257,230 (Methanol): e(Ethylacetat): 46774e) UV-Vis spectrum A _max nm: 335-342,301,290,257,230 (methanol): e (ethyl acetate): 46774

f) dünnschichtchromatografische Daten Adsorbent: KieselgJf) Thin-layer chromatographic data Adsorbent: KieselgJ

Dotektion unter kurz- und langwelligem UV-Licht zeigt AME eine blaue FluoraszenzUnder UV and shortwave UV light, AME shows a blue fluorescence

Lösungsmittel: Toluol + Ethylacetat + Ameisensäure -3 + 1 RrWert: 0,66-0,70 Chloroform + Methanol 95 + 5 RrWert: 0,51-0,55Solvent: toluene + ethyl acetate + formic acid -3 + 1 Rr value: 0.66-0.70 chloroform + methanol 95 + 5 Rr value: 0.51-0.55

Der zur Produktic η von AME verwendete Alternaria alternata-Stamm IFP/A380 wurde im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jona (ZIMET) unter Bezeichnung IMET 43907 hinterlegt.The Alternaria alternata strain IFP / A380 used for the product η of AME was deposited in the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy Jonas (ZIMET) under the name IMET 43907.

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel erläutert werden.The invention will be explained below using an exemplary embodiment.

Je 5g Reis werben mit 5ml Leitungswasser angefeuchtet und in lOO-ml-Erlenmeyer'.olben an drei aufeinandorfolgenden Tagen im Dampfloch sterilisiert. Jeder Kolben wird mit einer Sporensuspension einer 7 T'jge alten Einsporkultur von Alternaria alternate IFP/A380, die auf Kortoffel-Dextrose-Agar angezogen wurde, beimpft. Die Kolben werden bei 25°C 28 Tage in völliger Dunkelheit inkubiert und täglich einmal per Hand geschüttelt.Each 5g of rice should be moistened with 5 ml of tap water and sterilized in 100 ml of Erlenmeyer flask in the steam hole on three successive days. Each flask is inoculated with a spore suspension of 7 T'jge old seed culture of Alternaria alternate IFP / A380 grown on potato dextrose agar. The flasks are incubated at 25 ° C for 28 days in complete darkness and shaken once a day by hand.

Das Reis-Myzel-Gemisch wird mechanisch zerkleinert und je Kolben mit 50ml Methanol extrahiert und dann abfiltriert. Das Filtrat wird mit dem doppelten Volumen einer 20%igen wäßrigen (NH^jSCVLösung versetzt und zweimal mit Chloroform extrahiert.The rice-mycelium mixture is mechanically comminuted and extracted per flask with 50 ml of methanol and then filtered off. The filtrate is added with twice the volume of a 20% aqueous solution of (NH 4) 2 SO 3 and extracted twice with chloroform.

Die vereinigton Chloroformextrakte werden über Na₂SO₄ getrocknet und anschließend bis zur Trockne eingeengt.The combined chloroform extracts are dried over Na ₂ SO ₄ and then concentrated to dryness.

Für die säulenchromatografische Reinigung wird das verwendete Kieselgel 60 (0,063-0,2rnm) mit Oxalsäure präpariert (5g Oxalsäure/95g Kieseigel). 500-1000mg Rohextrakt werdon an 20g aktiviertem Kieselgel in einer 300mm χ 23mm Säule gereinigt. Als Elutionsmittel wird ein Stufengradient von Toluol + Tetrahydrofuran von 95 + 5 über 85 + 15,50 + 50zu0 + 100 zu je 100 ml eingesetzt. Es werden Fraktionen zu je 15ml gesammelt und dünnschichtchromatografisch auf AME untersucht.For the column chromatographic purification, the silica gel 60 (0.063-0.2 mmol) used is prepared with oxalic acid (5 g oxalic acid / 95 g silica gel). 500-1000mg crude extract is purified on 20g activated silica in a 300mm χ 23mm column. The eluent used is a step gradient of toluene + tetrahydrofuran of 95 + 5 over 85 + 15.50 + 50zu0 + 100 of 100 ml each. Fractions of 15 ml each are collected and analyzed by thin-layer chromatography for AME.

AME kristallisiert in Toluol + Tetrahydrofuran 95 + 5 bei 4°C als farblose Nadeln aus und wird aus demselben Lösungsmittelgemisch umkristallisiert.AME crystallizes in toluene + tetrahydrofuran 95 + 5 at 4 ° C as colorless needles and is recrystallized from the same solvent mixture.

Der Schmelzpunkt wurde bei 268°C-269°C (dec) bestimmt, der Reinheitsgrad wird hochdruckflüssigkeitschromatografisch bei einer Wellenlänge yon 340 nm ermittelt.The melting point was determined at 268 ° C-269 ° C (dec), the purity is determined by high-pressure liquid chromatography at a wavelength of 340 nm.

Claims (1)

Verfahren zur Herstellung des Mykotoxins Alternariolmonomethylether, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Alternarh alternata IFP/A 380 auf einem festen Nährmedium, bestehend aus Reis und Wasser, bei 25⁰C und ii völliger Dunkelheit während eines Zeitraumes von 28 Tagen kultiviert, dabei täglich einmal geschüttelt wird und das gebildete Mykotoxin Alternariolmonomethylether aus dem Reis-Myzel-Gemisch extrahiert, nachfolgend mit den üblichen Methoden konzentriert, säulenchromografisch gereinigt und auskristallisiert wird.A process for the preparation of the mycotoxin Alternariolmonomethylether, characterized in that the microorganism Alternarh alternata IFP / A 380 cultivated on a solid nutrient medium consisting of rice and water, at 25 ⁰ C and ii complete darkness over a period of 28 days, shaking it once daily and the formed mycotoxin Alternariolmonomethylether extracted from the rice-mycelium mixture, then concentrated by the usual methods, purified by column chromatography and crystallized. Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention Die Erfindung betrifft ein Verfahr ι zur Herstellung des Mykotoxins AME, das als Standardsubstanz für analytische Untersuchungen mykotoxinverdächtiger Nahrungs- und Futtermittel und für toxikologische Untersuchungen benötigt wird.The invention relates to a method for the production of the mycotoxin AME, which is needed as a standard substance for analytical investigations of mycotoxin-suspected food and feed and for toxicological studies.